Nghiên cứu định lượng chrondoitin sulfate bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHAN BẢO DUNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CHONDROITIN SULFATE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành:

Công Nghệ Thực Phẩm

Mã ngành:

60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2017


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa – ĐHQG – HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS. TS. Đống Thị Anh Đào
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS. Lê Phi Nga
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trịnh Khánh Sơn
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 07 năm 2017.

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng
2. PGS. TS. Lê Phi Nga
3. TS. Trịnh Khánh Sơn
4. TS. Trần Thị Thu Trà
5. TS. Võ Đình Lệ Tâm
Xác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá LV và Trưởng khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA
KỸ THUẬT HĨA HỌC

PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng

GS. TS. Phan Thanh Sơn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: PHAN BẢO DUNG

MSHV: 7141010

Ngày, tháng, năm sinh: 19/06/1990

Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm

Mã số : 60 54 01 01

I.

TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CHONDROITIN SULFATE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Nghiên cứu tổng quan về tính chất hóa lý của Chondroitin sulfate.
- Nghiên cứu tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Xây dựng quy trình phân tích định lượng Chondroitin sulfate bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Thẩm định quy trình phân tích định lượng Chondroitin sulfate bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng để định lượng Chondroitin sulfate trong
nguyên liệu tinh sạch, các chế phẩm dược và thực phẩm chức năng.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: GS. TS. Đống Thị Anh Đào

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

GS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm
TRƯỞNG BỘ MƠN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)

GS. TS. PHAN THANH SƠN NAM


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Đống Thị Anh
Đào, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề cương và
luận văn tốt nghiệp. Trân trọng cảm ơn cô đã tư vấn về kiến thức chuyên ngành và
hỗ trợ nguyên vật liệu để phục vụ cho việc thử nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để em vừa cơng tác tốt, vừa hồn thành đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy Cô bộ môn Công
Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức chuyên sâu, tư duy khoa
học cho em trong suốt thời gian qua.
Sau cùng mình xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè lớp cao học K2014 và các
đồng nghiệp công ty TNHH Hasan Dermapharm đã có những đóng góp, trao đổi,
chia sẻ, giúp đỡ mình trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này.
Luận văn đã hoàn thành bằng tất cả khả năng nhưng khơng thể tránh khỏi
những thiếu sót và hạn chế, em kính mong sẽ nhận được những lời nhận xét, góp ý
q báu của thầy cơ để em hồn thiện kiến thức chun mơn và kĩ năng nghiên cứu

nhằm đóng góp vào sự phát triển khoa học cơng nghệ Việt Nam.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 06 năm 2017
Học viên thực hiện

Phan Bảo Dung


ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Hiện nay, Chondroitin sulfate đang được sử dụng khá rộng rãi, chủ yếu dưới
dạng thực phẩm chức năng chứa đồng thời Glucosamine hay hai thành phần này
được kết hợp với một số chất khác như vitamin C, vitamin B1, B6,
Methylsulfonylmethane (MSM)... và có mặt trên thị trường với nhiều dạng bào chế
khác nhau như: viên nén, viên nang cứng, viên nang mềm, syrup... với công dụng
điều trị bệnh thối hóa sụn khớp xương.
Việc xác định hàm lượng Chondroitin sulfate trong nguyên liệu và các loại
thực phẩm chức năng này là khá cần thiết. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có phương
pháp định lượng Chondroitin sulfate chính thức trong các tiêu chuẩn ngành và quốc
gia. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình định lượng
Chondroitin sulfate bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đơn giản, nhanh
chóng, chính xác và có tính ứng dụng cao. Phương pháp phân tích được thẩm định
để áp dụng kiểm tra chất lượng đối với các chế phẩm dược và thực phẩm chức năng
có chứa Chondroitin sulfate.


iii

ABSTRACT
At present, Chondroitin sulfate is being used widely, mainly in the form of

functional food products containing Glucosamine concurrently or these components
are

combined

with

other

components

such

as

vitamin

C,

B 1,

B6 ,

Methylsulfonylmethane (MSM) ... and these are available in the market with many
kinds of products such as tablets, hard capsules, soft capsules, syrup ... for the
treatment of Osteoarthritis.
The quantitative analysis of Chondroitin sulfate obtained from raw materials
and various pharmaceutical preparations is quite necessary. However, the national
standard have not defined the quantitative analysis of Chondroitin sulfate yet.
Therefore, the purpose of this study is developing a simple, rapid, accurate, and

highly applicable method for determination of Chondroitin sulfate using High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). The analytical method is validated
to determine Chondroitin sulfate in pharmaceutical preparations and functional
foods products.


iv

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Phan Bảo Dung, hiện là học viên cao học ngành Công nghệ Thực
phẩm tại trường Đại học Bách Khoa Tp. HCM (Mã số học viên 7141010).
Tôi xin cam đoan những điều như sau:
 Luận văn này do chính tơi thực hiện.
 Mọi cơng thức, sắc ký đồ, đồ thị, kết quả tính tốn đều do chính tơi thực
hiện hoặc có nguồn gốc tham khảo rõ ràng.
Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn tốt nghiệp của mình.
Học viên thực hiện

Phan Bảo Dung


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................ ii
ABSTRACT.......................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................... xi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................1
1.1

Tổng quan về Chondroitin Sulfate (CS) ........................................................1

1.1.1

Đặc điểm và cấu trúc của CS ..................................................................1

1.1.2

Nguyên liệu chứa CS ..............................................................................5

1.1.3

Dược lý, dược động học [32] ................ Error! Bookmark not defined.

1.2

Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High

Performance Liquid Chromatography) ...................................................................7
1.2.1

Khái niệm về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..........................7

1.2.2

Nguyên tắc của quá trình sắc ký .............................................................7

1.2.3

Phân loại sắc ký ......................................................................................7

1.2.4

Detector hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis) ...................................8

1.2.5

Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo .................................................................9

1.2.6

Pha động trong sắc ký pha đảo .............................................................12

1.2.7

Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký .............................................13

1.2.8

Ứng dụng của HPLC.............................................................................20

1.2.9

Ứng dụng của HPLC phân tích CS trong các chế phẩm dược .............23

1.3

Thẩm định phương pháp phân tích ..............................................................25


vi
1.3.1

Tính đặc hiệu (tính chọn lọc) ................................................................25

1.3.2

Tính tương thích hệ thống.....................................................................26

1.3.3

Tính tuyến tính – Khoảng xác định ......................................................26

1.3.4

Độ đúng .................................................................................................26

1.3.5

Độ chính xác .........................................................................................26

1.3.6

Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng ............................................27

1.3.7

Độ bền – Độ thô ....................................................................................28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............30
2.1

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị .....................................................................30

2.1.1

Nguyên liệu và hóa chất........................................................................30

2.1.2

Dụng cụ và thiết bị ................................................................................31

2.2

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................32

2.2.1

Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................32

2.2.2

Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................33

2.3

Quy trình nghiên cứu ...................................................................................34

2.3.1

Xử lý mẫu .............................................................................................34

2.3.2

Xác định điều kiện sắc ký .....................................................................35

2.3.3

Thẩm định phương pháp phân tích .......................................................37

2.3.4

Ứng dụng quy trình định lượng để kiểm tra hàm lượng CS trong một số

chế phẩm trên thị trường ...................................................................................41
2.4

Phương pháp xử lý kết quả ..........................................................................42

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...............................................43
3.1

Xây dựng quy trình phân tích định lượng CS bằng phương pháp HPLC ...43

3.1.1
3.2

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ..................................................43

Thẩm định phương pháp phân tích ..............................................................57

3.2.1

Tính đặc hiệu chọn lọc ..........................................................................57


vii
3.2.2

Tính tương thích hệ thống.....................................................................60

3.2.3

Tính tuyến tính (khoảng xác định)........................................................61

3.2.4

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ...................62

3.2.5

Độ đúng của phương pháp ....................................................................64

3.2.6

Độ chính xác .........................................................................................65

3.3

Ứng dụng quy trình phân tích để định lượng các chế phẩm chứa CS .........69

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................71
4.1

Kết luận ........................................................................................................71

4.2

Đề xuất .........................................................................................................72

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................74
DANH MỤC PHỤ LỤC .......................................................................................78


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

1

ACN

Acetonitrile

2

CS

Chondroitin Sulfate

3

GAG

Glycosaminoglycan

4

GalNAc

N-acetyl-D-galactosamine

5

GlcA

D-glucuronic acid

6

HPLC

7

IdoA

L-iduronic acid

8

LOD

limit of detection

9

LOQ

limit of quantitation

10

MeOH

Methanol

11

ODS

Octadecylsilane

12

PG

Proteoglycan

13

RPC

Reversed-phase Chromatography

14

RP-IPC

Reversed-phase Ion-pair Chromatography

15

TEA

Triethylamin

16

THF

Tetrahydrofuran

High Performance Liquid
Chromatography


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1: Phân loại CS ..............................................................................................5
Bảng 1. 2: Thành phần chính của mơ sụn ...................................................................6
Bảng 1. 3: Hàm lượng CS từ các nguồn sụn khác nhau .............................................6
Bảng 2. 1: Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu...............................................30
Bảng 2. 2: Các chế phẩm chứa CS sử dụng trong nghiên cứu ..................................30
Bảng 2. 3: Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu ............................31
Bảng 2. 4: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu....................................................31
Bảng 2. 5: Cấu hình hệ thống HPLC Hitachi ............................................................32
Bảng 2. 6: Các điều kiện khảo sát hệ pha động của quá trình sắc ký .......................36
Bảng 3. 1: Độ đáp ứng peak CS tại các nồng độ muối Natri octane sulfonic acid ...45
Bảng 3. 2: Độ đáp ứng peak CS tại các nồng độ TEA khác nhau ............................48
Bảng 3. 3: Độ đáp ứng peak CS tại các giá trị pH dung dịch đệm khác nhau ..........50
Bảng 3. 4: Độ đáp ứng peak CS tại các tỉ lệ Đệm – ACN khác nhau .......................52
Bảng 3. 5: Độ đáp ứng peak CS tại các tốc độ dòng khác nhau ...............................53
Bảng 3. 6: Độ đáp ứng peak CS tại các nhiệt độ lò cột khác nhau ...........................55
Bảng 3. 7: Độ đáp ứng peak CS các thể tích tiêm khác nhau ...................................56
Bảng 3. 8: Kết quả tính tương thích hệ thống ...........................................................60
Bảng 3. 9: Diện tích peak ứng với từng nồng độ của CS trong dãy chuẩn ...............61
Bảng 3. 10: Độ đáp ứng peak CS tại nồng độ định lượng 0,034mg/ml ....................63
Bảng 3. 11: Kết quả phân tích độ đúng mẫu nguyên liệu CS ...................................64
Bảng 3. 12: Kết quả phân tích độ chính xác – độ lặp lại của mẫu nguyên liệu CS ..65
Bảng 3. 13: Kết quả phân tích định lượng mẫu nguyên liệu của kiểm nghiệm viên 1
...................................................................................................................................66

Bảng 3. 14: Kết quả phân tích định lượng mẫu nguyên liệu của kiểm nghiệm viên 2
...................................................................................................................................67
Bảng 3. 15: Thống kê kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên ........................67
Bảng 3. 16: Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp phân tích định lượng CS theo
bộ hồ sơ tiêu chuẩn chung ACTR (2008) .................................................................68
Bảng 3. 17: Các mẫu chế phẩm áp dụng quy trình phân tích định lượng bằng HPLC
...................................................................................................................................69


x
Bảng 3. 18: Kết quả định lượng mẫu thử nguyên liệu ..............................................69
Bảng 3. 19: Kết quả định lượng mẫu thử Tobicom ..................................................70
Bảng 3. 20: Kết quả định lượng mẫu thử Healthy Joint Plus ...................................70


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1: Cấu trúc hố học của một đơn vị trong chuỗi CS ......................................3
Hình 1. 2: Cấu trúc mạch của các CS .........................................................................3
Hình 1. 3: Chondroitin Sulfate A ................................................................................4
Hình 1. 4: Chondroitin sulfate B .................................................................................4
Hình 1. 5: Chondroitin Sulfate C ................................................................................4
Hình 1. 6: Bề mặt silica đã thủy phân .......................................................................10
Hình 1. 7: Tạo nhánh trên bề mặt silica ....................................................................10
Hình 1. 8: Cấu trúc của cột Octadecylsilane .............................................................10
Hình 1. 9: Cấu trúc cột LC - DB ...............................................................................11
Hình 1. 10: Cấu trúc cột có gốc isopropyl ................................................................11
Hình 1. 11: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC .......................13
Hình 1. 12: Sắc ký đồ HPLC của một hỗn hợp hai thành phần ................................14

Hình 1. 13: Sắc ký đồ HPLC thể hiện mức độ tách của hỗn hợp 2 thành phần........17
Hình 1. 14: Minh họa tương quan giữa độ phân giải và hiệu quả phân tách trong
HPLC .........................................................................................................................19
Hình 1. 15: Minh họa tương quan giữa hệ số đối xứng và hình dạng peak ..............20
Hình 3. 1: Phổ hấp thu UV của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml .....................43
Hình 3. 2: Sắc ký đồ của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml................................43
Hình 3. 3: Q trình sắc ký CS tại các nồng độ muối Natri octane sulfonic acid khác
nhau ...........................................................................................................................45
Hình 3. 4: Quá trình sắc ký CS tại các nồng độ TEA khác nhau ..............................47
Hình 3. 5: Quá trình sắc ký CS tại các giá trị pH dung dịch đệm khác nhau ...........49
Hình 3. 6: Quá trình sắc ký CS tại các tỉ lệ Đệm – ACN khác nhau ........................51
Hình 3. 7: Quá trình sắc ký CS tại các tốc độ dịng khác nhau .................................53
Hình 3. 8: Quá trình sắc ký CS tại các nhiệt độ lị cột khác nhau .............................54
Hình 3. 9: Q trình sắc ký CS tại các thể tích tiêm khác nhau ................................56
Hình 3. 10: Sắc ký đồ các mẫu từ 1 – 11 ..................................................................59
Hình 3. 11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak
của chuẩn CS .............................................................................................................61
Hình 3. 12: Sắc ký đồ peak CS tại các nồng độ trong khoảng tuyến tính.................62


1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Tổng quan về Chondroitin Sulfate (CS)
Từ thập niên 70, một số nghiên cứu của các nhà khoa học xác minh rằng sụn

cá mập có chứa các hoạt chất có khả năng ức chế hệ miễn dịch, giúp giảm nhẹ các
chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm

(eczema), luput đỏ,...[5].
Từ sụn cá mập người ta đã chiết rút ra Chondroitin sulfate (CS) - một loại
glycosaminoglycan (GAG) tạo ra từ cơ thể bằng sự phối hợp giữa glucose với
glutamine nhờ enzyme tổng hợp glucose [26]. GAG tham gia vào cấu trúc tế bào,
có trong thành phần của sợi collagen các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ lớn trong chất
căn bản của mô sụn và xương, đảm bảo cho sụn và xương không những có độ chắc
mà cịn có tính đàn hồi, đồng thời là nguyên liệu quan trọng trong tái tạo mô sụn,
xương, cải tạo chức năng xương [12]. Thêm vào đó CS cịn được tìm thấy trong
hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp. Sụn cá mập bảo vệ xương
khớp bằng cơ chế ức chế men phá hủy chất sụn trong khớp [8]. Từ đó CS cịn được
điều chế thành thuốc và sử dụng như chất bổ sung hàng ngày trong điều trị các bệnh
về xương khớp [1].
Đối với mắt, CS có tác dụng quan trọng trong cấu trúc trong suốt và đàn hồi
của giác mạc, duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của mắt. Các nhà nghiên
cứu đã cho thấy CS có trong thành phần của phim nước mắt, góp phần bảo vệ tế bào
biểu mơ giác mạc. Khi được nhỏ vào mắt, CS có tác dụng tạo nên một lớp chất nhầy
giữ cho nước mắt lưu lại trên bề mặt nhãn cầu lâu hơn, chống khô mắt. Với phát
hiện này, CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phịng ngừa và điều trị các tình
trạng khơ mắt. Ngồi ra, CS cịn được sử dụng để điều chế chất nhầy, một chất
thường dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm
bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [5].
1.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của CS
CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do
Davidson và Meyer. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là
glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polyme


2
mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 gốc đường (disaccharide) Nacetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau
(polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được

sulfate hố hay khơng bị sulfate hố [16], một số gốc GlcA bị epime hoá thành Liduronic acid (IdoA). CS là một polyme có phân tử lớn gồm 15 - 150 đơn vị cấu
trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường biến
động trong khoảng 10 – 100 kD [18].
Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các protein bằng liên kết oglycoside tạo thành một proteoglycan (PG) (glucoprotein), là hợp chất hữu cơ thuộc
nhóm mucopolysaccharide [11].
Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO4)2- của gốc đường với các nhóm carboxyl
(COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử Chondroitin sulfate có mật độ điện tích
âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein
trong cấu tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm _OH của gốc serine ở một số
protein. Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được
làm sáng tỏ. GAG được tổng hợp trong mạng nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết
của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-GalGal-GlcA, xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử
đường khác được gắn trong hệ Golgi [29].
CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao. Các điều kiện thủy
phân cũng có thể làm giảm khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được.
Mỗi phân tử đường có thể khơng bị sulfate hố hoặc bị sulfate hố 1 hay 2 lần. Đa
phần nhóm _OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate hoá, đối với một số
chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA. Q trình sulfate hố là nhờ các enzyme
sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulfate hố ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính
sinh học đặc thù của CS.
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều q
trình khác nhau như: điều hịa hoạt động của enzyme và sự bám dính, phát triển và
di thực của tế bào [20], [28], [30]. GAG cịn có chức năng cấu trúc và điều khiển
trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mơ sụn (như một
aggrecan). Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mơ tế bào nhờ có điện


3
tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào.
Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80 - 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết

và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận
nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [16].
Công thức hố học của CS (C14H21NO14S)n :

Hình 1. 1: Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS
Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H
Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2 = H, R3 = H

Hình 1. 2: Cấu trúc mạch của các CS
CS có 3 loại chính là A, B và C, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của
nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide:
CS A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở
mơ sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên Chondromucoid.
CS C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6).
CS B: acid iduronic thay thế acid glucuronic.
Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bị và lợn),
ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối ...).
Tuy nhiên CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích


4
thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n
isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hố của các cặp đường đơi
tạo nên 16 isome/mỗi cặp [25]. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ
yếu hình thành PG [29].
 Chondroitin Sulfate A ((GlcA-GalNAc-4S); CS4)

Hình 1. 3: Chondroitin Sulfate A
 Chondroitin Sulfate B ((IdoA-GalNAc-4S); CS4)
Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường

có nhiều ở da, cịn thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulfate hố ở C-4
của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hố thành iduronic acid.

Hình 1. 4: Chondroitin sulfate B
 Chondroitin Sulfate-C ((GlcA-GalNAc-6S); CS6)

Hình 1. 5: Chondroitin Sulfate C


5
CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định. Vì vậy tên gọi
của CS cũng có sự thay đổi. Ngồi ra cịn có CS D và E. Phân loại các CS được tóm
tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1. 1: Phân loại CS
Tên

Vị trí bị sulfate hố

Tên phân loại

Carbon 4 của đường -N- Chondroitin-4-sulfate (CS4);
Chondroitin sulfate A acety-D-galactosamine
(GalNAc)
Chondroitin sulfate B Carbon 4 của GalNAc ( Dermatan sulfate)

L-iduronic acid

ở người có trong: sụn khớp,
giác mạc, da, thành mạch...
Chondroitin-4-sulfate (CS4)

Chondroitin-6-sulfate (CS6);

Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc

trong thành phần của sụn và
da

Chondroitin sulfate D

Chondroitin sulfate E

Carbon 2 của glucuronic Chondroitin-2,6-sulfate
acid and 6 của GalNAc

(C2,6S)

Carbon 4 và 6 của Chondroitin-4,6-sulfate
GalNAc

(C4,6S)

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hòa tan tốt trong nước, rất
dễ hút ẩm; nhưng khơng hồ tan trong ethanol, methanol, acetone... Khối lượng
phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn,
khoảng 15  20kDa [29].
1.1.2 Nguyên liệu chứa CS
CS là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong xương sụn. Có hai loại
sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên đều
bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn
do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và

loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes). Tế bào sụn tạo
nên chất cơ bản (matrix) của sụn [16].


6
Bảng 1. 2: Thành phần chính của mơ sụn
Nước (%)

Mơ

Collagen (%)

Proteoglycan (%)

Sụn khớp

68,0 - 85,0

10,0 - 20,0 ( loại I)

5,0 - 10,0

Sụn chêm

60,0 - 70,0

15,0 - 25,0 ( loại II)

1,0 - 2,0

Bảng 1. 3: Hàm lượng CS từ các nguồn sụn khác nhau
STT

Nguyên liệu

C4S (%)

C6S (%)

Loại CS

1

Vây cá mập

9,60 ± 1,05

8,76 ± 0,96

CS6, CS4

Cá sấu

2

3
4
5

Sụn lưỡi

14,84 ± 0,38

Xương sườn

5,56 ± 0,96

13,54 ± 0,35

CS6, CS4

Xương ức

11,55 ± 0,88

10,54 ± 0,80

CS6, CS4

Cổ họng

9,51 ± 1,99

8,68 ± 1,81

CS6, CS4

Cá đuối

5,27 ± 0,91

4,81 ± 0,84

CS4, CS6

14,08 ± 2,51

3,38 ± 4,74

CS4, CS6

Xương lưỡi hái
của gà
Sụn mũi bò

11,50

CS4, CS6


7
1.2

Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High
Performance Liquid Chromatography)

1.2.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất

mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Q trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [3], [4].
1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu
tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta
có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
Khi đặt chất phân tích lên đầu cột pha tĩnh rồi cho pha động liên tục đi qua
cột chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc
ký ở đây là tổng các tương tác:
- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1).
- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2).
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3).
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trị quyết định [3], [4].
1.2.3 Phân loại sắc ký
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta
chia HPLC thành 4 loại:
- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn
- Sắc ký phân bố
- Sắc ký ion
- Sắc ký rây phân tử
Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion
có khối lượng phân tử khơng quá lớn (< 3kD) [3], [4].


8
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa
pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường và sắc ký pha đảo.

- Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha
động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. Sắc ký pha
thường dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân
tử lượng không lớn lắm.
- Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít
phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ
khơng phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon
dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo. Dung môi
sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung mơi phân cực, trong đó dung mơi
nước đóng vai trị quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, sắc ký pha đảo được ứng
dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thường.
1.2.4 Detector hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis)
Là loại detector thông dụng nhất trong HPLC. Nguyên tắc của detector này là
pha động từ cột đi ngang qua tế bào đo được chiếu một chùm tia tử ngoại hay khả
kiến. Detector này có tính chọn lọc vì chỉ phát hiện được các chất tan hấp thu tia
UV hay khả kiến như các alken, alkine, hợp chất thơm và các hợp chất có nối đa
giữa C và O, N hay S. Dung môi dùng trong trường hợp này phải hấp thu rất ít hay
khơng hấp thu tia bức xạ và chỉ được phép chứa một lượng cực nhỏ các tạp chất hấp
thu trong vùng tử ngoại.
Sự hấp thu các tia bức xạ bởi các chất tan được mô tả bằng định luật Beer –
Lambert:
A = log

IO
= . C. l
I

Trong đó:
A:

độ hấp thu (Abs)

IO và I:

cường độ tia tới và tia ló

:

hệ số tắt phân tử

C:

nồng độ chất tan (mol/l)

l:

bề dày cốc đo (cm)


9
Các detector UV – Vis có thể có bước sóng cố định hoặc hoặc biến đổi được.
Các detector có bước sóng biến đổi được sử dụng nguồn chiếu xạ là một đèn neon
deuteri và/ hoặc một sợi đèn tungsten và có thể vận hành trong vùng sóng 190 –
700nm.
Các ưu điểm của detector UV – Vis là:
- Độ nhạy khá cao, khoảng 10-6 g/ml.
- Dễ vận hành.
- Ít phụ thuộc các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ, dòng...).
- Rẻ tiền so với các detector khác.
Tuy nhiên, detector này cũng có các nhược điểm như sau:

- Chỉ phát hiện được các chất tan hấp phụ trong vùng tử ngoại gần bước
sóng của detector.
- Địi hỏi dung mơi phù hợp và tinh khiết.
1.2.5 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn
lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
- Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc
ký lỏng - lỏng.
- Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết.
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu
điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:
- Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng - lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị
mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân
tích.
- Do pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động nên người ta
không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung mơi.
Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và
phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng
này.
Bề mặt các hạt silica SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10µm) được
xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo


10
ra những nhóm –SiOH như sau (thơng thường chỉ có khoảng 8µmol –SiOH/m2 bề
mặt):

Hình 1. 6: Bề mặt silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các
organochlorosilane để tạo ra các pha tĩnh khơng phân cực, phân cực trung bình hoặc

rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.

Hình 1. 7: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2
bề mặt bị silane hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể.
Ngoài nhóm –Cl người ta cịn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực tương
tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong sắc ký pha đảo, nhóm thế R trong hợp chất siloxane hầu như khơng
phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 n-octyl), C18 (noctadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilane) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2;
ngồi ra cịn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn
nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các
loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.

Hình 1. 8: Cấu trúc của cột Octadecylsilane


11
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh cịn nhóm –OH
chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy mơi trường pH
phân tích.
Trong mơi trường q acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether ( –O–Si–
C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích khơng
cịn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường base (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa
tan (SiO2 thành silicate), hệ quả là số đĩa lý thuyết giảm và số nhánh ghép cũng
giảm, mũi rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ
mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như
trimethylchlorosilane ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazane (ít sử dụng hơn) để

tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end - capping). Lúc này ta sẽ có loại
cột ít tương tác với chất phân tích có tính base.

Hình 1. 9: Cấu trúc cột LC - DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà khơng cần
tương tác với nó là thay những nhóm metyl của –Si(CH3)2–C18 bằng những nhóm thế
lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở
tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.

Hình 1. 10: Cấu trúc cột có gốc isopropyl