Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (glycine max l ) bằng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---o0o---

NGƠ THỊ TÚ TRINH

NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TĨC CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.)
BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2018


ii
Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Vũ Phong
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS. Bùi Văn Lệ
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS. TS. Lê Thị Thủy Tiên
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG
TP.HCM ngày 21 tháng 7 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng
2. PGS. TS. Bùi Văn Lệ
3. PGS. TS. Lê Thị Thủy Tiên
4. TS. Võ Đình Lệ Tâm

5. TS. Hồng Anh Hồng
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

GS. TS. PHAN THANH SƠN NAM


iii
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Ngô Thị Tú Trinh

MSHV: 1570260

Ngày tháng năm sinh: 04/02/1988

Nơi sinh: Lâm Đồng

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (Glycine max L.) bằng
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nhiệm vụ: Tạo được rễ tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes phục vụ cho các nghiên cứu chức năng gen và sinh học vùng rễ đậu nành.
Nội dung
- Xác định một số điều kiện thích hợp cho q trình lây nhiễm A. rhizogenes
lên mẫu đậu nành in vitro
- Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyển gen
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 26/2/2018
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/6/2018
IV. HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VŨ PHONG
Tp. Hồ Chí Minh, ngày …. tháng …. năm 2018
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS. NGUYỄN VŨ PHONG

PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TRƯỞNG KHOA

GS. TS. PHAN THANH SƠN NAM


iv

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn Cô PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương - Chủ nhiệm bộ môn
Công nghệ Sinh học, các thầy cô giảng viên bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ
thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa – ĐHQG TP.HCM trong thời gian qua đã
truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em.
Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Phong đã hướng dẫn em trong quá trình
thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn cô Tôn Bảo Linh đã hỗ trợ em trong việc hoàn thành đề
tài nghiên cứu này.
Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ trẻ đã
tạo điều kiện về thời gian cho tơi hồn thành văn bằng thạc sĩ.


v

TÓM TẮT
Chuyển gen ở cây đậu nành (Glycine max L.) thường được thực hiện bằng
phương pháp bắn gen và sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tuy nhiên
hiệu quả của việc chuyển gen bằng hai phương pháp trên phụ thuộc phần lớn vào
khả năng tái sinh và thời gian tạo được cây chuyển gen. Chuyển gen tạo rễ tóc bằng
việc sử dụng Agrobacterium rhizogenes khắc phục những hạn chế trên và hỗ trợ đắc
lực cho các nghiên cứu chức năng gen vùng rễ. Nghiên cứu này xác định một số điều
kiện thích hợp cho việc chuyển gen tạo rễ tóc sử dụng vi khuẩn A. rhizogenes trên
cây đậu nành (Glycine max L.) giống HLĐN29 và DT84.
Ở cả hai giống đậu nành sau lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu lá mầm cảm ứng
tạo rễ tốt hơn so với mẫu trụ hạ diệp. Chủng vi khuẩn ATCC11325 và ATCC15834
cho hiệu quả tạo rễ cao trên giống đậu nành HLĐN29, tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt từ 96% –
100%, với khoảng 8 rễ/mẫu, hình thái rễ tương tự đặc điểm rễ tóc chuyển gen.
Tương tự, chủng ATCC15834 cho hiệu quả tạo rễ tốt nhất ở giống đậu nành DT84.
Mẫu sau giai đoạn đồng nuôi cấy được loại bỏ khuẩn hiệu quả với cefotaxime 500
mg/L cùng carbenicillin 400 mg/L và duy trì trên mơi trường bổ sung cefotaxime

500 mg/L. Lá mầm đậu nành 6-8 ngày sau gieo cảm ứng tạo rễ tốt nhất. Hai cách lây
nhiễm trực tiếp và đồng nuôi cấy vi khuẩn cho số mẫu tạo rễ và số rễ trung bình
tương đương nhau trên cả hai giống đậu nành thí nghiệm. Tỉ lệ mẫu tạo rễ của giống
DT84 không khác biệt đáng kể khi sử dụng dịch khuẩn OD600nm từ 0,5 đến 1,3.
Trong đó, số rễ trung bình cao nhất (~ 7 rễ/mẫu) khi sử dụng dịch khuẩn có giá trị
OD600nm từ 0,5 đến 1,0. Ba mẫu rễ chuyển gen được xác định thơng qua phân tích
PCR và hình thái rễ khi duy trì mẫu trên mơi trường ni khơng bổ sung chất điều
hòa tăng trưởng.


vi

ABSTRACT
Soybean (Glycine max L.) gene transformation has been performed via
particle bombardment and the Agrobacterium tumefaciens system. However, the
success and efficiency of these methods relies mainly on the ability and time to
regenerate transgenic plants. In advantage of those traditional transformation
methods, transformation using Agrobacterium rhizogenes is an useful tool for
functional research on plant root systems. This study determines some conditions for
soybean (G. max L.) transformation via A. rhizogenes for hairy root induction on
soybean cultivars HLDN29 and DT84.
Cotyledonary explants were more efficient in hairy root production in both
cultivars HLDN29 and DT84. The highest root induction rate and average root
number was observed in HLDN29 explants infected with strain ATCC11325 and
ATCC15834 (96% – 100% and 8 roots/explant) and in DT84 explants infected with
ATCC15834. Morphology of these roots were similar with description for transgenic
roots. Bacterial removal after co-culture stage were effective with rinsing the
samples in culture media supplemented with 500 mg/L cefotaxime and 400 mg/L
carbenicillin before placing them on plates with 500 mg/L cefotaxime. Cotyledonary
leaves after sowing 6-8 days were optimal for hairy root induction. Infection

methods (direct inoculation and immersion) showed no significant difference in root
induction rate and average root number in both HLDN29 and DT84. There was no
difference in root formation rates of soybean DT84 infected with bacterial
suspension from OD600nm = 0.5 to 1.3, while the highest average root number (~7
roots/explant) was obtained with the suspension OD600nm = 0.5 to OD600nm = 1.3.
Three transgenic root lines were identified based on morphology when sub-culturing
on hormone – free media and PCR analysis.


vii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Vũ Phong và sự hỗ trợ của ThS. Tơn Bảo Linh.
Các số liệu, bảng biểu, hình ảnh là kết quả nghiên cứu của nhóm thực hiện đề
tài.
Tác giả

Ngô Thị Tú Trinh


viii

MỤC LỤC
Nội dung
Trang
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ...................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................ iv
TÓM TẮT ....................................................................................................................................v
ABSTRACT .............................................................................................................................. vi

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................... vii
MỤC LỤC ............................................................................................................................... viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................... xii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .............................................................................. xiii
Chương 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1
1.1 Lý do chọn đề tài ...................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài .......................................................................................................................1
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................................1
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................................2
1.3 Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................................2
1.4 Nội dung nghiên cứu.............................................................................................................2
1.5 Ý nghĩa của đề tài ..................................................................................................................2
1.5.1 Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................................2
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN ..........................................................................................................3
2.1 Cây đậu nành (Glycine max L.) ...........................................................................................3
2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ..................................................................................4
2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn A. rhizogenes ...............................................................................4
2.2.2 Plasmid Ri của A. rhizogenes ...........................................................................................5
2.2.3 Các gen rol ..........................................................................................................................7
2.2.4 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật ..................9
2.2.6 Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc ....................................................... 10
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ............................................................ 11
2.3.1 Sự phù hợp giữa kiểu gen thực vật và chủng vi khuẩn Agrobacterium .................... 11


ix
2.3.2 Môi trường ....................................................................................................................... 11
2.3.3 Mật độ vi khuẩn A. rhizogenes khi lây nhiễm.............................................................. 12

2.4 Lây nhiễm A. rhizogenes lên mẫu thực vật ..................................................................... 12
2.5 Chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes trên cây đậu nành ........................................ 13
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 17
3.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 17
3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................ 17
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 17
3.2.2 Hóa chất và môi trường .................................................................................................. 17
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 19
3.3.1. Tạo nguồn mẫu đậu nành in vitro và chuẩn bị A. rhizogenes.................................... 19
3.3.1.1 Tạo nguồn mẫu đậu nành ............................................................................................ 19
3.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn A. rhizogenes................................................................................ 20
3.3.2 Xác định một số điều kiện phù hợp lây nhiễm A. rhizogenes lên mẫu đậu nành in
vitro ............................................................................................................................................ 22
3.3.2.1 Xác định chủng vi khuẩn A. rhizogenes và mẫu đậu nành phù hợp cảm ứng tạo rễ
tóc ............................................................................................................................................... 22
3.3.2.2 Xác định hiệu quả diệt khuẩn A. rhizogenes của các loại kháng sinh ............... 23
3.3.2.3 Ảnh hưởng tuổi của mẫu đậu nành đến sự cảm ứng tạo rễ tóc ............................... 24
3.3.2.4 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes đến quá trình cảm ứng
tạo rễ tóc ở mẫu đậu nành ........................................................................................................ 25
3.3.2.5 Xác định mật độ vi khuẩn phù hợp cho q trình cảm ứng tạo rễ tóc ............... 25
3.3.3. Duy trì các dịng rễ giả định chuyển gen ..................................................................... 26
3.3.4. Khẳng định mẫu chuyển gen bằng phương pháp PCR .............................................. 26
3.3.5 Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A. rhizogenes ............... 27
3.3.6 Phương pháp xử lý thống kê .......................................................................................... 28
Chương 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ................................................................................. 29
4.1. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm ............................................................................................ 29
4.1.1. Chuẩn bị mẫu đậu nành in vitro ................................................................................... 29
4.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn .......................................................................................................... 29
4.2 Xác định chủng A. rhizogenes và loại mẫu phù hợp với cảm ứng tạo rễ tóc ở đậu
nành............................................................................................................................................ 31

4.3 Hiệu quả diệt khuẩn của các loại kháng sinh .................................................................. 35


x
4.4 Khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của mẫu ở độ tuổi khác nhau ............................................ 36
4.5 Hiệu quả cảm ứng tạo rễ của cách thức lây nhiễm vi khuẩn A. rhizogenes ................. 38
4.6 Xác định mật độ A. rhizogenes phù hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ................. 39
4.7 Duy trì các dịng rễ giả định chuyển gen ......................................................................... 40
4.8 Xác định mẫu chuyển gen bằng phương pháp PCR....................................................... 42
4.9 Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A. rhizogenes .................. 43
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 44
5.1 Kết luận ............................................................................................................................... 44
5.2 Đề nghị ................................................................................................................................ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 46
PHỤ LỤC.................................................................................................................................. 51


xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC:

American Type Culture Collection

B5:

Vitamin B5

bp:

base pair

CCM:

co-cultivation medium

DNA:

Deoxyribonucleic acid

FAO:

Food and Agriculture Organization

ICPB:

International Collection of Phytopathogenic Bacteria

Gus:

β-glucuronidase

MXB:

MS salts B5 vitamin

LB:

Left Border

LCCM:

liquid co-cultivation medium

LMXB:

liquid MS salts B5 vitamin

NT:

Nghiệm thức

OD:

Optical Density

PCR:

Polymerase Chain Reaction

RB:

Right Border

Ri-plasmid: Root inducing plasmid
T-DNA:

Transfer Deoxyribonucleic Acid

Ti-plasmid: Tumor inducing plasmid

Vir:

Virulence


xii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Thành phần của các loại môi trường sử dụng trong cảm ứng tạo rễ tơ trên
mẫu đậu nành ............................................................................................................18
Bảng 3.2 Các cặp primer sử dụng trong nghiên cứu ................................................19
Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm xác định chủng A. rhizogenes và loại
mẫu phù hợp cho cảm ứng tạo rễ ..............................................................................23
Bảng 3.4. Các nghiệm thức khảo sát hiệu quả diệt khuẩn của các loại kháng sinh.........24
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR ......................................................................27
Bảng 3.6: Chương trình nhiệt phản ứng PCR ..........................................................27
Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) mẫu tạo rễ của lá mầm và trụ hạ diệp (A) sau khi lây nhiễm các
chủng A. rhizogenes khác nhau (B)...........................................................................32
Bảng 4.2 Số rễ được tạo thành khi nhiễm mẫu đậu nành (A) với các chủng A.
rhizogenes khác nhau (B) ..........................................................................................32
Bảng 4.3 Mức độ tái nhiễm khuẩn của mẫu lá mầm DT84 in vitro .........................35
Bảng 4.4 Số rễ tạo thành và tỉ lệ tạo rễ của lá mầm đậu nành ở các ngày tuổi khác
nhau ...........................................................................................................................37
Bảng 4.5 Số rễ trung bình và số mẫu tạo rễ sau khi lây nhiễm A. rhizogenes theo hai
cách khác nhau ..........................................................................................................39
Bảng 4.6 Số rễ tạo thành và tỉ lệ mẫu tạo rễ ở đậu nành DT84 sau khi lây nhiễm A.
rhizogenes ở các mật độ khác nhau ...........................................................................40


xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 2.1 Cấu trúc Ri plasmid của A. rhizogenes........................................................7
Sơ đồ 3.1 Qui trình thực hiện lây nhiễm A. rhizogenes trên đậu nành .....................21
Hình 4.1 Hạt đậu nành nảy mầm in vitro. ................................................................29
Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
...................................................................................................................................30
Hình 4.3 Trụ hạ diệp và lá mầm đậu nành HLĐN29 sau khi lây nhiễm A. rhizogenes
sau 16 ngày trên môi trường MXB bổ sung cefotaxime 500 mg/L. .............................33
Hình 4.4 Rễ trên mẫu lá mầm đậu nành HLĐN29 sau khi lây nhiễm với các chủng
A. rhizogenes khác nhau ............................................................................................34
Hình 4.5 Mẫu lá mầm đậu nành 4 ngày sau khi rửa với carbenicillin và cefotaxime
trên mơi trường B5. ...................................................................................................36
Hình 4.6 Hạt đậu nành DT84 được gieo trên môi trường B5 ở các ngày tuổi khác
nhau ...........................................................................................................................38
o

Hình 4.7 Rễ đậu nành HLĐN29 trên môi trường MXB sau 6 tuần nuôi ở 25 C trong
điều kiện tối ...............................................................................................................41
Hình 4.8 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen Golgin 84 .............42
Hình 4.9 Các mẫu rễ chuyển gen sau 7 tháng duy trì trên mơi trường MXB. .........43


1

Chương 1: MỞ ĐẦU
1.1 Lý do chọn đề tài
Trong thời gian dài, các nghiên cứu cải thiện di truyền trên đậu nành tập
trung vào khả năng kháng sâu bệnh (Somers và cs, 2003; Trần Thị Cúc Hòa, 2010).
Vùng rễ của cây họ Đậu nói chung và cây đậu nành nói riêng được đặc biệt quan

tâm do khả năng cố định đạm và cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium. Những năm
gần đây, chức năng kháng tác nhân gây bệnh trong đất của các gen vùng rễ đậu
nành đã được biết đến. Bên cạnh đó khả năng thích nghi với điều kiện hạn và đất
mặn của cây đậu nành cũng được chú trọng. Điều đó cho thấy vùng rễ có chức năng
cực kỳ quan trọng trong sự phát triển và thích ứng với sự biến đổi khí hậu của cây
đậu nành.
Khai thác khả năng tự vệ và nguồn gen kháng tác nhân gây bệnh của cây
trồng là cơ sở để cải thiện giống cây trồng và là hướng đi được các nhóm nghiên
cứu về bộ gen chức năng xác định (Md Setamam và cs, 2014). Hiện nay chưa có
cơng bố nào về tạo rễ tóc trên cây đậu nành trong nước, và có ít nghiên cứu về sinh
học vùng rễ và tương tác giữa các gen ở rễ và tác nhân gây bệnh vùng rễ. Trên thế
giới, số lượng nghiên cứu tạo rễ tóc từ mẫu đậu nành in vitro cũng rất hạn chế. Do
đó, nghiên cứu sẽ giúp thiết lập qui trình tạo rễ tóc trên đối tượng đậu nành in vitro,
làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về chức năng của các gen cũng như sinh
học vùng rễ cây đậu nành.
Kết quả nghiên cứu sẽ làm nền tảng cho các nghiên cứu về chức năng bộ gen
đậu nành nhằm khai thác một cách hiệu quả nguồn gen hiện có trong nước. Đồng
thời kết quả này cũng hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về sự tương tác của tác
nhân gây bệnh vùng rễ và các gen ở vùng rễ thực vật. Các hướng nghiên cứu này,
về lâu dài, sẽ góp phần đáng kể vào sự phát triển bền vững năng suất và chất lượng
cây trồng.
1.2 Mục tiêu đề tài
1.2.1 Mục tiêu tổng quát


2
Tạo được rễ tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes phục vụ cho các nghiên cứu chức năng gen và sinh học vùng rễ đậu nành.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
- Xác định được loại mẫu đậu nành, vi khuẩn A. rhizogenes và các điều kiện

thuận lợi lây nhiễm.
- Xác định và duy trì các dịng rễ tóc đậu nành chuyển gen.
1.3 Đối tượng nghiên cứu
- Giống đậu nành HLĐN 29 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Thực
nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền
Nam.
- Giống đậu nành DT84 của Công ty cổ phần giống cây trồng miền Nam.
- Vi khuẩn A. rhizogenes không mang plasmid tái tổ hợp gồm các chủng
ICPB TR7, ATCC 11325, ATCC 15834
1.4 Nội dung nghiên cứu
- Xác định một số điều kiện thích hợp (loại mẫu, chủng vi khuẩn, tuổi mẫu,
cách thức lây nhiễm, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm) cho quá trình lây nhiễm
A. rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro.
- Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyển gen.
1.5 Ý nghĩa của đề tài
1.5.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài giúp tìm hiểu thêm mối tương tác giữa vi khuẩn A.
rhizogenes và mơ hình thực vật đậu nành, tạo tiền đề xây dựng các nghiên cứu mới
liên quan tạo cây đậu nành chuyển gen và góp phần phát triển các nghiên cứu tạo và
nhân sinh khối rễ tóc giúp nghiên cứu về gen và chức năng gen vùng rễ.
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài xác định được thông số quan trọng thích hợp và thiết lập quy trình
chuyển gen bằng vi khuẩn A. rhizogenes tạo rễ tóc ở cây đậu nành. Quy trình này có
thể ứng dụng trong nghiên cứu các vấn đề liên quan.


3

Chương 2: TỔNG QUAN
2.1 Cây đậu nành (Glycine max L.)

Đậu nành hay đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây trồng quan
trọng trong số các loại cây họ đậu (Fabaceae). Đậu nành có hàm lượng protein cao
do đó được dùng trong chế biến thực phẩm cho người và gia súc. Đậu nành là loại
cây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu
nành là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn
Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của khơng khí. Thân trịn, mang 8 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân... Đậu nành là cây tự thụ phấn,
hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím. Thời kỳ cây ra hoa sớm hay
muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi nó
chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Quả đậu nành là loại quả ráp,
ngoài vỏ quả thường có lơng bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay
xám đen. Hạt đậu nành có hình dạng trịn bầu dục, trịn dài, trịn dẹt; vỏ hạt thường
nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen... Cây đậu nành là cây trồng ngắn
ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ...
rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khí
hậu nhiệt đới. Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng
đều qua các giai đoạn. Yêu cầu về độ ẩm đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giai
đoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 - 80% nên đậu nành được xếp vào nhóm
cây trồng có nhu cầu về nước cao.
Đối với ngành trồng trọt, đậu nành có khả năng tích luỹ đạm của khơng khí
để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và
sinh khối thân, cành lá. Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hố
học và tăng độ phì nhiêu cho đất. Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu nành có tác
dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh,
chống nạn ơ nhiễm do lạm dụng phân bón hố học và thuốc trừ sâu.


4
Các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành cũng rất đa dạng, có thể dùng trực tiếp
ở dạng hạt thơ hay qua chế biến. Ngoài ra, trồng cây đậu nành có tác dụng cải tạo
đất do hoạt động của nhóm vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu. Nhiều

nghiên cứu về bộ gen cây đậu nành đã được tiến hành vì đây là cây trồng quan trọng
về mặt kinh tế trên thế giới (Stacey và cs, 2006). Những hướng nghiên cứu về cây
đậu nành chủ yếu nhằm nâng cao chất lượng dinh dưỡng, khả năng kháng côn trùng
gây hại và các mục tiêu khác. Một trong những quy trình hiệu quả để đạt các mục
tiêu trên là biến đổi di truyền cây đậu nành (Arruda và cs, 2013).
2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn A. rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes (trước đây được gọi là Phytomonas rhizogenes)
đã được nhận biết từ hơn 70 năm trước như là một tác nhân gây bệnh trên tầng lông
hút của rễ cây song tử diệp (hội chứng rễ tóc – hairy root). Agrobacterium
rhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, hình que, có tính di động, khơng
sinh bào tử, thuộc chi Agrobacterium. A. rhizogenes có quan hệ rất gần với
Agrobacterium tumefaciens, tác nhân gây khối u trên cây.
Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thực
vật bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứu
tổng quát về A. tumefaciens. Tồn bộ q trình lây nhiễm được xem như là tương tự
nhau trong cả 2 loài. A. rhizogenes gây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết
thương, do A. rhizogenes bị hấp dẫn bởi hợp chất phenol được phóng ra từ những tế
bào bị tổn thương. Ri plasmid của A. rhizogenes sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật và
một đoạn nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được chuyển và gắn vào bộ gen của tế
bào thực vật. Theo cách này T-DNA được duy trì ổn định trong bộ gen mà nó
chuyển vào. Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc
(hairy root). Những rễ này có đặc điểm là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều,
tăng trưởng nhanh và đặc biệt là chúng có khả năng phát triển in vitro trong điều
kiện khơng có các yếu tố kích thích tăng trưởng (Rao và Ravishankar, 2002 trích
dẫn bởi Taylor, 2007). Những đặc tính này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ


5
được sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng

gen, và nghiên cứu sinh học của rễ nói chung.
Các dịng A. rhizogenes có thể được phân loại vào nhiều nhóm phụ khác
nhau dựa trên kiểu opine mà chúng sản xuất ra. Các dòng A. rhizogenes phổ biến
nhất được xác định đến nay gồm dòng sản xuất agropine (đại diện là Ri plasmid pRi
A4, pRi 1855, pRi HRI, pRi 15834, và pRi LBA9402), dòng sản xuất mannopine (đại
diện là Ri plasmid pRi 8196), dòng sản xuất cucumopine (đại diện là Ri plasmid pRi
2659) và dòng sản xuất mikimopine (đại diện là Ri plasmid pRi 1724). Mikimopine
và cucumopine là những chất đồng phân lập thể, nhưng khơng có tính tương đồng
giữa các gen tổng hợp opine ở mức độ nucleotide. Trong số các dòng A. rhizogenes
khác nhau được biết, K47, K599 và HRI là các dịng gây độc cao có khả năng lây
nhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau (Taylor, 2007).
2.2.2 Plasmid Ri của A. rhizogenes
Ri plasmid của A. rhizogenes và Ti plasmid của A. tumefaciens tương tự
nhau về cấu trúc. Những nghiên cứu so sánh trình tự của Ri và Ti plasmid cho thấy
các cơ cấu của sự hoạt hóa và sự vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực
vật được bảo tồn giữa 2 loại plasmid. Trong cả Ri và Ti plasmid, gần vùng biên giới
của T-DNA có 1 chuỗi mã có tính chất lặp lại gồm 24 bp, được gọi là trình tự lề
(border sequences). T-DNA nguyên thủy mang một nhóm gen gây ung thư và dị
hóa opine, biểu hiện ở những tế bào thực vật chuyển gen là sự phát triển của các mô
ung thư và sự sản xuất opine, các dẫn xuất amino acid hầu như chỉ được vi khuẩn sử
dụng như là nguồn carbon và nitrogen. Cả Ri và Ti plasmid đều chứa gen điều
khiển quá trình gắn và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và cho hiện tượng dị hóa
các opine trong mơ thực vật đã chuyển gen. Tính tương đồng đáng chú ý giữa Ri và
Ti plasmid là vùng vir và cơ cấu quá trình vận chuyển và xâm nhập của T-DNA
(Taylor, 2007).
Mặc dù Ri plasmid (của A. rhizogenes) và Ti plasmid (của A. tumefaciens) có
nhiều điểm tương đồng nhau, đó là chúng đều có mang các vùng T-DNA, vùng vir,
gen chuyển hóa opine và vùng ori khởi đầu sao chép trong tế bào vật chủ nhưng vẫn
tồn tại những sự khác nhau là vùng T-DNA của Ti plasmid chứa các gen tổng hợp

6
auxin, cytokinin và opine trong khi Ri plasmid chỉ mang các gen tổng hợp auxin và
opine. Đây là điểm khác nhau gây ra hiệu quả tác động khác nhau lên thực vật. Ri
plasmid của A. rhizogenes khơng chứa trình tự overdrive được tìm thấy trong Ti
plasmid của A. tumefaciens. Trình tự overdrive có kích thước 24 bp với 1 trình tự
trung tâm 8 bp được bảo vệ nằm gần lề phải trên Ti plasmid có tác dụng là làm gia
tăng hiệu quả hình thành khối u bằng cách làm tăng mạnh quá trình vận chuyển TDNA. Ri plasmid của A. rhizogenes sở hữu trình tự lặp lại 8 bp – gọi là trình tự kích
thích vận chuyển T-DNA (TSS), nó làm gia tăng hiệu quả biến nạp T-DNA vào hệ
gen thực vật. TSS gồm 12 trình tự lặp lại 5-TGCCTTCG-3 trong dịng sản xuất
mikimopine, 6 trình tự lặp lại 5-ATTAGTTC-3 trong dịng sản xuất mannopine, 5
trình tự lặp lại 5-TTGTTCAA-3 trong dịng sản xuất agropine, và 16 trình tự lặp lại
5-GTTCGTCA-3 trong dòng sản xuất cucumopine của A.rhizogenes.
Một sự khác nhau đáng chú ý nữa giữa A.tumefaciens và A. rhizogenes là
trong Ri plasmid của A. rhizogenes khơng có gen virE1 và virE2. VirE2 là 1 sợi đơn
DNA –gắn kết protein và virE1 là chất ức chế kèm theo của nó. Chức năng của
virE2 là bảo vệ sợi đơn T-DNA khỏi sự tấn cơng của nuclease và kích thích nhân
của nó nhập vào tế bào thực vật. Gen virE rất quan trọng cho sự sự phát sinh bệnh
của A. tumefaciens nhưng không phải là thiết yếu cho sự cảm ứng rễ tóc. A.
rhizogenes có chứa gen GALLS trên Ri plasmid, có thể thay thế chức năng của gen
virE2 trong A. tumefaciens. Tuy nhiên, cơ chế mà GALLS protein có thể thay thế
chức năng virE2 trong A. rhizogenes vẫn chưa được hiểu rõ (Taylor, 2007).
Tất cả các dòng A. rhizogenes đều chứa một vùng T-DNA trên Ri plasmid
mang những gen liên quan đến sự khởi đầu và phát triển rễ (rol-gene), những gen
liên quan đến sự tổng hợp opine, và những gen chưa rõ chức năng. Một T-DNA thứ
2 có thể xuất hiện chứa những gen liên quan đến sự tổng hợp auxin (aux1 hoặc
iaaM và aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác. Ri plasmid có
hai T-DNA, TL và TR, được gọi là “split" T-DNA. Ri plasmid của dịng sản xuất
cucumopine và mannopine chỉ có một vùng T-DNA, dịng sản xuất agropine có một
split T-DNA chứa hai vùng T-DNA, TL và TR, mỗi vùng có kích thước khoảng 15-

7
20 kb. Cả TL-DNA và TR-DNA đều được biến nạp và hợp nhất một cách độc lập
trong hệ gen cây chủ, sự vận chuyển TL-DNA chủ yếu là để cảm ứng rễ tóc.

Hình 2.1 Cấu trúc Ri plasmid của A. rhizogenes (Veena và Taylor, 2007).
2.2.3 Các gen rol
Một vài vị trí trên TL-DNA của Ri plasmid có chứa các gen thiết yếu cho sự
cảm ứng rễ tóc (được gọi là gen rol). TL-DNA của agropine Ri plasmid có ít nhất 4
vị trí chứa các gen rolA, rolB, rolC, rolD tương ứng với các khung đọc mở (Open
reading frame – ORF) 10, 11, 12, 15. Từ những năm 90, sự kết hợp của rolA, rolB
và rolC đã được chứng minh là đủ để tạo ra kiểu hình rễ tóc, phụ thuộc lồi thực vật
và kiểu mơ.
TR-DNA chỉ được tìm thấy trong Ri plasmid của A. rhizogenes dịng sản xuất
agropine gồm có các gen aux1, aux2, RolB TR, mas1, mas2 và ags điều khiển quá
trình tổng hợp opine và auxin. Các gen aux được coi là đóng vai trị phụ trong cảm
ứng rễ tóc và khơng thiết yếu cho sự sản xuất rễ tóc. Các dịng A. rhizogenes sản
xuất opine như mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển một đoạn T-DNA
đơn tương đồng với agropine TL-DNA nhưng khơng có gen rolD. T-DNA của dịng


8
sản xuất cucumopine và mannopine khơng có các gen aux mà chỉ có gen rol là đủ
cho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc.
Gen rolA đóng vai trị quan trọng trong sự hình thành rễ tóc vì sự biểu hiện
của rolA trong cây chuyển gen ổn định tạo ra kiểu hình biến dạng cao: lá xoăn, xanh
đậm, đốt dài, có hiện tượng lùn hoặc bán lùn, hóa già chậm. Gen rolA có liên quan
đến sự thay đổi sinh lý hormone gồm cả sự can thiệp vào gibberellin. Trình tự gen
rolA của nhiều dòng A. rhizogenes khác nhau dài khoảng 279 – 423bp. RolA cũng

có thể liên quan đến sự mất cân bằng mức độ hormone thực vật.
Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB sẽ có kích thước từ 762 – 837bp và
mã hóa một protein có 259 – 279 amino acid. Gen rolB sử dụng một cấu trúc
promoter trong cây chuyển gen ức chế sự cảm ứng và hoại tử rễ bất định, cả trong
mô sẹo và lá cây con. Sự biểu hiện của rolB cần thiết cho hoạt động tăng trưởng của
rễ tóc vì mức độ biểu hiện cao hay thấp sẽ làm yếu sự tăng trưởng của những cơ
quan này.
Gen rolC từ nhiều T-DNA Ri plasmid khác nhau thì tương tự nhau về kích
thước vào khoảng 540 bp và mã hóa protein có 179 - 181 amino acid. Cây chuyển
gen có biểu hiện rolC thì thấp và giảm tính trội ngọn, lá mũi mác, hoa tự sớm. Sự
bất hoạt của các gen rol đưa đến sự thay đổi hình thái học của rễ hoặc loại bỏ sự
hình thành rễ tóc. Sự biểu hiện của rolC ảnh hưởng đến sự cân bằng của các
cytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng như auxin và gibberellin trong tế bào thực
vật. Sự biểu hiện rolC cũng làm giảm đáng kể mức độ acid abscisic (ABA),
polyamine, và ethylene.
Gen rolD chỉ được tìm thấy trong Ri T-DNA của dịng sản xuất agropine. Nó
có kích thước 1.032bp và mã hóa một protein có 344 amino acid, đó là một
ornithine cyclodeaminase enzyme xúc tác sự chuyển hóa ornithine thành proline. Sự
biểu hiện của rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra hoa sớm, làm tăng số
lượng hoa và có thể có liên quan đến sức sản xuất của cây. Thêm vào đó, sự tích lũy
proline có thể là một phản ứng bảo vệ liên quan đến stress (Taylor, 2007).


9
2.2.4 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật
Quá trình cắt đoạn T-DNA ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào thực
vật trước hết phụ thuộc vào sản phẩm của các gen vir. Vi khuẩn xâm nhiễm tại bất
kỳ vị trí tổn thương nào trên thân cây. Cây có vết thương do sự hỏng ngẫu nhiên của
màng tế bào thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất được mã hóa bởi
các gen vir. Hoạt động của các gen này được hoạt hóa bởi hợp chất phenolic của

cây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của chalcone...). Ngoài ra, các
monosaccharide như glucose, arabinose có mặt trong mơi trường cũng làm tăng khả
năng gây cảm ứng nhóm gen vir.
Protein virA đóng vai trị quan trọng trong việc quyết định loại cây chủ bị
nhiễm bởi Agrobacterium. Trong thực tế, Agrobacterium không có khả năng xâm
nhập vào cây một lá mầm, có thể protein virA khơng nhận biết các tín hiệu do cây
một lá mầm tiết ra. Nói chung, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy
các nhà nghiên cứu cho rằng Agrobacterium chỉ có thể đưa T-DNA vào hệ gen các
cây hai lá mầm. Tuy nhiên gần đây nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi
khuẩn, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và vì thế có thể khai thác khả
năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. Hiện nay, người ta cũng
đã thành công trong việc chuyển gen vào một số cây một lá mầm như lúa, mía... qua
trung gian A. tumefaciens.
Khi cây nhiễm A. rhizogenes, do T-DNA hợp nhất vào trong bộ gen của cây
chủ bắt đầu hoạt động và sản xuất ra auxin, opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối
loạn, các tế bào phân chia vơ tổ chức và tạo ra rất nhiều rễ tóc. Opine được sử dụng
như một loại thức ăn nhờ gen chuyển hóa opine trên Ri plasmid.
Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. rhizogenes phải tiếp
xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các
gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2
glucan mạch vịng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị
ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2-glucan giữ vai trò
quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu


10
khơng có sự tiếp xúc này, sẽ khơng có sự dẫn truyền T-DNA. Các sản phẩm protein
của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực
vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T- DNA khỏi plasmid, cảm
ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần TDNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi

cuối cùng xâm nhập vào bộ gen của cây chủ.
Thực chất, chỉ riêng T-DNA của plasmid được chuyển vào bộ gen tế bào
thực vật, mà không cịn phần nào khác. Q trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của
các gen vir và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên TDNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trị là vị trí cảm
ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE
mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận
biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng
vir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone
giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp
tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa tồn bộ
các gen vir cịn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước
đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của
T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn. Đồng
thời, q trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm suất màng tế bào thực
vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein
do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó,
sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp
giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được
chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào bộ gen tế bào
thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác (Nguyễn Hồng
Lộc, 2008).
2.2.6 Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc
Sau khi A. rhizogenes tiếp xúc tế bào thực vật, một đoạn nhỏ của plasmid Ri
là T-DNA sẽ được chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật. Theo cách này T-


11
DNA được duy trì ổn định trong bộ gen mà nó chuyển vào. Đoạn T-DNA có nguồn
gốc hoang dại mã hóa các gen gây độc (aux, rol) và các gen chuyển hóa opine dẫn
đến sự phát triển mơ bất thường và tạo opine. Từ vùng bị nhiễm khuẩn, mẫu thực

vật hình thành rễ nhánh bất thường gọi là rễ tơ. Những rễ này có đặc điểm là phát
triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh trong môi trường không bổ
sung hormon thực vật (Rao và Ravishankar 2002 trích dẫn bởi Veena và Taylor
2007). Những đặc tính này làm cho rễ tơ trở thành một công cụ được sử dụng rộng rãi
cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và nghiên cứu sinh
học rễ nói chung.
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình chuyển gen
2.3.1 Sự phù hợp giữa kiểu gen thực vật và chủng vi khuẩn Agrobacterium
Thành công của việc tạo rễ tơ nhờ A. rhizogenes phụ thuộc vào sự phù hợp
giữa kiểu gen mẫu được lây nhiễm và vi khuẩn. Owen và cs (1985) đã tìm hiểu về
đáp ứng của 26 kiểu gen đậu nành (G. max) khi được cảm ứng tạo rễ tơ bởi chủng
Agrobacterium A136 chứa pRiA4b. Chỉ có 7 kiểu gen đậu nành tạo rễ ở vị trí lây
nhiễm, 8 kiểu gen chỉ tạo những nốt nhỏ, và 11 kiểu gen cịn lại khơng thể hiện đáp
ứng.
Trong nghiên cứu tương tự của Savka và cs (1989), tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ
của 10 kiểu gen đậu nành sử dụng A. rhizogenes K599 (chủng cucumopine) là 37%.
Ở chủng mannopine 8196, tỉ lệ này là 3% trên 4 kiểu gen đậu nành và chủng
agropin 1855 và A4 có tỉ lệ mẫu tạo rễ thấp nhất (1%). Mẫu trụ hạ diệp tuy xuất
hiện rễ sau khi lây nhiễm với tất cả các chủng A. rhizogenes trong khảo sát, nhưng
không phải là rễ tơ có khả năng tổng hợp opin.
2.3.2 Mơi trường
Có thể sử dụng nhiều mơi trường khác nhau để duy trì Agrobacterium như
LB (Cho và cs, 2000, Kurma và cs, 2006, AL-Yozbaki, Rasheed và Salih 2015),
yeast – manitol, nutrient yeast, YDPK, YEB, YMB (Wise, Liu và Binns 2006) hay
YEP (Olhoft và cs, 2013).


12
Trong quá trình chuẩn bị mẫu đậu nành in vitro và quá trình cảm ứng tạo rễ
tơ sử dụng A. rhizogenes, nhiều công thức môi trường khác nhau đã được sử dụng.

Mơi trường gieo hạt đậu nành in vitro có thể gồm đường và agar (Cho và cs, 2000,
Weber và Bodanese – Zanettini 2011); B5 (Zia và cs, 2010), môi trường B5 có điều
chỉnh (Olhoft và cs, 2013).
Ở giai đoạn đồng nuôi cấy A. rhizogenes và mẫu đậu nành, môi trường B5 (Zia
và cs, 2010), B5 có điều chỉnh (Olhoft và cs, 2013), hay môi trường MS được sử
dụng. Cho và cs (2000) đã đặt mẫu sau lây nhiễm lên giấy lọc được làm ẩm bằng
nước cất đã khử trùng, bề mặt mẫu mang vết thương hướng lên trên.
Để loại A. rhizogenes sau giai đoạn đồng nuôi cấy, các tác giả đã rửa mẫu 2 -3
lần với dung dịch rửa mẫu như nước cất hấp khử trùng, môi trường MS có bổ sung
cefotaxime 250 mg/L và carbenicillin 250 mg/L hay môi trường B5 bổ sung
cefotaxime 1 g/L (Zia và cs, 2010). Trong khi đó, Cho và cs (2000) chỉ chuyển mẫu
sang mơi trường MXB (khống MS kết hợp vitamin B5) có bổ sung carbenicillin;
Nguyễn Như Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016) chuyển mẫu dừa cạn (Catharanthus roseus)
sang môi trường 1/2MS bổ sung cefotaxime 500 mg/L và ủ trong tối 7 ngày ở 25 oC.
Ở giai đoạn cảm ứng tạo rễ, môi trường cảm ứng thường là môi trường B5 hay MS có
bổ sung thành phần kháng sinh giống giai đoạn loại vi khuẩn (Olhoft và cs, 2007).
2.3.3 Mật độ vi khuẩn A. rhizogenes khi lây nhiễm
Mật độ Agrobacterium là một yếu tố quan trọng liên quan đến hiệu quả lây
nhiễm. Mật độ Agrobacterium phản ánh tình trạng tăng trưởng và Agrobacterium ở
pha tăng trưởng được cho là có khả năng lây nhiễm cao hơn. Mật độ Agrobacterium
tối ưu đối với từng đối tượng thực vật thay đổi với giá trị OD600 từ 0,6 đến 1,8 (Li và
cs, 2017). AL-Yozbaki, Rasheed và Salih (2015) đã ngâm mẫu đậu nành trong dịch A.
rhizogenes OD600nm ~ 0,5 và lây nhiễm mẫu trực tiếp với dịch khuẩn OD600nm ~ 1,0.

2.4 Lây nhiễm A. rhizogenes lên mẫu thực vật
Mẫu thực vật thường được lây nhiễm Agrobacterium bằng cách tạo vết thương.
Mẫu được tạo vết thương bằng lưỡi dao hoặc bằng kim, sau đó được ngâm trong dịch