Nghiên cứu tổng hợp L-Dopa làm thuốc điều trị Parkinson

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

NGHIÊN CỨU TỎNG HỢP L-DOPA LÀM THUỐC ĐĨÈU TRỊ PARKINSON

Đ S. Vũ Bức Hoàn*; ThS. Phạm Thị Hiền*
H ướng dẫn: PGS. TS. Thái Nguyễn H ùng Thu*
TÓM TẲT

L­dopa (3,4­dihyđrophenyl­L­alanin) là thuốc chủ yếu được dùng trong điều trị bệnh Parkinson. Nhu cầu sử dụng
L­dopa trong nước hiện nay khá cao. Tuy nhiên, L­dopa vẫn nằm trong nhóm thuốc chưa được nghiên cứu tổng hợp,
sản xuât trong nước.

Mục tiêu nghiên cứu: tổng hợp L­đopa từ L­tyrosin đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo Dược điển Anh 2009.
Nguyên liệu và phưong pháp nghiên cứu:

Nguyên liệu: L­tyrosin là sản phẩm của quá tr nh thủy phân các nguồn keratin khác nhau (lơng, sừng, tóc, móng..
Phư ng pháp nghiên cứu: Từ L­tyrosin quá trinh tổng hợp L­đopa bao gồm 4 bước: Ester hóa L­tyrosin (2) thu
được L­tyrosin methyỉ ester (9), acyl hóa (9) trong pyridin thu được 0,N­diacyl­L­tyrosin methyl ester (10), thực hiện
phản ứng chuyền vị (10) với xúc tác AIC13 trong nitrobenzen thu được (3­acetyl­4­hydroxyphenyl)­N­acety ­L­alanin
(11), thực hiện phản ứng oxy hóa và thủy phân (11) thu được L­dopa. Độ tinh khiết và cẩu trúc sản phẩm được kiểm tra
bằng nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp đo phổ (IR, MS, 1H­ NMR).

Kết quả:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp thành công L­dopa từ L­tyrosin có hàm lượng đạt tiêu chuẩn Dược
điển Anh 2009 (99,4% ­ trong khoàng giới hạn hàm lượng từ 99 đến 101% của BP 2009). cấu tĩY.c và độ tinh khiết của
các đẫn chất trung gian và sản phẩm đã được chứng minh bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng,
phổ IR, ‘H­NMR, MS.

Kết luận:

L­dopa đã được tổng hợp thành công từ L­tyrosin. Các phản ứng tổng hợp sử đụng những hóa chất ỉhơng đụng, điều
kiện thực hiện phản ứng không quá phức tạp, phù hợp với điều kiện Việt Nam. V vậy, việc ứng dụng vào sản xuất của
nghiên cửu này có tính khả thi ở Việt Nam.

* Từ khóa: 3,4­dihyđroxyphenyl­L­alanin; L­dopa; levođopa; L­tyrosin; Parkinson.

Reearch on preparation ofL -d o pa fo r treatment o f Parkison’s disease

Summary

L­DOPA (3,4­dihydroxyphenyl­L­alanine) is an effective therapeutic agent in the treatment of Parkinson’s disease.
The requirement of L­DOPA is very high. But there is neither Vietnamese pharmaceutical factory nor other studies on
synthesizing it in Vietnam..

Objective

The aim of this study is to synthesize L­DOPA which product’s content is within the recommended range of BP
2009 from L­tyrosine.

Materials and methods:

Material synthesizing of L­ĐOPA is L­tyrosine, a product obtained from hydrolysis of different sources of keratin
(nail, hair, horn...).

Process for synthesizing L­DOPA from L­tyrosine involves 4 steps: (i) Esterification of L­tyrosine to produce L­
tyrosine methyl ester (2); (ii) Acylation of 2 in pyridin gave 0,N­diacetyl­L“tyrosine methyl ester (3); (iii) Arrangement
reaction of 3, catalysts AỈCI3 to produce B­(3­acetyl­4­hydroxyphenyl)­N­acetyl­L­alanine (4); (iv) Oxidation and
hydrolysis4afforded L­DOPA. The structure of the intermediate derivatives and L­DOPA were confirmed by IR, lH­
NMR, MS spectroscopy.

Results:

In this study, L­DOPA has been successfully synthesized from L­tyrosine, the product’s content is 99.4% (within

the requirement range of BP 2009 from 99.0 to 101.0%). The structure of the intermediate derivatives and L­DOPA
were confirmed by IR, ‘H­NMR, MS.

* Đại học Dược Hà Nội

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

Conclusion:

L­DOPA have been synthesized from L­lyrosine. These reactions used the common chemical substance. The
condition of reaction was not complex, which is suitable for reality in Vietnam. Thus, the application this study on
manufacturing in Vietnam is very feasible.

* Key words: 3,4­dihydroxyphenyl­L­aIanin; L­dopa; levodopa; L­tyrosin; Parkinson’s disease.
ỉ. ĐẶT VẨN ĐẺ

Bệnh Parkinson là bệnh lý thối hóa thần kinh trung ương thường gặp ở bệnh nhân > 60 tuổi. Bệnh gây ra
do sự mất các nơron trong chất đen ở thân não, các nơron này chứa các chất dẫn truyền thần kinh là
dopamin. Nguyên nhân: độc chất, mơi trường... L­đopa là tiền chất được chuyển hóa thành dopamin nhờ
enzym dopa­decarboxylase. Ở Việt Nam, L­đopa vẫn được coi là thuốc chủ chốt trong điều trị Parkinson. Do
đó, nhu cầu sử dụng L­dopa rất cao. Tuy nhiên, các doanh nghiệp trong nước vẫn chưa thể sản xuất được L­
dopa. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp L­dopa từ L­tyrosin (một sản phẩm thu được từ quá tr nh thủy
phân các nguồn keratin khác nhau: sừng, tóc, móng.. .)• Đó ỉà nguồn nguyên liệu có sin ở Việt Nam.

II.

NGUYÊN

LIỆ U

VÀ

PHƯ Ơ N G PH ÁP NG HIÊN

c ứ u

2.1. Nguyên liệu

L­tyrosin ỉà sản phẩm của quá tr nh thủy phân các nguồn keratin khác nhau (lông, sừng, tóc, móng...).
H a chất: Aceton, acid hydrocloric, acid sunfuric, ethanol tuyệt đối, ether dầu hỏa, ethyl acetat,
methanol, natri hydroxiđ, ninhyđrin, pyridin (tinh khiết hóa học ­ Trung Quốc), anhydriđ acetic, hydro
peroxiđ, natri carbonat khan, nhôm clorid khan, nitrobenzen (Merck­Đức), giấy chi thị màu, nước cất (Tiêu

chuẩn cơ sở ­ 'Việt Nam).

2.2. Phương ph áp nghiên cứu

Tổng hợp L­dopa từ L­tyrorin qua 4 giai đoạn như sơ đồ sau [1,2, 5]:

.COOH _COOMe

A cjO/ pyridin

NH2 *

l(MOcCMh AcO

COOMe
NHAc
(ỈO)

COOH

HCi/CHjCOOH
HO

COOH

H ,0 ,/N a0H

AiCIj/nitrobenzen
100 ­ 125cC/4­6h

COOH
NHAc

COM e

­ Sử đụng các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tinh chế và thu lấy các chất trung gian và sản phẩm.
­ Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng silicagel
GF254 với hệ dung môi n­butanol: acid acetic: nước ss 9:2:2,5).

­ Xác định cấu ưúc các chất trung gian và sản phẩm bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) đượe ghi
trên máy Perkin Elmer (Mỹ). Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy máy Agilent 6310 Ion Trap (Đức).
Phổ khối lượng phân giải cao được ghi trên máy FT­ICR­MS­Varian 910MS (Đức). Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (1H­NMR) được ghi trên máy được ghi ứên máy Bruker AV­500 (Mỹ).

­ Kiểm tra hàm lượng L­dopa theo tiêu chuẩnD ượcđiển Anh

2009.

III. K ẾT QUẢ

Tổng hợp L-dopa từLrtyrosỉn
Tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9)

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

trong nước, điều chỉnh pH về 8­ 9 bằng dung dịch Na2C03 bão hịa, xuất hiện tủa. Lọc thu được tủa thơ 9.
Tinh chế tủa thơ 9: hịa tan trong dung dịch HC1 IM, làm lạnh và điều chỉnh pH=8­9 bằng dung dịch
Na2C03 bão hòa, xuấỉ hiện tủa. Lọc, rửa sản phẩm thu được 10,86g (2) H­67,2%.

Sản phẩm: Nhiệt độ nóng chảy 134"136oC, Rf=0,45, IR (KBr, cm­1): 3208 (­NH2), 3100­3010 (~CH
thơm), 2833 (H3C­), 1731 (­C =0 ester).

Tổng hợp ỡ, N-diac tyl-L-tyrosin m thyl

ester

(10)

Lấy 18,0ml pyridin cho vào b nh cầu 2 cổ dung tích lOOml. Nghiền nhỏ 5,85g 9 (30,0 mmol) cho vào
dung mơi đã chuẩn bị ở trên. Sau đó nhỏ từ từ 8,5ml anhydrid acetic (90,0 mmol) vào hỗn hợp trên cho đến
khi nguyên liệu 9 tan hết sao cho nhiệt độ không quá 25oC. Khuấy tiếp khối phản ứng ở nhiệt độ này trong 5
giờ. Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn họp phản ứng 100,Oml ethyl acetat. Khuấy rồi chiết vói dung dịch
HC1 IM (3 lần, mỗi lần 70,0ml) để loại pyr din. Cuối cùng, rửa bằng nước thu được pha hữu cơ chứa sản
phẩm. Làm khan bằng 10,Og natri sulfat khan. Sau đó, cất thu hồi đung môi đến khi thu được dạng siro.
Thêm lOml ethylacetat và khuấy cho tan hồn tồn, sau đó thêm ÍOml ether dầu hỏa, khuấy thu được kết tủa.
Lọc, sấy thu được 6,2g tủa thô 10.

Tủa thô 10 được tinh chế như sau: Hịa tan hồn tồn 6,2g tủa thơ 10 trong 50ml ethanol 50% sơi, khuấy
15 phứt, sau đó làm lạnh. Để kết tinh lạnh qua đêm, xuất hiện tinh thể màu trắng. Lọc, sấy tới khối lượng
không đổi thu được 4,2g 10 tinh khiết.

Sản phẩm 10: Nhiệt độ nóng chày 105­107oC, Rf = 0,88, IR (KBr, cm­1): 3256 (~ NH ­amid), 1745
(­0 = 0 ester), 1633 ( ­ 0 0 amidx 1558 (­O C ­ thơm), ESI ­ MS (m/z): 301,6 C[M+Na]+).

Tồng hợpjì-(3-acetyl~4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin

Cho vào b nh cầu 1 cổ, dung tích 100ml: 3,0g (10,75 mmol) nguyên liệu 10 và 36,0ml nitrobenzen.
Khuấy cho tan hết. Sau đó, thêm vào b nh cầu 3,6g (26,96 mmol) A1CỈ3 khan, hỗn hợp được đun trong
khoảng 4h ở nhiệt độ 100­I30oC.

Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh, thêm 60,0ml nước đá. Khuấy trong 15 phút tạo hỗn dịch. Thêm tiếp
6,0mỉ HC1 đặc. Khuấy trong 30 phút. Chiết hỗn hợp 2 lần bằng ethy acetat (lần 1 với 100,0ml, lần 2 với
70,0mỊ). Thu lấy dịch chiết pha hữu cơ. Chiết pha hữu cơbằngNaOH 2N hai lần (lần 1 ll,Oml, lần 2 3,0ml).
Thu lấy dịch chiết pha nước. Loại nitrobenzen còn lẫn trong pha nước bằng 30,0 ethyl acetat. Sau đó pha
nước được làm lạnh về 5oC và được điều chỉnh về pH 1 bằng HCI đậc. Đê lạnh 2h, 11 bắt đầu kết tinh. Lọc,
rửa với nước lạnh thu được tủa ỉ 1. sấy khô tủa thu được l,25g họp chất 1i. Hiệu suất 43,87%.

Sản phẩm 11: nhiệt độ nóng chảy 146­148oC, Rf = 0.61; ĨR (KBr, cm­1): 3355 (~NH­amid), 1726 (~c=0

ester), 1641 (~c=0 amid), 1554 (­C=C­ thơm), ESI­MS (m/z): 263,9 ([M­H]­). 1H­NMR (500 MHz, DMSO)
5 (ppm): 11,82 (1H, s, HO), 8,19 (1H, d (J = 8,0), HN), 7,75 (1H, d (J = 2,0); H­C2’), 7,39 (1H; dd (J = 8,0,
2,0), H­C6'), 6,87 (1H, d (J = 7, 5), H­C5’), 4,39 (IH , m, HC ­ COOH), 3,02 (1H, dd (J = 13,5, 4,5), Hb­C3),
2,82 (1H, m, Ha~C3), 2,62 (3H, s, H3C­CO­Ar), 1,78 (3H, s, H3C­CO­NH).

Tổng họp L-dopa

Hịa tan l,5g (5,66 mmol) ngun liệu 11 írong 13,0ml đung dịch NaOH IN. Thêm từ tự đung dịch H 202
7,1%. Phản ứng được duy tr ờ nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Hỗn họp phản ứng được acid hóa bằng 2,16mỉ
dđ HC1 IN, sau đó được cất đến kiệt. Chất rắn được hồ tan với aceton nóng, phần muối vô cơ không tan
được lọc qua phễu lọc thủy tinh. Dịch lọc được cất đến kiệt một lần nữa thu được tủa thơ 12.

Hợp chất 12 được hịa tan trong 12,0ml hỗn hợp HC1 đặc và acid acetic băng với tỷ lệ thể tích CH3COOH
băng/HCi đặc = 2/1. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở 118oC trong vòng 2 giờ. c ấ t loại bỏ bớt acid và
thêm 10 phần nước sôi. Dung dịch được thêm 0 ,lg Na2S203 và 0,3g than hoạt để tẩy màu trong vòng 30
phút. Lọc loại bò than hoạt, dịch lọc được làm lạnh ở OoC và đưa về pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu
được 1. Tủa thô 1 được iọc và rửa sạch với nước lạnh, sau đó với aceton. Sản phẩm được sấy khô trong chân
không đến nhiệt độ không đổi.

^ Tinh chế sản phẩm: tủa thô được hịa tan trong acid HCI 32%, sau đó hỗn họp được làm nóng và tẩy màu
băng lg than hoạt. Lọc nóng, ỉàm lạnh dịch lọc về 5oC rồi điều chỉnh pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu
được 0,9g 1. Hiệu suất 80,6%

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

L­dopa: nhiệt độ nóng chảy 275­276oC, R f = 0,45, IR (KBr, cm­1): dải hấp thụ 3600­3000 (phenol­OH
và ­NH2), 3076 (­CH thơm), 1730 (­C =0 aciđ), 1570 (­C=C­ thơm), 1254 (­CO­ phenol); ESI­MS (m/z):

198 ([M+H]+); Cơng thức phân tử: C9H Í1N 04.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton: 1H­NMR (500MHz, D 20+C F3C 00D ); 5 (ppm): 6,65 (1H, d (J =

8,0), H­C5'), 6,57 (1H, d (J = 1,5), H­C2'), 6,49 (1H, đd (J = 8,0, 1,5), H­C6’), 4,04 (1H, dd (J = 7,0, 5,5), H­

C2), 3,00 (ỈH , dđ (J = 14,5, 5,0), Hb­C3), 2,87 (1H, dd (J = 14,5,11,5) Ha­C3).

Giá ưị 5 (ppm) của đồng phân D­dopa trên phổ 1H­ NMR [3]: 6,99 (d, J = 8,0), 6,93 (s), 6,83 (d, J =58,0),
4,43 (đđ, J = 7,2, 5,6), 3,32 (dd, J = 14,4, 5,6) and 3,20 (đd, J = 14,4, 7,2). Từ các dữ liệu thu được sau khi
phân tích phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể khẳng định sản phẩm thu được
là LD hay (S)­2­amino­3­(3,4­dihydroxyphenyỉ)propanoic.

Kiểm tra L-dopa đạt tiêu chuẩn Dược M n A nh 2009

Kết quả: hàm ỉượng L­đopa đạt 99,4% (đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 từ 99,0­101,0%),
IV. BÀN LUẬN

­ Phản ứng tổng hợp điacyl từ L­tyrosin methyl ester: Khi tỷ lệ mol anhyđrid acetic: L­tyrosin methyl
ester tăng th hiệu suất phản ứng tăng. Nguyên nhân có thể ià đo: phản ửng diacyl nên tỷ lệ mol tối thiểu là
2/1, khi tăng tỷ lệ mol lên 2,25/1 th hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống. Tăng tiếp tỷ lệ này,
hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể.

­ Phản ứng tổng hợp 11 từ nguyên liệu điacyl: Phản ứng được xúc tác bởi lượng thừa acid Lewis (AỈC13),
do có sự h nh thành phức với cả nguyên liệu và sản phẩm. Một trong những điều kiện để acid Lewis phát huy
tác dụng là phản ứng phải thực hiện dưới điều kiện khan nước. Sự hiện diện của một lượng nhỏ nước làm
ngưng phản ứng do acid Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức VỚ nước và bị phân hủy. V vậy, phản ứng cần được
thực hiện trong dung môi hữu cơ khan nước, dung môi sử đụng là nitrobenzen, xúc tác A1C13 khan, hóa chất
và thiết bị cần được làm khô trước khi phản ứng [4].

­ Trong các nghiên cứu về phản ứng thủy phân 12 đến 1, các tác giả đều sử dụng tác nhân là HBr 48%.
Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân này th phản ứng xảy ra mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gấy ra khó
khăn khi tinh chế sản phâm. V vậy chúng tôi đã thay thế HBr bằng hỗn hợp acid với tỷ ỉệ thể tích HC1 đặc:
acid acetic băng (1:2) th phản ứng xảy ra tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế.

V. KẾT LUẬN

Chúng tôi đã xây dựng được quy tr nh tổng hợp L­dopa từ L­tyrosin đạt tiêu chuẩn về định tính và định
ượng theo Dược điển Anh 2009. Hiệu suất chung của cả quy tr nh đạt khoảng 18,37%, trong đó phản ứng
chuyển vị Fries để tổng hợp 4 có hiệu suất thấp nhất (50,7%). Quá tr nh phản ứng khơng có sự racemic hóa.

Trong nghiên cứu này, chúng tội đã tổng hợp được L­dopa từ L­tyrosin. Quá tr nh tổng hợp L­đopa gồm
các giai đoạn: Ester hóa L­tyrosin với methanol thu được L­tyrosin methyl ester (9); Acyl hóa 2 trong pyridin
thu được 0,N­diacetyl­L­tyrosin methyl ester (10); Thực hiện phản ứng chuyển vị 10 với xúc tác AIC13 thu
được (3­acetyM­hyđroxyphenyỊ)~N­acetyI­L~alanin ( ỉl ); oxy hóa và thủy phân 11 thu được L­dopa. cẩu
trúc của sản phẩm và các chât trung gian được khẳng định bằng các phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR),
phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng íừ hạt nhân 1H­NMR. L­dopa tổng hộfp được có hàm lượng 99,4%
(đạt tiêu chuẩn Dược điền Anh 2009).

TÀI LIỆU TH AM KHẢO

1. Bernardi L., Golfredo o. (1973), Proccss for the preparation of L­dopa., The Unites States Patent and Trademark
Office, US 3717673.

2. Brađy w . T. (1957), The synthesis of O­methyl­N­acetyl­L­tyrosine, California Institute of Technology.

3. Chen F. Y., Uang B. J. (2001), "Enantioselective Synthesis of (R)­3­(3, 4­Dihydroxypheny ) alanine from tert­
Butyl Glycinate", The Journal of Organic Chemistry, 66(10), pp. 3650­3652.

4. Ogata Y. Tabuchi H. (1964), "A study on the mechanism of Fries reaction", Tetrahedron, 20(7), pp. 1661­1666.
5. Wolcke u., Bretschneider H. Hohenlohe­Oehringen K„ Kaiser A., (1973), "Eine neue Synthese des 3­[3,4~
Dihydroxy­phenyl]­L­alanins (L­DOPA) aus L­Tyrosin”, Helvetica chimica acta, 56(8), pp. 2857­2860.

</div>

<!--links-->