Nghiên cứu chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy

803-881.
4. Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu

S., Pei P., Wang s., Ma Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao
J.,Sun F., Zhang Y.,Wu Y.,Wang s., Xiong H.,Wu X.
(2006), “Screening of common mitochondrial mutations in
Chinese
patients
with
mitochondria!
encephaiomyopathies", Mitochondrion, 7, pp. 147-150.
5. Szuhai K., Ouweiand J. M., Dirks R. w ., Lemaĩtre
M., Truffert J. c., Janssen J. M., Tanke H. J., Holme
E., Maassen J. A., Raap A. K. (2001), “Simultaneous
A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy
number quantification in Myoclonus Epilepsy and RaggedRed Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular
Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids
Research, 29(3), pp. 1-6.
6. Truong T. H., Nguyen T. V. A., Nguyen V. L„ Pham

V. A., Phan T. N. (2014), “Screening of common pointmutations and discovery of new T14727C change in
mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy
patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp. 441-448.
7. Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone
E., Bonato s., Donadoni c Torgano G., Moggio M
., Corti
S., Bresolin N., Comi G. p. (2009), “Mitochondria! DNA
G8363A mutation in the tRNA Lys gene: clinical,
biochemical and pathological study", Journal Neurol
Science, 281(1-2), pp. 85-92.
8. Zhang Y., Yang Y. L , Sun F., Cai X., Qian N., Yuan

Y., Wang z. X.,Qị Y.,Xiao J. X.,Wang X. Y., Zhang Y.
H., Jiang Y. w „ Qin J.,W u X. R. (2007), “Clinical and
molecular survey in 124 Chinese patients with Leigh or
Leigh-like syndrome", Journal of Inherited Metabolic
Disease, 30(2), pp. 265-267.

NGHIÊN CỨU CHÁN ĐOÁN DI TRUYỀN
TRƯỚC CHUYẺN PHÔI BỆNH TEO c ơ TỦY
Ths. Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học và Di truyền Yhọc, Học viện Quânỵ)
' sv. Trần Van Tuấn, SV. Đồng Phú cấu
(Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y)
BS. Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản)
Hướng dắn: PGS.TS. Trần Văn Khoa
(Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân y)
TÓM TẲT
Đặt vấn đề: Bệnh teo cơ tủy là bệnh thần kinh cơ ơo bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt trên nhiễm sắc thể số
5. Trẻ bị bệnh' teo cơ tủy thường có tiên luựng rất xấu và từ vong sơm. Vì vậy, vẩn đề phịng tránh chủ động bệnh
teo cơ tủy phải được ưu tiên hàng đầu. Mục tiêu: mục tiêu chính của nghiên cứu là xây dựng được quy trình chẩn
đốn di truyền trước chuyền phôi bệnh teo cơ tủy. Đối tượng và phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi đã được
chần đoán bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt va bố mẹ của họ; 30 mẫu té bào phơi sính
thiết từ phơi dư ngày 3; 04 gia ơình đã từng sinh con bị bệnh SMA và tự nguyện tham gia chẩn đôn di truyền
trước chuyền phơi bệnh teo cơ tủy. Kỹ thuật PCR- RFLP và minisequencing đế phát hiện đột biến gen SMNt gây
bệnh teo cơ tủy. Phương phâp nhân toàn bộ bộ gen nhằm khuếch đại bộ gen lên hàng nghìn lần. Kết quả: Kỹ
thuật PCR- RFLP đã được chuẩn hóa để phát hiện đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100%.
Kỹ thuật này cũng có hiệu quả nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phôi sinh thiết là 93,33%. Xây dựng đuực
quỵ trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va
minisequencing. Áp dụng quy trình xây dựng được đối với 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di
truyền bệnh teo cơ tủy trước chuyển phơi và có 03 phơi đã được chuyển, một cặp vợ chồng đã sinh được một em
bé khỏe mạnh, một cặp đang mang thai. Kết luận: Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã xây dựng và áp dụng
được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo cơ tủy bằng cách sử dụng đồng thời hai kỹ thuật

PCR-RFLP và minisequencing.
Từ khóa: Bệnh teo cơ tủy.
SUMMARY
PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY
Nga Nguyen Thi Thanh*, Tuan Tran Van*, Cau Dong Phu* Yen Dao Hai**
(*: Military medical university; **: Coal and Mineral Hospital)
Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder.
Most o f patients are caused by the homozygous absence o f exon 7 o f the telomeric copy o f the SMN gene
(SMNt) on chromosome 5. Until now, no specific treatment for SMA, only to treat the complications o f the disease
IS crucial. SMA usually presents severe, high mortality rate. So, the SMA prevention issues should be top priority.
Denved from practical needs, we conducted the project “Preimplantation Genetic Diagnosis o f spinal muscular
atrophy" with the following objective setting up a preimplantation genetic diagnosis assay o f SMA. Materials and
Method: This study was earned out on 17 patients and their parents, 30 blastomeres were obtained from surplus

525


embryos in day 3; 04 couples were Clinical PGD o f SMA. Completing diagnostic procedures SMA genes by PCR
- RFLP and Minisequencing. Then, setting up a preimplantation genetic diagnosis protocol o f spinal muscular
atrophy on biopsied blastomeres. Results: The PCR-RFLP method was completing in fresh blood from 17
patients and their parents to detect the homozygous deletion in exon 7 SMNt gene with the PCR efficiency of
96%. The methods were also efficient, providing interpretable result in 93.33% (28/30) o f the blastomeres tested.
Four couples were treated using this method. Three normal embryos were transferred resulting in one unaffected
Ih /o h ir f h

o n W

cit l\J

n n o

w / n / o o / ỳọJ Ìr a n ni Cat ini Kr Jưj r .

K s i i t ỈỈKsCÃỈ

ir ' o í Ịi fi '/ i/ U< ỊUC f/VẠ ( nl OQ . ’

p ro

ịA /ạ
¥ * \s

c II w

th e *
iiiv

tịr tĩí
iiiu i

tr ị
is /

Q Ịir - n a o a f iiliv
O u V V /w u u » u i i j

c o i

O w i

a r t
u p

f / iA

u iu .

P r a ir n n la n t a f in n
I r

Genetic Diagnosis o f spinal muscular atrophy by using both o f the techniques o f PCR-RFLP and minisequencing
in Vietnam,
Keywords: spinal muscular atrophy.
ĐẶT VẮN ĐỀ VÀ MỤC TỈÊU
Teo cơ tuỷ (Spina! muscular atrophv - SMA) là
bệnh thần kinh cơ di truyền lặn do đột biến gen SMNt
nằm trên nhiễm sắc thể số 5. Tỷ lệ mắc bệnh SMA ià
1 / 10.000 trẻ đẻ sống và tần số người mang gen trong
cộng đồng íà 1/50. Theo cách phân loại hiện hành,
dựa vào tuổi khởi phát bệnh và mức độ biểu hiện
bệnh, bệnh teo cơ tủy chia thành 3 type, type I, type II,
type III, trong đó type ! và II chiếm tỷ lệ chủ yểu và
thường mất sớm ờ lứa tuổi đi học do những biến
chứng suy hơ hấp. Hiện nay, chưa có phương pháp
nào chữa được bệnh SMA mà chỉ đỉều trị triệu chứng
ià chủ yếu và mỗi trẻ em mắc bệnh teo cơ tủy ra đời là
gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài chính. Vì vậy,
chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chẩn đoán di
truyền trước chuyển phơi bệnh teo cơ tủy” với những
mục tiêu:

1. Hồn thiện được quy trình phất hiện đột biến gen
SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ máu toàn phần.
2. Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen
SMNt gây bệnh teo cơ tuy trên phôi thụ tinh trong ong
nghiệm.
3. Xãy dựng và ắp dụng được quy trình chẩn đoản
di truyền trước chuyển phơi bệnh teo cơ tủy cho gia
đình đã có con bị bệnh.

đo mẫỉ exon 7 2CQSMNt

(Khcmg maDg gen)

lổObp — ^

78bp

Hình 1: Hỉnh ảnh minh họa kết quả đỉện di
trên gel agarose 3% của exon 7 SMNt sáu khì ủ
với enzym Hinfl

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
- Đối tượng nghiên cứu: 17 bệnh nhi đã được Bệnh
viện Nhi Trung ương chẩn đoán bị bệnh teo cơ tủy do
mất đồng hợp tử exon 7 gen SMNt và bố mẹ của họ
(51 người), 30 mẫu tế bào phôi được sinh thiết từ
những phồi dư ngày 3, 04 gia đình đâ tự nguyện tham
gia PGD bệnh teo cơ tỏy.
- Các bước hoàn thiện quy trình phát hiện ổột biến
gen gây bệnh SMNt từ máu toàn phần.

Thu mẫu máu toàn phần từ 51 người tham gia
nghiên cứu, tách ADN, tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP
đế nhân và phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo
cơ tủy.
Kỹ thuật PCR-RFLP
+ Trình tự mồi nhân exon 7 gen SMNt: F-5’cttccttttattttccttacagggatt-3’
R-5’-gtagggatgtagattaaccttttatct-3’
+ Chu trình nhiệt: 960C trong 5 phút; [940C trong 1
phút, 540C trong 1 phút, 720C trong 1 phút] X 35 chu
kỳ; 720C trong 10 phút, ù sản phẩm PCR vởi enzym
Hinfl để phân biệt exon 7 SMNỈ với exon 7 SMNc.
Điện di gel agarose 3% kiểm tra kết quả.

Các bước xây dựng quy trình phát hiện đột biến
gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy trên phôi thụ tỉnh trong
ống nahiệm: Tiến hành nhân toàn bộ bộ gen từ 30
mẫu te bào phôi sinh thiết theo các bước hướng dẫn
của bộ kít GenomePlex® Single Ceil Whole Genome
Amplification của hãng Sigma. Lấy sản phẩm của
bước trên để tiến hành kỹ thuật PCR-RFLP nhân và
phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh.
Các bước xây dựng và áp dụng quy trình chẩn
đốn di truyền trước chuyển phơi bệnh teo cơ tủy cho
gia đình có con bị bệnh.
Ni phơi ngày 3 tiến hành sinh thiết; sau đó tiến
hành nhân tồn bộ bộ gen từ các mẫu tế bào phôi sinh
thiết theo các bước hướng dẫn của bộ kít
GenomePlex®
Single
Cell

Whole
Genome
Amplification cùa hãng Sigma; tiến hành đồng thời hai
kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing để phát hiện
đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy.
Kỹ thuật minisequencing
+ Trình tự mồi nhân exon 7 gen SMNt F-5’agactatcaacttaatttctgatca-3’
R- 5’- caccttccttctttttgattttgt-3’
+
Trình
tự
mồi
minisequencing:
5’ccttttattttcctta cag gg ttt-3 ’
Sản phẩm thu được thêm vào 1 đơn vị enzyme
SAP, ủ theo chu trình nhiệt: 370C trong 1 giờ và 750C
trong 15 phút. Điện di mao quản kiểm tra sản phẩm
chạy minisequencirtg.

526


người mang gen. Tương tự, tiến hành trên các gia
đỉnh tiếp theo và kết qua cho thấy 17 người con cua
17 gia đinh đều phát hiện mất đồng hợp exon 7 gen
SMNt, nghĩa ỉà cả 17 bệnh nhân đều bị bệnh teo cơ
tủy. Kết luận này hoàn toàn phù hợp với kết luận
chẩn đoán gen cùa Viện Nhi Trung ương. Như vậy,
chúng tơi đã hồn thiện được quy trình phát hiện đột
biến gen SMNÍ gây bệnh SMA từ máu tồn phần.

Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen SMNt
gây bệnh teo cơ tùy trên tế bào phôi

SMNc-

Người Ỉ M thường

Ngữịt bị bệnh
E xon 7 S M N

Hình 2: Hình minh họa kết quả điện di mao quản sản phẩm
nhân exon 7 gen SMNt của kỹ thuật minỉsequencing
ở vị trí nucleotid 214 trên exon 7 SMNt là c, còn
exon 7 SMNc là T vi vậy, với kỹ thuật
minisequencing, người binh ỉhường sẽ xuất hiện hai
đỉnh tương ứng G của exon 7 SMNt và A của exon 7
SMNc, người bị bệnh teo cơ tủy do mất đồng hợp
exon 7 SMNt chỉ có một đỉnh tương ứng A cùa exon
7 gen SMNc. Ngồi ra, Đề đánh gỉá xem những mẫu
tế bào phơi sinh thiết được có bị nhiễm ADN ngoại íaỉ
hay khơng, tiến hành nhân 3 polymorphic marker
D5S641, D5S1977, D5S629.
KẾT QUẢ
Hoàn thiện quy trinh phát hiện đột biến gen SMNt
gây bệnh teo cơ tuy từ máu toàn phần.

P*

P3

lO O bp

p 4

P5

E xa n 7 sen S M N
___________ A ___________

Ladder
50bp

L adder
P2

'

C

l

351

i

p

* *1

s

Hình 4: Kết quả nhân exon 7 gen SMNt từ sản phẩm
nhản tồn bọ gen của tế bào phơi: P1, P2, P3, P4, P5
tirơng ứng phôi 1, phôi 2, phôi 3, phơi 4, phơi 5

■W

lốO bp

1 0 2 bp

Ấ

78bp

Hình 3: Kết quả điện di gel agarose 3% sản phẩm nhân
exon 7 SMNt ỉừ máu toàn phần của gia đỉnh SMA1
Bệnh nhân C1 có sản phẩm nhân exon 7 gen
SMNt chỉ có 2 băng 160bp và 102bp của SMNc,
nghĩa là C1 bị mất đồng hợp exon 7 gen SMNt nên bị
bệnh teo cơ tuy. Cịn bổ B1 và Mẹ M1 đều có 3 băng
tương ứng exon 7 gen SMNt và SMNc nên họ ỉa

Trong hỉnh 4 cho thấy cả 5 mẫu tế bào phơỉ sinh
thiết từ các mẫu phơi dứ đều có 3 băng tương ứng
exon 7 gen SMNt, nghĩa ỉà cả 5 phơi đó đều bình
thường. Điều này hồn tồn phù hợp với thực tế vỉ
cả 5 mẫu tế bào phôi đó đều sinh thỉet từ những phơi
dư bỉnh thường. Tiếp tục thực hiện với các mẫu tế
bào phơi cịn lại với hiệu quả phản ứng nhân exon 7

gen SMNt từ các tế bào phôi là 93,33% (28/30).
Xây dựng và áp dụng quy trình chẩn đốn di
truyền trước chuyển phơi bệnh teo cơ tùy cho gia
đình có con bị bệnh.
Từ những kết quả đạt được ở trên, chúng tôi đã
xây dựng quy trỉnh chẩn đốn di truyền trước chuyển
phơi bệnh íeo cơ tùy thể hiện ở sơ đồ tổng quát sau:

527


Áp dụng quy trình trên cho 04 gia đình tự nguyện
tham gia nghiên cứu, kết quả như sau:
Bảng 1: Kết quả chần đốn di truyền trước chuyển
phơi cùa 04 gia đình tham gia nghiên cứu

STT

Phơi
ngày 3

Phơi binh
thưởng

Số tế bào
phơi chuyển

Kết quả

SMA1

5

4

2

Sinh em bé
khỏẹ mạnh

Phôi không phát triền

SMA2
SMA18

4

SMA19

3

Mang thai
(8 tháng)
Đang (iiỉn hành

1
2


SMNt gậỵ bệnh íeo cơ ỉủy từ tế bào phơi. Hơn nữa,

lượng mau ẤDN thu được nhiều thì mới có thề kếí hợp
giữa xét nghiệm chẩn đốn di truyền ỉrước chuyền
phôi bệnh teo cơ tủy với các xéỉ nghiệm sàng lọc bất
thường di truyền khác, từ đó góp phần làm tang tỷ lệ
ìhụ thài trong PGD,
ờ bước 2 , chúng tôi chọn giải pháp tiến hành đồng
thời hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing đe
phát hiện đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ tế
bào phôi. Một đều không thể phủ nhận là khi ỉhực hiện
hai xét nghiẹm đồng thời để so sánh đối chiếu thì kết
luận chẩn đốn đó sẽ có tính chắc chắn hơn, ổn định
hơn.
Tuy nhiên, với việc chẩn đốn đi truyền trước
chuyển phơi bệnh ỉeo cơ tủy thì điều đó vẫn chưa đủ
vì SMA là bệnh di truyền lặn, nên nếu trong auá trình
sình thiết phơi hoặc thao tác kỹ thuật khơng tổt có thể
bị nhiễm ADN từ ngoài vào (từ bố, mẹ hoạc kỹ thuật

Hiện nay, kỵ thuậỉ PCR-RFLP được dùng phổ biến
trên toàn thế giới để chẩn đoán gen bệnh teo cơ tủy,
trong đó có Việt nam, nên có íhể nói rằng kỹ thuật này
có tính chính xác và ổn định cao. Hiệu quả phản ứng
PCR nhân exon 7 gen SMNt từ các tế bào phơi trong
thí ngiệm của chúng tơi íà 93,33% (28/30). Kết quả này
cũng tương đương với kết quả công bố của một số tác
giả khác ỉrên thế giới (bảng 2 ):
Bảng 2: Hiệu quả phản ứng PCR nhân exon 7SMNt từ tế bào phôi cùa một số tác giả trên thế giới

Tác giả

Dreesen
J. c „ và
cs. (21
Daniels
G. và cs.

Năm
công
bố

Kỹ thuật PCR
sử dụng

— So”
mẫu
Số tế
bào cỏ sản
phấm
phôi
nhân
nghiên
exon
cứu
7 gen
SMNt

Hiệu
quả
PCR

viên thao tác) thi sẽ chẩn đốn phơi bệnh íhành phơi

1998

ConsecutivePCR

25

25

100%

2001

Nested- PCR

34

31

91%

14

13

92,9%

48

45

93,8%

17

15

88,2%

[11

Moutou
c. và cs. 2003 Duplex- PCR
[5,6]
Fiorentino
Nested- PCR vả
F- và cs. 2003
minisequencing
[3]
Girardet
Multiplex- PCR
A. và các 2008
và nested- PCR
cs. [4]

Theo thống kê ở bảng trên thi các tác giả đều tiến
hành nhân exon 7 gen SMNt trực tiếp từ tế bào phơi,
do đó phải tiến hành hai vịng PCR va mỗi mẫù tể bào
phơi sinh thiếỉ được chỉ thực hiện xét nghiệm chẩn

đoán được một lần và một kỹ thuật mà thôi.
Thực tế, khi xây dựng bất cứ một quy trình chẩn
đốn nào đều phải đảm bao hai yếu tồ đọ chính xác và
độ ổn định cao. Nghĩa là, xét nghiệm chần đoán đỏ
phải cỏ sự lặp lại và nên kết hợp nhiều phương pháp
đề chẩn đoan. Vì vậy, chúng toi xây dựng quy trinh
phát hiện độí biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ tế
bào phôi qua hai bước cơ bản:
1. Nhẩn tồn bộ gen, khuếch đại bộ gen lên hàng
nghìn lần.
2 . Sử dụng sản phẩm khuếch đại toàn bộ gen iàm
mẫu, tiến hành nhân exon 7 gen SMNt bằng hai kỹ
thuật PCR-RFLP và minisequencing để chẩn đoán.
ở bước 1 , chúng tôi chọn giải pháp khuếch đại bộ
gen lên hàng nghìn íần trước khi làm xét nghiệm tiếp
vì nó có ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với việc nhân
exon 7 gen SMNt ìrực tiếp từ tế bào phơi như: Lượng
mẫu ADN thu được nhiều, có thể dùng cho rất nhiều
lần xét nghiệm và nhiều kỹ thuật khác nhau, thực tế là
chúng tôi đã tiến hành đong thời hai kỹ thuật PCRRFLP và minisequencing để phát hiện đột biến gen

thường, dẫn đến hậu quả cấy chuyển phôi bệnh. Để
tránh nhược điểm đó, chúng tơi lựa chọn 3
polymorphic marker D5S1977, D5S629, D5S641 để
đánh gia nhiễm ADN ngoại lai bởi chúng có tính đa
hinh và đặc trưng cho ca thề cao nên có thể dễ dànẹ
phân tích phơi sinh thiết được có íính di truyền từ bo
và mẹ hay khơng.
KẾT LUẬN
Đã hồn íhiện được quy trình phát hiện đột biến

gen SMNt gây bệnh íeo cơ tủy từ máu tồn phần bằng
cả hai kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing với kha
năng phát hiện cao (17/17 gia đinh).
Đa xây dựng được quy trinh phát hiện đột biến gen
SMNt gâỵ bệnh teo cơ tủy trên phôi thụ tinh trong ong
nghiệm bằng kỹ thuật PCR-RFLP và minisequencing.
Đã xây dựng đữợc và áp dụng thành cơng quy
trình chẩn đoẩn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo
cơ tủy cho 04 gia đinh: đã có 1 em bé khơng mang
gen, khỏe mạnh ra đời, 1 cặp mang ìhai được 08
ĩháng, 1 cặp đang theo dõi, từ đỏ làm giảm gánh nặng
cho gia đình và x i hội.
TAI LIỆU THAM KHẢO
1. Daniels G. et ai (2001) Six unaffected livebirths
following preimplatation diagnosis for spinal muscular
atrophy. Mol.Hum. Reprod., Vol.7, No.10 pp.995-1000.
2. Dreesen J.c. et ai (1998) Preimplantation genetic
diagnosis of spinal muscular atrophy. Mol.Hum. Reprod.,
VoL4, No.9 pp. 881-885.
3. Fiorentino F. et al (2003) The minisequencing
method: an aitemative strategy for preimpiantation genetic
diagnosis of single gene disorders. Mol.Hum. Reprod.,
VoL 9, No. 7 pp. 399-410 .
4. Girardet A. et a! (2008) Efficient strategies for
preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular
atrophy, Fertility and sterility, Vo!. 90, No. 2.
5. Moutou c. et ai (2001) Alỉele- specific amplification
for preimpiantation genetic diagnosis (PGD) of spinal
muscular atrophy. Prenatal Diagnosis, 21,498-503.
6. Moutou c. et al (2003) Duplex PCR for

Preimplantation genetic diagnosis (PGD) of spinal
muscular atrophy, Prenatai diagnosis, 23, 685-689.

529