Luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng Acetylcholinesterase của một số loài trong họ Thạch tùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HĨA HỢP CHẤT KHÁNG
ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỢT SỐ LOÀI
TRONG HỌ THẠCH TÙNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HĨA HỢP CHẤT KHÁNG
ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỢT SỐ LOÀI
TRONG HỌ THẠCH TÙNG

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 62720410

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CƠNG LUẬN
TS TRẦN MẠNH HÙNG

TP. HỒ CHÍ MINH, năm 2020


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu
được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở
bất kỳ nơi nào.

Tác giả luận án


i

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT ............................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi
DANH MỤC SƠ ĐỒ .............................................................................................. viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... viii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1.

TỔNG QUAN .....................................................................................3

1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ..........................................................3
1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ...........................................7
1.3. CÁC PHƯƠNG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH
HUPERZIN A .......................................................................................................18
1.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................20
1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ
ACETYLCHOLINESTERASE ............................................................................22
1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ ..............................23
1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG ..............................25
Chương 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................27

2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU ...........................................................................27
2.2. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU ........................................................................27
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................28
2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...............................................29
2.4. CỠ MẪU ........................................................................................................29
2.5. XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ...........................................................................30
2.6. DUNG MÔI - HÓA CHẤT - TRANG THIẾT BỊ .........................................30
2.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................31
Chương 3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................51

3.1. KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC .....................................................................51
3.2. TÁC DỤNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC
LOÀI THẠCH TÙNG ..........................................................................................58
3.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ............................................................................61

3.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................................82


ii
3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC
LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC..................................................88
3.6. NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA THẠCH
TÙNG NGHIÊN .................................................................................................104
Chương 4.

BÀN LUẬN .......................................................................................106

4.1. VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC ........................................................................106
4.2. VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE IN
VITRO CỦA CÁC LỒI THẠCH TÙNG .........................................................110
4.3. VỀ MẶT HĨA HỌC ...................................................................................112
4.4. VỀ MẶT THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ................................................119
4.5. VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG
DƯỢC LIỆU .......................................................................................................121
4.6. VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC ....................................................125
KẾT LUẬN .............................................................................................................129
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................132
TÀI LIỆU THAM KHẢO


iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT
Từ viết tắt Tiếng Anh

Tiếng Việt

AChE

Acetylcholinesterase

AD

Alzheimer's Disease

BuChE

Butylcholinesterase

CC

Column Chromatography

COSY

Correlation Spectroscopy

DCM

Dicloromethan

Bệnh Alzheimer's
Sắc ký cột

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DEPT

Distortionless
Enhancement
Polarization Transfer

DTNB

5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic

EtOAc

Ethyl acetat

FDA

by

Cơ quan quản lý thực phẩm
dược phẩm Hoa Kỳ

Food and Drug Administration

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC

High Pressure Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng cao áp

HRMS

High Resolution Mass Spectrometry

Khối phổ phân giải cao

HSQC

Heteronuclear
Correlation

IC

Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế

IR

Infrared

Hồng ngoại

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

Multiple

Quantum

Sắc ký lớp mỏng

SKLM
UV
PCRS

Ultraviolet

Tử ngoại

Primary Chemical Reference Standard

Chất đối chiếu hóa học sơ
cấp

SCRS

Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ
cấp

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................29
Bảng 2.2. Thành phần một mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman ..................32
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khác nhau của các chi trong họ Thạch tùng ..............55
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm cao chiết MeOH và hiệu suất chiết các dược liệu
...................................................................................................................................58
Bảng 3.3. Kết quả tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm ...............................59
Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật .....................................61
Bảng 3.5. Kết quả so sánh 2 quy trình phân lập alcaloid ..........................................62
Bảng 3.6. Các phân đoạn của cột Diaion HP-20.......................................................64

Bảng 3.7. Các phân đoạn của cột sắc ký MeOH 100 % ...........................................65
Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 1 ........................................66
Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 2 ........................................68
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H, 113C và DEPT của hợp chất 3 ......................................70
Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 4................................72
Bảng 3.12. So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3 ........................................................73
Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 ...........................................................77
Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 6................................78
Bảng 3.15. Kết quả tác động ức chế AChE của các hợp chất phân lập được ...........80
Bảng 3.16. Các phân đoạn của cột R-1 .....................................................................81
Bảng 3.17. Các phân đoạn của cột R-2 .....................................................................81
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát hàm ẩm và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết ...........82
Bảng 3.19. Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của
huperzin A .................................................................................................................83
Bảng 3.20. Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC
...................................................................................................................................84
Bảng 3.21. Kết quả phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA........................87
Bảng 3.22. Kiểm tra tính phù hợp hệ thống và kết quả xác định hàm lượng huperzin
A tại 2 phịng thí nghiệm (n = 6) ...............................................................................87
Bảng 3.23. Xác định giá trị công bố .........................................................................87
Bảng 3.24. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn .......................92
Bảng 3.25. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử ............................92


v
Bảng 3.26. Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Thạch
tùng răng....................................................................................................................93
Bảng 3.27. Tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin
A ................................................................................................................................94
Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng huperzin A .....95

Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn huperzin A ....97
Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong
Râu rồng ....................................................................................................................98
Bảng 3.31. Kết quả tính toán hàm lượng huperzin A trong cây Râu rồng ...............99
Bảng 3.32. Tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của huperzin A .........................99
Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng ......................100
Bảng 3.34. Kết quả xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài trong họ Thạch tùng
.................................................................................................................................103
Bảng 4.1. Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng ...................................................107


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid .............................................8
Hình 1.2. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin ................................8
Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin ............................9
Hình 1.4. Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin .........................9
Hình 1.5. Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng .....10
Hình 1.6. Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ lồi Lycopodium
clavatum ....................................................................................................................11
Hình 1.7. Cấu trúc một số terpenoid được phân lập từ lồi Lycopodium japonicum
...................................................................................................................................11
Hình 1.8. Cấu trúc của một số flavonoid trong chi Lycopodium ..............................12
Hình 1.9. Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên ......................14
Hình 1.10. Cấu trúc của huperzin A..........................................................................15
Hình 3.1. Các lồi Thạch tùng nghiên cứu ...............................................................54
Hình 3.2. So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 56
Hình 3.3. So sánh đặc điểm vi phẫu thân của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng
...................................................................................................................................57

Hình 3.4. So sánh đặc điểm vi phẫu lá của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 58
Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình 1 và quy trình 2 ......................62
Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn MeOH 100 % ...................................................64
Hình 3.7. Cơng thức cấu tạo của huperzin A ............................................................67
Hình 3.8. Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68
Hình 3.9. Cơng thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A) ..............................69
Hình 3.10. Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A) ...............................69
Hình 3.11. Cơng thức cấu tạo của acetylaposerratinin .............................................71
Hình 3.12. Cơng thức cấu tạo của huperzinin ...........................................................72
Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid ...........................................................75
Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion .......................................................75
Hình 3.15. Cơng thức cấu tạo của lycocernuin .........................................................76
Hình 3.16. Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid .........................79
Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A.........................80
Hình 3.18. Sắc ký đồ các phân đoạn cột R-1 ............................................................81


vii
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn huperzin A ..........................................83
Hình 3.20. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát dung dịch đệm ....................................88
Hình 3.21. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm ......................88
Hình 3.22. Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c)
thời gian xuất hiện pic chuẩn nội ..............................................................................89
Hình 3.23. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát sự ảnh hưởng của pH .........................89
Hình 3.24. Khảo sát pH theo độ phân giải (a) và theo cường độ dịng (b) ...............90
Hình 3.25. Điện di đồ của mẫu thử khảo sát điện thế ...............................................90
Hình 3.26. Khảo sát điện thế theo (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển ........90
Hình 3.27. Diện di đồ của mẫu thử khảo sát phương pháp chiết ..............................91
Hình 3.28. Điện di đồ mẫu thử chiết huperzin A trong Thạch tùng răng bằng MeOH
lần thứ 4 .....................................................................................................................91

Hình 3.29. Phổ UV huperzin A trong mẫu thử và mẫu chuẩn ..................................92
Hình 3.30. Điện di đồ các mẫu trắng (a), chuẩn (b), thử (c), thử thêm chuẩn (d) ....93
Hình 3.31. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của
huperzin A .................................................................................................................94
Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát pha động MeOH - acid
phosphoric 0,1 % (18:82) ..........................................................................................96
Hình 3.33. Sắc ký đồcủa mẫu thử khảo sát dung mơi chiết ......................................96
Hình 3.34. Sắc ký đồ dịch chiết MeOH lần thứ 4 của mẫu thử ................................97
Hình 3.35. Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát tính chọn lọc .................98
Hình 3.36. Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của huperzin A ..........99
Hình 3.37. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia phlegmaria .......................................101
Hình 3.38. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia carinata ............................................101
Hình 3.39. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia fordii ................................................101
Hình 3.40. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia tetrasticha ........................................102
Hình 3.41. Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia serrata ..............................................102
Hình 3.42. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium complanatum...............................102
Hình 3.43. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium clavatum ......................................102
Hình 3.44. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium casuarinoides ..............................103
Hình 3.45. Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodiella cernua ........................................103
Hình 4.1. Cơng thức cấu tạo của huperzin A và huperzinin ...................................115
Hình 4.2. Công thức cấu tạo của lycosquarosin A và acetylaposerratinin .............117


viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Vị trí phân loại của Lycopodiaceae……………………………………….3

Sơ đồ 2.1. Quy trình nghiên cứu ...............................................................................28
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thử nghiệm mơ hình mê cung bơi..................................................50

Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Râu rồng .........63
Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên
...................................................................................................................................74

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Kết quả thử nghiệm tránh né thụ động (n = 5) .....34. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2
(vùng 2,4-5,2 ppm)


PL.35

Phụ lục 35. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2(vùng 1,2-4,0
ppm)


PL.36

Phụ lục 36. Phổ COSY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 2,0-4,0
ppm)


PL.37

Phụ lục 37. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,5
ppm, vùng 20-200 ppm)


PL.38

Phụ lục 38. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,4-3.2

ppm, vùng 140-205 ppm)


PL.39

Phụ lục 39. Phổ HMBC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,0
ppm, vùng 20-80 ppm)


PL.40

Phụ lục 40. Phổ HSQC (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2


PL.41

Phụ lục 41. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2


PL.42

Phụ lục 42. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-3,4
ppm)


PL.43

Phụ lục 43. Phổ NOESY (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 2 (vùng 1,0-5,0
ppm)

PL.44

Phụ lục 44. Phổ HRMS của hợp chất 3


PL.45

Phụ lục 45. Phổ 1 H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 3


PL. 46

Phụ lục 46. Phụ lục 37. Phổ 1 H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của hợp chất 3 (vùng 𝜹𝑯 2,6-4,0 ppm)


PL. 47

Phụ lục 47. Phổ 1 H-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của chất 3 (vùng 1,7-2,5 ppm)


PL. 48

Phụ lục 48. Phụ lục 39. Phổ 13 C-NMR (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) của chất 3