Nghiên cứu thủy phân dầu hạt bụp giấm bằng enzyme lipase để thu sản phẩm có hoạt tính kháng oxy hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN VĂN NHỰT

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN DẦU HẠT BỤP GIẤM BẰNG
ENZYME LIPASE ĐỂ THU SẢN PHẨM CĨ HOẠT TÍNH
KHÁNG OXI HĨA

Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 06 năm 2016


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. PHAN NGỌC HÒA
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS. Phạm Văn Hùng

…………………………

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trịnh Khánh Sơn

…………………………

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày

11 tháng 07 năm 2016
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. PGS. TS. Phạm Văn Hùng

…………………………

2. TS. Trịnh Khánh Sơn

…………………………

3. GS. TS. Đống Thị Anh Đào

…………………………

4. TS. Lại Quốc Đạt

…………………………

5. TS. Huỳnh Ngọc Oanh

…………………………

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: TRẦN VĂN NHỰT

MSHV: 12144528

Ngày, tháng, năm sinh: 17/10/1986

Nơi sinh: Bình Thuận

Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm và đồ uống

Mã số: 605402

I. TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN DẦU HẠT BỤP GIẤM BẰNG ENZYME
LIPASE ĐỂ THU SẢN PHẨM CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HĨA

II.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/đệm đến quá trình thủy phân của enzyme lipase.
- Khảo sát ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ enzyme/gam cơ chất đến quá trình thủy phân

của enzyme lipase.
- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân của enzyme lipase.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân của enzyme lipase.
- Khảo sát thời gian thủy phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme lipase.
- Thủy phân dầu hạt Bụp Giấm với những điều kiện tối ưu đã chọn.
- Tách phân đoạn sản phẩm thủy phân.
- Xác định khả năng kháng oxi hóa của sản phẩm thủy phân.
III.
IV.
V.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/12/2015
NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. PHAN NGỌC HÒA
Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)

ii


LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận văn này, bên cạnh sự nỗ lực hết mình của chính bản thân, em cịn

nhận được những ý kiến đóng góp hết sức quý báu và sự giúp đỡ, động viên nhiệt tình
của Q Thầy/Cơ, các em khóa 2011 và bạn bè. Với tấm lịng biết ơn sâu sắc, em xin
gửi lời cảm ơn đến:
Cô: Phan Ngọc Hòa, giảng viên trường Đại học Bách Khoa TP. HCM, đã hướng dẫn
và theo sát em trong suốt thời gian dài thực hiện luận văn, đồng thời hỗ trợ phần lớn
kinh phí để em hồn thành luận văn này.
Cô: Nguyễn Thị Nguyên, giảng viên trường Đại học Bách Khoa TP. HCM, đã tạo điều
kiện thuận lợi để em sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ trong phịng thí nghiệm để
hồn thành tốt luận văn này.
Q Thầy/Cơ trong Bộ môn đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong việc thực hiện
luận văn.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, anh chị em và người thân trong gia đình
đã động viên, cổ vũ em về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt q trình học tập và
thực hiện luận văn.
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016
Người viết

vi


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Hạt Bụp Giấm hiện nay được thải bỏ nhưng có giá trị dinh dưỡng cao và chứa
thành phần kháng oxy hóa cũng như có khả năng làm giảm cholesterol. Trong đề tài
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme porcine pancreas lipase để thủy phân dầu
hạt Bụp Giấm nhằm mục đích thu nhận sản phẩm có hoạt tính kháng oxi hóa. Q trình
nghiên cứu gồm 3 giai đoạn: Khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase;
khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme porcine pancreas
lipase; khảo sát tính chất sản phẩm thủy phân. Dầu hạt Bụp Giấm chứa khoảng 18.8 –
22.3% protein, 39.5 – 42.6% chất xơ, 19.1 – 22.8% chất béo, đặc biệt hàm lượng acid
béo khơng bão hịa chiếm đến 70%, trong đó acid linoleic chiếm tỷ lệ 44%. Enzyme

porcine pancreas lipase có hoạt độ và hoạt độ riêng lần lượt là 78.58 (UI/mg enzyme)
và 178.60 (UI/mg protein). Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân ban đầu của
enzyme porcine pancreas lipase được khảo sát bao gồm: Tỉ lệ dầu/đệm; tỉ lệ enzyme/cơ
chất; pH tối ưu của enzyme; nhiệt độ tối ưu. Hiệu suất thủy phân đạt 85.13% sau 24h
khi tiến hành phản ứng với tỉ lệ dầu/đệm là 1:1 (v/v); tỉ lệ enzyme/cơ chất là 0.2%
(w/w); pH = 7.5; ở 370C. Kết quả tách phân đoạn: Thành phần acid béo chiếm tỷ lệ cao
trong hai pha phân cực và không phân cực là Cis – 9 – Octadecenoic acid methyl ester
(C18:1), Cis – 9, 12 – Octadecandienoic acid methyl ester (C18:2), Hexadecanoic acid
methyl ester (C16:0), Octadecanoic acid methyl ester (C18:0), trong đó thành phần các
acid béo không no chiếm tỷ lệ khá cao. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của dầu
hạt Bụp Giấm: IC50 của phân đoạn phân cực là 0.389µl mẫu/µl dung dịch, tương đương
324mg/ml. IC50 của phân đoạn không phân cực là 0.54µl mẫu/µl dung dịch, tương
đương 450mg/ml.

viii


ABSTRACT

Roselle seed is now discarded but has high nutritional value and contains antioxidants
as well as having the ability to reduce cholesterol. In this work, the enzymatic
hydrolysis of Roselle seed oil by porcine pancreas lipase was studied for the purpose of
receiving products with antioxidant activity. The research process consists of three
stages: Survey of properties of porcine pancreas lipase enzyme; survey optimal
hydrolysis conditions Roselle seed oil by porcine pancreas lipase enzyme; determinate
fatty acid contents and antioxidant ability of the products. Roselle seed oil contains
about 18.8 - 22.3% protein, 39.5 - 42.6% fiber, 19.1 - 22.8% fat, especially unsaturated
fatty acid content of up to 70%, in which the proportion of linoleic acid is 44%.
Activity and specific activity of porcine pancreas lipase enzyme were respectively
78.58 UI/mg enzyme and 178.60 UI/mg protein. Factors affecting the speed of the

initial hydrolysis of porcine pancreas lipase enzyme were investigated: Ratio of
oil/buffer; ratio of enzyme/oil; optimal pH; optimal temperature. % hydrolyzed reaches
85.13% after 24 hours with optimal conditions: Ratio of oil/buffer is 1:1 (v/v); ratio of
enzyme/oil is 0.2% (w/w); pH = 7.5, with temperature is 370C. Results separated
segments: fatty acid composition high percentage of two - phase polarized and nonpolarized as Cis - 9 - Octadecenoic acid methyl ester (C18:1), Cis - 9,12 Octadecandienoic acid methyl ester (C18:2), hexadecanoic acid methyl ester (C16:0),
Octadecanoic acid methyl ester (C18:0), in which the composition of unsaturated fatty
acids relatively high proportion. The results of antioxidant activity Roselle seed oil:
IC50 of polarized segments that form 0.389µl/µl solution, equivalent to 324mg/ml.
IC50 of nonpolar segments is 0.54μl samples/µl solution, equivalent to 450mg/ml.

ix


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kếtquả nêu
trong luận văn này đều là trung thực.
Học viên thực hiện

TRẦN VĂN NHỰT

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây và hạt Bụp Giấm ................................................................................... 5
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của α-linolenic acid ........................................................ 7
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của linoleic acid ............................................................. 7
Hình 1.4. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp ép ......................... 8
Hình 1.5. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp trích ly .................. 9
Hình 1.6. Cấu trúc mơ phỏng của enzyme PPL .......................................................... 18

Hình 1.7. Mơ hình đóng nắp và mở nắp trong enzyme PPL ....................................... 18
Hình 1.8. Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất .......................... 19
Hình 1.9. Cơ chế thủy phân dầu Bụp Giấm của enzyme PPL .................................... 20
Hình 1.10. Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme PPL .................... 22
Hình 2.1. Quy trình thu nhận dầu hạt Bụp Giấm ........................................................ 34
Hình 2.2. Quy trình tách phân đoạn sản phẩm thủy phân ........................................... 38
Hình 2.3. Phản ứng trung hịa gốc DPPH ................................................................... 39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu:đệm đến tốc độ thủy phân ban đầu của enzyme
porcine pancreas lipase ............................................................................................... 42
Hình 3.2. Ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ enzyme/gam cơ chất đến tốc độ thủy phân ban
đầu của enzyme porcine pancreas lipase .................................................................... 43
Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH đến tốc độ thủy phân ban đầu của enzyme porcine
pancreas lipase ............................................................................................................ 45
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ thủy phân ban đầu của enzyme porcine
pancreas lipase ............................................................................................................ 36
Hình 3.5. Biến thiên mức độ thủy phân dầu hạt Bụp Giấm theo thời gian ................. 47


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần các acid béo có trong dầu hạt Bụp Giấm ................................. 6
Bảng 1.2. Tính đặc hiệu cơ chất của lipase ................................................................. 21
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase ................................... 23
Bảng 2.1. Tỷ lệ dầu:đệm ............................................................................................. 35
Bảng 2.2. Bố trí nghiệm thức kháng oxi hóa .............................................................. 40
Bảng 3.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong hạt cây Bụp Giấm ngày 08/03/2016 của
Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp.HCM ..................................................... 41
Bảng 3.2. Hoạt độ của enzyme porcine pancreas lipase ............................................. 42
Bảng 3.3. Thành phần acid béo trong dầu hạt Bụp Giấm và trong sản phẩm sau thủy
phân ............................................................................................................................. 48
Bảng 3.4. Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của dầu Bụp Giấm bằng DPPH .............. 49

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG……………………………………………...………………...X
DANH MỤC HÌNH……………………………..…………………………………XI
CHƯƠNG 1
1.1

TỔNG QUAN ..................................................................................4

BỤP GIẤM ....................................................................................................4

1.1.1

Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm ........................................................4

1.1.2

Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm .....................................................5

1.1.3

Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm ..............................................8

1.2

Enzyme lipase ..............................................................................................10

1.2.1

Định nghĩa.............................................................................................10

1.2.2

Nguồn thu nhận .....................................................................................10

1.2.3

Cấu trúc hóa học của enzyme lipase .....................................................12

1.2.4

Tính chất của enzyme lipase .................................................................12

1.2.5

Cơ chế hoạt động của enzyme lipase ....................................................13

1.2.6

Ứng dụng của enzyme lipase ................................................................14

1.3

Enzyme porcine pancreas lipase ..................................................................15

1.3.1

Định nghĩa.............................................................................................15

1.3.2

Cấu trúc của porcine pancreas lipase ....................................................15

1.3.3

Ứng dụng của enzym porcine pancreas lipase ......................................23

CHƯƠNG 2
2.1

. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............27

Nguyên liệu và hóa chất ..............................................................................27

2.1.1

Hạt Bụp Giấm .......................................................................................27

2.1.2

Chế phẩm enzyme Porcine Pancreas lipase (PPL) ...............................27

2.1.3

Hóa chất khác........................................................................................27

2.1.4

Hexane (www.binhtri.com) ..................................................................28

2.2

Dụng cụ và thiết bị.......................................................................................29

2.2.1

Dụng cụ .................................................................................................29

2.2.2

Thiết bị ..................................................................................................29

2.3

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................29
1


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

2.3.1

Xác định giá trị vận tốc ban đầu của enzyme PPL ...............................29

2.3.2

Xác định mức độ thủy phân của enzyme porcine pancreas lipase .......30

2.3.3 Xác định acid béo bằng phương pháp sắc ký khí (GC/FID)(Phạm Hùng
Việt, 2003) ..........................................................................................................31
2.4

Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................33

2.4.1

Khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase .......................33

2.4.2

Trích ly dầu hạt Bụp Giấm: ..................................................................34

2.4.3 Khảo sát điều kiện thủy phân tối ưu dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme
porcine pancreas lipase. ......................................................................................35
2.4.4
CHƯƠNG 3

Khảo sát tính chất sản phẩm thủy phân ................................................37
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..........................................................41

3.1

Kết quả phân tích chỉ tiêu trong hạt Bụp Giấm ...........................................41

3.2

Kết quả khảo sát tính chất của enzyme porcine pancreas lipase .................42

3.3

Khảo sát tìm điều kiện thủy phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme PPL....42

3.3.1

Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm ................................................................42

3.3.2

Ảnh hưởng của đơn vị hoạt độ enzyme/gam cơ chất ...........................43

3.3.3

Ảnh hưởng của pH ................................................................................44

3.3.4

Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................46

3.3.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân của enzyme
porcine pancreas lipase .......................................................................................47
3.4

Khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân ................................................48

3.4.1

Kết quả tách phân đoạn .........................................................................48

3.4.2

Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa của dầu hạt Bụp Giấm ................49

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................51

4.1

Kết luận........................................................................................................51

4.2

Kiến nghị .....................................................................................................51

2


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

LỜI MỞ ĐẦU


Cây Bụp Giấm (Hibiscus sabdariffa L) là một loại cây dễ trồng, có thể chịu hạn.
Theo báo Nơng nghiệp Việt Nam thì từ đầu thập niên 90 đến nay, Bụp Giấm (giống
lấy từ Đức) được Công ty Dược liệu Trung ương II trồng nhiều ở Bà Rịa, Đồng Nai,
Sơng Bé, Bình Thuận (với diện tích khoảng 400ha để xuất khẩu). Năng suất đài khô
khoảng 400 – 800kg/ha và năng suất hạt 500 – 600kg/ha. 1ha cây Bụp Giấm thu
được tối đa 600kg hạt, như vậy với diện tích 400ha thì thu được 240.000kg. Đối với
các tỉnh Nam Trung bộ thì được canh tác 2 vụ/năm, nên hạt Bụp Giấm thụ được là
480.000kg (gần 500 tấn). Ngoài ra, số liệu từ trạm Khuyến Nông Cư Jut, tỉnh Đắc
Nông cho thấy Công ty Gấc Tây Nguyên trồng cây Bụp Giấm tại huyện Cư Jut,
diện tích trồng năm 2014 là 4.5ha. Năng suất đạt từ 30 – 40 tấn quả tươi/ha, năng
suất hạt là 5 đến 6 tấn/ha (ẩm độ khoảng 10%). Bộ phận có giá trị kinh tế cao của
cây là đài hoa. Đài hoa được xuất khẩu như dược liệu thô. Phần hạt (gần 510 tấn)
thường bị thải bỏ như một loại rác thải. Trong khi đó hạt Bụp Giấm là một nguồn
nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, khoảng 18.8 – 22.3% protein, 39.5 –
42.6% chất xơ, 19.1 – 22.8% chất béo, đặc biệt hàm lượng acid béo không bão hịa
chiếm đến 70%, trong đó acid linoleic chiếm tỷ lệ 44%. Ngồi ra, hạt cịn chứa
khoảng 7% chất khống gồm Mg, Ca, K, Zn,… (Gummadi S.N và cs, 2009). Việc
thải bỏ hạt Bụp Giấm với số lượng lớn hàng năm như thế đã gây lãng phí nguồn
dinh dưỡng và làm cho môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng. Chính vì vậy,
để tận dụng nguồn dinh dưỡng q của hạt Bụp Giấm và giúp người dân hiểu được
lợi ích quan trọng của loại hạt này chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy
phân dầu hạt Bụp Giấm bằng enzyme lipase để thu nhận sản phẩm có hoạt
tính kháng oxi hóa”.

3


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 BỤP GIẤM
1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bụp Giấm
Cây Bụp Giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L, cịn gọi là cây Giấm
hay Bụp Giấm, thuộc họ bông Malvaceae, cùng họ với cây bông bụp. Tên tiếng anh
phổ biến của loại cây này là Roselle, ngoài ra một số tên địa phương khác cũng
được sử dụng như: Karkade, Mesta, Sorrel,… Bụp Giấm là một loại cây đa dụng,
được xem là nguồn nguyên liệu sử dụng trong thực phẩm, thức ăn gia súc cũng như
trong dược phẩm. Cây Bụp Giấm là loại cây thân thảo hóa gỗ họ Cẩm quỳ. Cây là
một loại thảo dược ưa chuộng tại Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Cây sống
một năm, cao 1.5 - 2m, phân nhánh gần gốc, màu tím nhạt. Lá hình trứng, mép có
răng. Hoa đơn độc, mọc ở nách, gần như khơng có cuống. Tràng hoa màu vàng
hồng hay tía, có khi trắng. Quả nang hình trứng, có lông thô, mang đài mầu đỏ sáng
tồn tại bao quanh quả. Cây ra hoa từ tháng 9 đến tháng 10.
Cây Bụp Giấm được trồng khá rộng rãi ở nước ta và được đánh giá như là
cây thuốc của Châu Á, hầu như các thành phần của cây được tận dụng khá triệt để.
Lá ngồi của quả (hay cịn gọi là đài hoa) có màu đỏ rực rỡ và hương vị độc đáo đã
trở thành một sản phẩm thực phẩm có giá trị (Tsai và Ou, 1996). Chúng được sử
dụng trong sản xuất thạch, mứt, nước trái cây, rượu, xi-rô, gelatin, bánh pudding và
hương liệu (Ageless và cs, 1999). Trên thế giới, các sản phẩm sản xuất từ nguyên
liệu Bụp Giấm đã được biết đến và thương mại hóa rộng rãi. Ngoài giá trị dinh
dưỡng, Bụp Giấm là loại thuốc quý trong dân gian, có giá trị dược liệu cao. Bụp
Giấm có giá trị lợi tiểu, giảm huyết áp, lợi mật, kháng khuẩn, nhuận tràng, làm giảm
mỡ máu, bảo vệ tế bào gan… Trong nghiên cứu, cây Bụp Giấm là một nguồn quan
trọng cung cấp vitamin như C; E; khoáng chất và các hợp chất có hoạt tính sinh học
như acid hữu cơ, phytosterol và polyphenol. Hàm lượng phenolic bao gồm chủ yếu

là anthocyanins, flavonoid, acid protocatechuic, eugenol và sterol (Azza và cs,
2011; Trần Thị Ngọc Yên và cs, 2012). Tuy nhiên hạt Bụp Giấm chứa dầu béo với
hàm lượng khá cao vẫn chưa được chú trọng nhiều. Nguồn dầu béo này chứa nhiều
4


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HỊA

hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có tính kháng khuẩn, là nguồn nguyên liệu tiềm
năng cho thực phẩm. (Juana Sanchez M và cs, 2008)

Hình 1.1. Cây và hạt Bụp Giấm
1.1.2 Hạt và thành phần của hạt Bụp Giấm
Hạt Bụp Giấm là phế phẩm sau khi thu hoạch đài hoa. Nó là một nguồn
nguyên liệu giàu dinh dưỡng và năng lượng, bao gồm các thành phần protein, chất
béo, carbohydrate và chất xơ.
Theo nghiên cứu ở Ấn Độ, hạt Bụp Giấm có độ ẩm từ 6 – 8%, có chứa 18 –
22% protein, 19 – 22% chất béo, tổng chất xơ là 39 – 42% và một số thành phần
khoáng như: K, Ca, Zn, Cu, Mg … (Rao và cs, 1996). Một nghiên cứu gần đây hơn
của Hainida và cs (2008) cho biết thành phần hóa học của hạt như sau: protein
35.5%, lipid 22.1%, carbohydrate 13%, chất xơ 18.3% và khoáng 7.5%. Dựa vào
kết quả phân tích thành phần hạt Bụp Giấm cho thấy hạt giàu chất dinh dưỡng, đặc
biệt là protein, lipid và chất xơ. Trong đó, thành phần protein bao gồm các acid
amin không thay thế như: lysine, leusine, isoleusine và tryptophan, dầu bao gồm
chủ yếu là các acid béo không no và có chứa các chất chống oxi hóa với hàm lượng
cao.
1.1.2.1

Đặc điểm dầu hạt Bụp Giấm
Acid béo không bão hòa của dầu hạt Bụp Giấm chiếm tỷ lệ cao, hơn 70%

trong đó chủ yếu là acid béo linoleic chiếm tới 45.9%, acid oleic chiếm 29.2%

5


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

(Amin và cs, 2008). Gần đây, Rashmi Gadwal và cs (2015) cũng cho biết về thành
phần acid béo của hạt Bụp Giấm như sau: linoleic acid là 44.72%, oleic acid là
25.15% và stearic acid 4.31%, palmitic acid 18.52%. Dầu hạt Bụp Giấm còn có các
chất chống oxy tan trong lipid, đặc biệt là  -tocopherol. Tổng tocopherol trung bình
là 2000mg/kg. Trong đó,  - tocopherol chiếm 25%,  - tocopherol 74.5% và  tocopherol 0.5% bên cạnh các đặc trưng hóa lý của dầu (H. Padmaja và cs, 2014; E.
Betikul và cs, 2013), tính kháng vi sinh vật (BH. Ali và cs, 2005) là cơ sở khoa học
để khai thác dầu hạt Bụp Giấm sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm.
1.1.2.2

Thành phần acid béo trong dầu hạt Bụp Giấm
Theo nghiên cứu dầu hạt Bụp Giấm của Fatoumata Tounkara và cs (2011)

cho biết hạt Bụp Giấm (đã luộc ở 500C, thời gian 12 giờ) là nguồn nguyên liệu giàu
hàm lượng các acid béo, đặc biệt hàm lượng các acid béo không no chiếm tỷ lệ khá
cao (74.33%) với các acid béo quan trọng như acid linoleic (35.55%), acid oleic
(36.64%), acid palmitic (19.34%), acid stearic (4.86%).
Bảng 1.1. Thành phần các acid béo có trong dầu hạt Bụp Giấm. (Fatoumata
Tounkara và cs, 2011)

Hạt Bụp Giấm

Hạt Bụp Giấm đã luộc

Myristoleic acid (C14:0)

0.21

0.23

Palmetic acid (C16:0)

19.21

19.34

Stearic acid (C18:0)

5.13

4.86

Arachidic acid (C20:0)

0.67

0.64

Tổng cộng

25.22

25.07

Palmitoleic acid (C16:1)

0.36

0.36

Oleic acid (C18:1)

36.9

36.64

Linoleic acid (C18:2)

35.02

35.55

Alpha-linolenic acid (C18:3)

1.85

1.78

Hàm lượng acid béo (%)
Acid béo no

Acid béo không no

6


LUẬN VĂN THẠC SĨ
Tổng cộng

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA
74.13

74.33

Chất béo có vai trị quan trọng trong q trình vận chuyển các loại vitamin
tan trong dầu mỡ như: Vitamin A, D, E, K, các acid béo khơng no có vai trị quan
trọng trong sự phát triển bình thường của cơ thể, tăng sức đề kháng và có hoạt tính
sinh học cao. Acid oleic là thành phần chính của chất myelin bao quanh sợi trục tế
bào thần kinh, giúp dẫn truyền tín hiệu thần kinh. Acid linoleic (omega - 6) là tiền
chất của ARA thành phần quan trọng của màng tế bào (kể cả tế bào não), là tiền
chất của nhiều chất kháng viêm giúp tăng cường sức đề kháng. Hàm lượng linoleic
là tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá giá trị sinh học của chất béo, có khả năng hỗ
trợ giảm thiểu triệu chứng viêm khớp tự miễn, làm giảm tính viêm sưng. Omega-6
cũng rất có ích trong việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch bằng cách làm giảm
cholesterol và triglyceride trong máu. Acid linolenic (omega - 3) là tiền chất của
DHA, là acid béo quan trọng trong việc phát triển não bộ, mắt và hệ thần kinh
(DHA chiếm 1/4 não bộ người lớn) có tác dụng chống các bệnh tim mạch, làm giảm
áp lực lên thành động mạch ở những người bị bệnh huyết áp cao, giảm nhồi máu cơ
tim, kìm hãm sự lão hóa não, ngăn ngừa sự suy giảm trí nhớ. Các acid béo chưa no
kết hợp với các cholesterol tạo thành các ester cơ động, không bền vững và dễ bài

tiết ra khỏi cơ thể, giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch và có tác dụng cao trong q
trình điều hịa thành mạch máu, nâng cao tính đàn hồi và hạ thấp khả năng thẩm
thấu của thành mạch máu, giúp hạn chế nghẽn động mạch vành tim.

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của α-linolenic acid

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của linoleic acid

7


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.1.3 Các phương pháp tách dầu hạt Bụp Giấm
1.1.3.1

Phương pháp ép

Sử dụng máy ép trục vít để ép dầu. Cớ chế ép tách bằng trục vít này dựa trên
việc thiết kế cấu tạo thể tích giảm dần của vít Archimede trong lịng ống. Nhờ thiết
kế đặc biệt của vít tải, dầu được giải phóng ra khỏi bột nghiền do sự tạo thành áp
lực trong máy ép – do sự nén nguyên liệu và sức phản kháng của nguyên liệu: Bột
chưng sấy sau khi đã được chuẩn bị có cấu trúc đàn hồi và cơ lý nhất định, phần
protein của bột có tính dẻo rất cao, dễ dàng biến dạng không phục hồi về trạng thái
cũ. Dầu phân bố trong các khe vách và trên mặt các hạt bột là chất lỏng, độ nhớt
nhỏ ở nhiệt độ cao. Khi bột bị ép trong lòng máy, áp lực hình thành giúp dầu từ các
khe vách thốt ra (Trần Thanh Trúc, 2005)
Hạt Bụp

Giấm

Làm sạch,
sấy khơ
Nghiền
Chưng sấy
bột nghiền
Ép sơ bộ

Bánh dầu

Dầu thơ

Ép kiệt
Bánh dầu
Hình 1.4. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp ép

8


LUẬN VĂN THẠC SĨ
1.1.3.2

GVHD: TS. PHAN NGỌC HỊA

Phương pháp trích ly

Trích ly dầu được thực hiện dựa trên đặc tính hịa tan tốt của dầu thực vật
trong các dung mơi hữu cơ không phân cực như: hexane; dicloetan… Chủ yếu là
hexane. Việc chuyển dầu phân bố bên trong cũng như mặt ngoài các cấu trúc vật thể

rắn như hạt, bột chưng sấy, khô dầu vào pha lỏng của dung môi là một quá trình
truyền khối xảy ra trong lớp chuyển động, dựa vào sự chênh lệch nồng độ dầu trong
nguyên liệu và dịng chảy bên ngồi (Trần Thanh Trúc, 2005)
Hạt Bụp
Giấm

Loại bỏ tạp chất

Đất, đá, hạt mốc
Độ ẩm cuối cùng dưới 10%.

Sấy

Nghiền thơ

Hexan

Trích ly

Bã

Cơ quay

Sử dụng máy cơ quay chân
khơng 500C, 70 vịng/phút

Ly tâm

Tách cặn, 3000v/phút, 10 phút

Dầu Bụp Giấm

Hình 1.5. Sơ đồ chiết tách dầu hạt Bụp Giấm bằng phương pháp trích ly

9


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.2 Enzyme lipase
1.2.1 Định nghĩa
Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác thủy
phân và tổng hợp các este được hình thành từ triglycerol và các acid béo. Chúng có
bản chất là protein. Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu –
nước.
Lipase được tìm thấy trong động vật, thực vật, nấm và vi khuẩn, có ý nghĩa sinh lý
và tiềm năng trong công nghiệp. Chức năng sinh học của lipase là xúc tác quá trình
thủy phân của triacylglycerol giải phóng acid béo tự do, diacylglycerols,
monoacylglycerols và glycerol. Lipase thủy phân chất béo thành acid béo và
glycerol tại bề mặt phân pha dầu - nước và đảo chiều các phản ứng trong mơi
trường khơng có nước: tổng hợp các este từ glycerol và acid béo chuỗi dài. Sản
phẩm thu được bằng cách sử dụng lipase tinh khiết hơn so với sử dụng các chất xúc
tác hóa học vì sử dụng chất xúc tác hóa học sinh ra nhiều sản phẩm không mong
muốn và tạp chất, nhiệt độ, áp suất cao và không tái sử dụng được. Như các xúc tác
khác, lipase chỉ làm tăng tốc độ phản ứng nhưng không tham gia trực tiếp vào phản
ứng. Tuy nhiên, do khả năng xúc tác chọn lọc, các enzyme có thể xúc tác phản ứng
xảy ra ở một số liên kết nhất định. Vì vậy, mỗi loại enzyme khác nhau có thể xúc
tác cho các phản ứng xảy ra theo chiều hình thành một số sản phẩm nhất định. Điều

này khiến cho sản phẩm của các phản ứng có xúc tác enzyme thuần nhất hơn.
1.2.2 Nguồn thu nhận
Lipase được phân bố ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn thu
nhận lipase lớn nhất trong công nghiệp là vi sinh vật. Lipase phân lập ở các nguồn
khác nhau sẽ khác nhau về cấu trúc protein và cơ chế xúc tác, khác nhau về các acid
béo đặc trưng, khả năng chịu nhiệt, pH tối ưu.
Ở người và động vật có xương sống, lipase kiểm sốt sự thủy phân, hấp phụ, tổng
hợp chất béo và chuyển hóa lipoprotein. Hầu hết lipase trích ly từ cơ thể động vật
đều có nhiệt độ tối thích là 370C. Ở động vật, lipase được lấy từ tuyến tụy và dạ
dày.
10


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

Lipase động vật ưu tiên xúc tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo mạch dài
có hơn 12 nguyên tử carbon. Tốc độ phản ứng giảm đáng kể theo thứ tự tri, di và
monoglycerides. Một số loại lipase chiết xuất từ dê, cừu và bê. Các enzyme này xúc
tác cho quá trình thủy phân tạo các acid béo ngắn mạch có tác dụng tạo hương vị
cho sản phẩm phomat.
Lipase được tìm thấy tại mơ dự trữ của các loại hạt có dầu, ngũ cốc trong quá trình
nảy mầm. Chế phẩm lipase thô được lấy từ mầm của cây cải dầu (Brassica napus),
mù tạt, cây thầu dầu và một số loại đậu. Tuy nhiên, lipase thu nhận từ thực vật chưa
được đưa vào ứng dụng nhiều vì q trình tinh sạch khó khăn và hiệu quả kinh tế
không cao.
Lipase được thu nhận trong quá trình lên men của nấm và vi khuẩn: Staphylococcus
spp., Pseudomonas spp., Chromobacterium spp., Candida Rugosa…
- Lipase từ Aspergillus niger và Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử từ 25KDa

đến 200KDa và pH tối ưu từ 4.5 đến 6.5. Chúng hoạt động trên dầu dừa, dầu hạt
lanh và dầu olive với hiệu suất thủy phân từ 48 - 93% và được sử dụng trong q
trình chín pho mát.
- Lipase từ Candida Rugosa: khối lượng phân tử 120KDa, điểm đẳng điện ở pH 4.5
và pH tối ưu 6.5–7.5 (Petersen et al., 2001). Chúng thủy phân dầu olive với hiệu
suất 95 – 97%.
- Lipase từ Rhizopus: R. arrhizus, R. javanicus, R. niveus, R. delemar. R. arrhizus
lipase có khối lượng phân tử 43KDa và điểm đẳng điện ở pH 6.3, hoạt động ở pH
tối ưu 5 – 7 và nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C.
- Lipase từ Pseudomonas: khối lượng phân tử 29KDa và điểm đẳng điện ở pH 5.8
và pH tối ưu là 6.5 – 8.5. Chúng hoạt động và ổn định ở pH kiềm, được sử dụng
trong chất tẩy rửa.
Enzyme lipase Porcine Pancreas được tách ra từ tuyến tụy của lợn, đây là
nguồn quan trọng để thu nhận enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân
lập đầu tiên từ nguồn này.

11


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

1.2.3 Cấu trúc hóa học của enzyme lipase
Cấu trúc khơng gian của chúng gồm hai vùng xác định:
- Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn
amino acid 1 – 336. Bộ ba xúc tác Ser, Asp và His lần lượt ở tại vị trí amino acid
153, 177 và 264.
- Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này
tương tác với colipase. Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử

khoảng 10kDa.
Cấu trúc tinh thể của enzyme lipase có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác. Vị
trí của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác. Vùng võng rộng
nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa Cys238 và
Cys262. Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng
N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt
động. Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase. Khi nắp
này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động.
1.2.4 Tính chất của enzyme lipase
Enzyme lipase là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của 449 amino
acid, với khối lượng phân tử khoảng 50 – 52kDa. Tính chất vật lý của lipase chủ
yếu phụ thuộc vào các yếu tố như vị trí của các acid béo trong mạch glycerol, chiều
dài chuỗi các acid béo và mức độ bão hòa của acid béo. Những tính chất này cũng
ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng và cảm quan của một triglyceride nhất định.
Nhiều lipase hoạt động trong các dung môi hữu cơ, xúc tác cho phản ứng este hóa.
Hoạt động lipase thường phụ thuộc vào diện tích bề mặt và điều kiện phản ứng nhẹ
nhàng. Một cuộc khảo sát bởi Linko và Wo trên lipase thương mại cho kết quả
lipase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus có tính chọn lọc cao đối với các acid béo
chuỗi ngắn và rượu, đối với C.rugosa lipase là acid propionic, acid butyric, butanol,
pentanol và hexanol. Đối với M. Miehei và R. arrhizus, lipase là các acid béo chuỗi
dài và acetate.

12


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

So với các loại enzyme lipase khác, enzyme lipase có hoạt tính tương đối thấp.

Hoạt tính của enzyme lipase được xác định thơng qua hoạt độ của enzyme, bằng
cách xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong
phản ứng.
Có rất nhiều định nghĩa về hoạt độ của enzyme, nhưng thông thường hoạt độ
của enzyme được định nghĩa như sau: một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng
enzyme chuyển hóa một micromol cơ chất hoặc một micromol sản phẩm tạo thành
sau một khoảng thời gian phản ứng tại một nhiệt độ và pH xác định. (Kí hiệu: U).
pH của mơi trường có ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme, vì nó ảnh hưởng
đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền protein của enzyme.
Enzyme lipase thể hiện hoạt tính cao nhất tại môi trường pH kiềm, trong giới
hạn 7.3 – 9.0. Với cơ chất là dầu oliu, pH tối ưu cho hoạt động của lipase nằm trong
giới hạn là 7.5– 9.0; với ethyl acetate, pH tối ưu là 7.5.
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn
xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn cịn bền, chưa bị biến tính. Nhiệt độ tối ưu
cho hoạt động của enzyme lipase là 35 – 450C. Với cơ chất là triacylglycerol, lipase
thể hiện hoạt tính cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng 35 – 450C, pH dao động
từ 6.7 – 7.5.
1.2.5 Cơ chế hoạt động của enzyme lipase
Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động (vùng kỵ nước), nó đi vào
tiếp xúc với bộ ba xúc tác Ser153, His264 và Asp177. Lúc này, bộ ba xúc tác sẽ
thực hiện phản ứng thủy phân. Bộ ba được định hướng khi một trong số các nguyên
tử oxy ở phần cuối của Asp177 liên kết với một nguyên tử nitơ trong vòng Histidin
bằng liên kết hydro, giúp cho His264 được định vị để nguyên tử nitơ khác của nó
tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser153. Liên kết hydro thứ hai này kéo
hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, với định vị
này thì enzyme sẵn sàng để hoạt động.
Bước đầu tiên của phản ứng xảy ra dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của
cacbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh Ser153. Tác nhân ái nhân là nhóm

13

LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

OH- của serin mang điện tích âm tấn cơng vào trung tâm tích điện dương của
cacbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa cacbon glycerol thứ nhất và oxy của
este yếu đi. Oxy trong liên kết este trở thành nhóm linh động và nó được thêm một
proton H+ vào từ nhóm OH- của Ser153 để trung hịa điện tích âm của nó. Khi oxy
nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và hồn tồn tự
do.
Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser153, tuy nhiên
liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của nó.
Bước thứ hai của cơ chế thủy phân liên quan đến sự hình thành và di chuyển của
diglyceride từ nửa đang chứa glycerol. Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một
nhóm hydroxyl để liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol và một ion H+ để thêm
một proton trở lại vào oxy của Ser153. Một phân tử nước ở môi trường ngồi cung
cấp các thành phần cần thiết này. Thơng qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân
ly thành H+ và OH-. Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân
tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành. Ion hydronium có một
momen lưỡng cực rất lớn và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon
glycerol đầu tiên. Thời điểm này, oxy của Ser153 rời khỏi nhóm. Chuỗi bên cạnh
tích điện âm của Ser153 nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước. Lúc
này, sản phẩm diglyceride được hình thành. Liên kết hydro giữa nitơ thơm của
His264 và nhóm hydroxyl trên Ser153 được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban
đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác.
1.2.6 Ứng dụng của enzyme lipase
Lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: chất tẩy rửa, trong thực phẩm,
dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp giấy... Lipase được sử

dụng để tạo ra các loại hương liệu tổng hợp hoặc tự nhiên từ thực vật để làm nước
hoa thơng qua phản ứng este hóa.
Do khả năng thủy phân chất béo của lipase nên ngày nay lipase được dùng trong bột
giặt để thủy phân các vết dầu mỡ trên quần áo, chăn nệm trong điều kiện nhiệt độ
thấp và pH cao với những chất hóa học có hoạt tính bề mặt. Trong cơng nghiệp

14


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

giấy, sáp và các triglyceride gây trở ngại cho quá trình sản xuất. Do vậy, việc loại
bỏ các chất này là rất cần thiết. Hiện nay, lipase được coi như một tác nhân sinh thái
để loại bỏ các tạp chất trên.
Trong những năm gần đây enzym ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi
trong y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh như:
metoprolol, 1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)phenoxy]propan-2-ol được
sử dụng để điều trị cao huyết áp và đau thắt ngực (đau ngực), loạn nhịp tim, đau nửa
đầu và các rối loạn khác liên quan đến thần kinh giao cảm.
1.3 Enzyme porcine pancreas lipase
1.3.1 Định nghĩa
Các enzyme porcine pancreas lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC
3.1.1.3) được định nghĩa như là các enzyme xúc tác thủy phân các liên kết ester
giữa các acid béo mạch dài và glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu –
nước. Các enzyme porcine pancreas lipase thủy phân triacylglycerol (TAG) không
tan trong nước thành các diacylglycerol, các monoacylglycerol phân cực hơn cũng
như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá trình hấp thu và chuyển hóa qua màng.
Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động tối thích cho hầu hết các porcine

pancreas lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các porcine pancreas lipase hoạt động
trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 650C, nhưng thông dụng nhất là từ 30 –
450C. Nhiều chuỗi acid amin của porcine pancreas lipase đã được tìm ra như: lipase
tụy của người, bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris),
lợn (Cavia orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus). (Varger
R, 1984)
1.3.2 Cấu trúc của porcine pancreas lipase
Trong những porcine pancreas lipase đã biết, khơng có trình tự acid amin đặc
trưng nào cho mọi lipase. Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt. Điểm giống nhau
của tất cả các porcine pancreas lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly – X –
Ser – X – Gly (trong rất hiếm trường hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin
khác). Trình tự này nằm gần trung tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã
15


LUẬN VĂN THẠC SĨ

GVHD: TS. PHAN NGỌC HÒA

sử dụng chuỗi pentapeptide này để định danh những protein là lipase. Mặc dù có sự
khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả porcine pancreas lipase đều có một
kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là nếp gấp  có liên quan đến cơ chế xúc tác của
nó. Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của
enzyme có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất. Cấu
trúc gấp nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có
chuỗi  2 ngược chiều. Các chuỗi  3 đến  8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn 
. Sự khác biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên nếp gấp  , sự hiện diện của
nhóm phụ và cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất.
Cấu trúc lập thể của porcine pancreas lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các
nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của enzyme porcine pancreas lipase bị che

chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động. Theo Winkler F.K và cộng sự, cấu
trúc di động cần di chuyển trên bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc
hoạt động của enzyme với trung tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc
tinh thể của porcine pancreas lipase hay cấu trúc dạng phức đã tạo điều kiện cho
việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase. Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất
hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di động chuyển từ đóng sang mở. Cơ chế
đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho
trung tâm hoạt động của lipase thơng suốt để có thể liên kết với lipid. (Varger R,
1984)
1.3.2.1

Cấu trúc di động của porcine pancreas lipase
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề

mặt liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt
động của enzyme, làm cho phân tử cơ chất khơng gắn kết được vào đó. Khi chuyển
sang dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham
gia phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm
sáng tỏ nhiều hơn. Nó khơng chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động.
Nắp có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng
nắp, phần mặt ưa nước hướng ra ngồi dung mơi và mặt kỵ nước hướng vào lõi

16