Luận án tiến sĩ nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------

NGUYỄN HỮU KIÊN

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ
PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN
Ở CÂY HỌ ĐẬU

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------

NGUYỄN HỮU KIÊN

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ
PHIÊN MÃ NAC ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN HẠN
Ở CÂY HỌ ĐẬU
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng
2. TS. Trần Phan Lam Sơn

HÀ NỘI - 2020
ii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Trần Phan Lam Sơn. Các kết quả
trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được cơng bố trong các Tạp
chí khoa học quốc tế và đã được sự đồng ý của tất cả các tác giả trong các bài
báo, và chưa từng được sử dụng để cơng bố trong các cơng trình nghiên cứu để
nhận học vị nào khác. Tất cả trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2020

TÁC GIẢ

Nguyễn Hữu Kiên

i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn chương trình đào tạo hợp tác
quốc tế IPA (International Program Associate) liên kết giữa Viện Khoa học
Nông nghiệp Việt Nam (VAAS, Việt Nam) và Viện Nghiên cứu RIKEN Nhật
(Bản) đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ trong suốt q trình học tập, thực hiện
và hồn thành luận án.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
(Ngun Giám đốc Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật –
Viện Di truyền Nông nghiệp) và TS. Trần Phan Lam Sơn (Trưởng Nhóm nghiên
cứu về con đường dẫn truyền tín hiệu (nay đổi tên thành Nhóm nghiên cứu về đáp
ứng với yếu tố bất lợi) thuộc Trung tâm Khoa học về nguồn tài nguyên bền vững,
Viện RIKEN, Nhật Bản) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
để tôi thực hiện và hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các postdoc, kỹ thuật viên và nhân viên trong
nhóm nghiên cứu của TS. Trần Phan Lam Sơn, nơi tôi thực hiện các nội dung
của luận án đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện vể thời gian cho tơi hồn
thành cơng trình nghiên cứu này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Đào tạo Sau đại học, thuộc Viện
Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo
điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận án nghiên cứu.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình đặc biệt bố mẹ, anh chị và vợ ln
ủng hộ, động viên, khích lệ và là chỗ dựa về tinh thần cho tơi trong suốt q
trình học tập và hoàn thành luận án nghiên cứu. Ngoài ra, tôi cũng gửi lời cảm
ơn tới bạn bè và đồng nghiệp đã ln ủng hộ và có những ý kiến đóng góp q
báu để tơi có thể hồn thành luận án nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2020
TÁC GIẢ

Nguyễn Hữu Kiên
ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... x
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ xii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án............................................................ 2
2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 2
2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án............................................ 3
3.1. Ý nghĩa khoa học.................................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................. 3
4. Những đóng góp mới của luận án........................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 6
1.1. Hạn hán và những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng ......6
1.1.1. Những thiệt hại của ngành trồng trọt do hạn hán gây ra ............. 6
1.1.2. Hạn hán và nguyên nhân gây ra hạn hán ở cây trồng ................ 11
1.1.3. Ảnh hưởng của hạn đối với cây trồng .......................................... 12
1.1.3.1. Ảnh hưởng của hạn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng...13
1.1.3.2. Ảnh hưởng của hạn tới đặc điểm hình thái và giải phẫu ............ 14
1.1.3.3. Ảnh hưởng của hạn tới mối quan hệ giữa cây và nước ............... 15
1.1.3.4. Ảnh hưởng của hạn tới quá trình quang hợp .............................. 15

1.1.3.5. Ảnh hưởng của hạn tới q trình hơ hấp..................................... 17
1.1.3.6. Ảnh hưởng của hạn tới sự hấp thu dinh dưỡng khoáng .............. 18
1.1.3.7. Ảnh hưởng của hạn tới sự cân bằng hormone............................. 18
1.1.3.8. Ảnh hưởng của hạn tới hàm lượng protein, axit amin và khoáng chất...19
iii


1.1.3.9. Ảnh hưởng của hạn tới lipid ........................................................ 22
1.1.3.10. Ảnh hưởng của hạn tới q trình oxy hóa ................................. 22
1.1.3.11. Ảnh hưởng của hạn tới các phân tử........................................... 23
1.2. Sự đáp ứng của cây trồng với hạn ..................................................... 24
1.3. Vai trị của yếu tố phiên mã NAC trong q trình đáp ứng với
stress hạn của cây trồng ............................................................................ 27
1.3.1. Tổng quan yếu tố phiên mã NAC ..................................................... 27
1.3.2. Cấu trúc đặc trưng của các protein NAC ........................................ 29
1.3.3. Chức năng của yếu tố phiên mã NAC trong quá trình đáp ứng với hạn
ở cây trồng .................................................................................................... 29
1.4. Vai trò của cây họ đậu ........................................................................ 35
1.4.1. Vai trò của cây đậu tương ............................................................. 35
1.4.2. Vai trò của cây đậu gà ................................................................... 37
1.4.3. Ảnh hưởng của hạn tới cây đậu tương và đậu gà........................ 39
1.5. Cải thiện khả năng chống chịu hạn của cây họ đậu sử dụng kỹ
thuật chuyển gen ........................................................................................ 43
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 47
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 47
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 47
2.1.2. Các chủng khuẩn, nấm men và vector ......................................... 47
2.1.3. Các cặp mồi được sử dụng cho PCR và qRT-PCR ...................... 47
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47
2.2.1. Thời gian nghiên cứu .................................................................... 47

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 48
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 48
2.3.1. Trồng và xử lý cây đậu tương ................................................... 48
2.3.2. Tách chiết, tinh sạch RNA và tổng hợp cDNA cho tách dòng gen
GmNAC085................................................................................................ 48
2.3.3. Thiết kế cấu trúc vector và phân tích khả năng hoạt động phiên mã
của GmNAC085 trong nấm men .............................................................. 49
iv


2.3.4. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen GmNAC085 trong cây mơ
hình Arabidopsis ...................................................................................... 50
2.3.5. Phương pháp biến nạp và sàng lọc cây Arabidopsis chuyển gen
35S:GmNAC085 ....................................................................................... 52
2.3.6. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 35S:GmNAC085 bằng kỹ
thuật lai southern blot .............................................................................. 53
2.3.7. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các cây Arabidopsis chuyển
gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện thường ........................................ 53
2.3.8. Phương pháp đo hàm lượng diệp lục ở lá .................................... 54
2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen
35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn ............................................ 54
2.3.9.1. Phương pháp đánh giá hạn trên cùng khay................................. 55
2.3.9.2. Phương pháp cân trọng lượng cốc .............................................. 55
2.3.10. Phương pháp đo nhiệt độ bề mặt lá của cây WT và cây chuyển
gen 35S:GmNAC085 trong điều kiện xử lý hạn..................................... 56
2.3.11. Đo tỷ lệ thành phần nước, mức độ rò rỉ ion và độ ẩm đất ......... 56
2.3.12. Xác định hàm lượng malondiadehyde và khả năng hoạt động
của các enzyme chống oxy hóa ............................................................... 57
2.3.13. Phương pháp trồng, xử lý và thu mẫu của cây đậu gà .............. 57
2.3.14. Tách chiết RNA, xử lý DNAseI, và tổng hợp cDNA cho phân

tích qRT-PCR ........................................................................................... 58
2.3.15. Phân tích sự biểu hiện của các gen bằng kỹ thuật qRT-PCR ... 58
2.3.16. Tiêu chuẩn lựa chọn gen CaNAC đáp ứng hạn tiềm năng ....... 59
2.3.17. Phân tích ý nghĩa thống kê.......................................................... 60
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 61
3.1. Nghiên cứu chức năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp
ứng với điều kiện hạn ở cây mơ hình Arabidopsis ................................... 61
3.1.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và phân tích sự hoạt động phiên
mã của GmNAC085 trong nấm men ....................................................... 61
3.1.2. Kết quả phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen GmNAC085
trong cây mơ hình Arabidopsis ............................................................... 63

v


3.1.3. Kết quả sàng lọc và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển
gen 35S:GmNAC085 ................................................................................ 66
3.1.4. Kết quả đánh giá kiểu hình của cây Arabidopsis chuyển gen
35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện thường ................................ 68
3.1.5. Kết quả đánh giá khả năng kháng hạn của cây Arabidopsis
chuyển gen 35S:GmNAC085 ................................................................... 70
3.1.6. Kết quả đánh giá mức độ phá hủy tế bào và tốc độ thoát hơi nước
của các cây chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều kiện xử lý hạn .......... 72
3.1.7. Sự biểu hiện của GmNAC085 tăng cường bảo vệ cây Arabidopsis
chuyển gen chống lại phản ứng oxy hóa do stress hạn gây ra .............. 74
3.1.8. Sự biểu hiện của GmNAC085 làm tăng mức biểu hiện của các
gen chỉ thị trong cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 ở điều
kiện stress hạn .......................................................................................... 77
3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC trong cây đậu gà ở
điều kiện xử lý hạn và ABA....................................................................... 84

3.2.1. Kết quả so sánh tỷ lệ thành phần nước giữa hai giống đậu gà
Hashem và ILC482 ở điều kiện xử lý mất nước..................................... 84
3.2.2. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống Hashem và
ILC482 trong điều kiện xử lý hạn ................................................................ 85
3.2.3. Đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC ở lá và rễ của giống
Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý ABA...................................... 94
3.2.4. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC ở trong lá của 2
giống ILC482 và Hashem ...................................................................... 102
3.2.5. Sự biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC trong rễ của 2 giống
ILC482 và Hashem ................................................................................ 105
3.2.6. Lựa chọn các gen CaNAC tiềm năng cho nghiên cứu chức năng
sâu hơn ................................................................................................... 107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 113
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..115
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 116
PHỤ LỤC ...................................................................................................... 134

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Thuật ngữ tiếng anh

Thuật ngữ tiếng việt

ABA

Abscisic acid

Axit abscisic

Ade

Adenine

A-đê-nin

ABRC3

ABA response complex 3

Phức hợp đáp ứng ABA 3

AD

Activation domain

Vùng trình tự hoạt hóa

AP2/ERF

APETALA2/Ethylene response Các yếu tố liên kết đáp ứng
element binding factors

với ethylene

APX

Ascorbate peroxidase

Ascorbate peroxidase

AREB/ABF

Abscisic

acid-responsive Liên kết yếu tố đáp ứng ABA

element binding
ATP

Adenosine triphosphate

Adenosine triphosphat

bZIP

bZIP transcription factor

Yếu tố phiên mã bZIP

CAT

Catalase

Catalaza

CCA1

Circadian clock associated 1

Liên kết nhịp sinh học 1

cDNA

complementary DNA

ADN bổ sung

CO2

Carbon dioxide

cacbon điơxít

CSD1

Copper/Zinc

superoxide Copper/Zinc

superoxide

dismutase 1

dismutase 1

D

Drought

Xử lý hạn

DAD

Days after drought

Ngày sau xử lý hạn

DNA

Deoxinucleic acid

Axit deoxinucleic

DREB

Dehydration

responsive Protein liên kết với yếu tố đáp

element-binding protein
ERD1
GM

Early

ứng mất nước

to Đáp ứng sớm với bất lợi mất

responsive

dehydration stress 1

nước 1

Germination medium

Môi trường nảy mầm

vii


GR

Glutathione reductase

Glutathione reductase

His

Histidine

Histidin

IAA

Indole-3-acetic acid

Axit indole-3-acetic

LB

Lysogeny broth

Môi trường giàu dinh dưỡng
nuôi khuẩn E.coli

LEA

Late embryogenesis abundant

Sự phát triển phôi muộn

LHY

Late elongated hypocotyl

Chậm kéo dài trụ dưới lá mầm

MDA

Malondiadehyde

Malondialdehyd

MGDG

Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol

miRNA

microRNA

ARN khơng mã hóa

mRNA

Messenger RNA

RNA thông tin

MYB/MYC

MYB/MYC

transcription Yếu tố phiên mã MYB/MYC

factor
NAC

NAM (no apical meristem), Yếu tố phiên mã NAC
ATAF1/2,

CUC2

(cup-

shaped cotyledon)
NACRS

NAC recognition sequence

NADPH

Nicotinamide

adenine Nicotinamit

dinucleotide phosphate
NCED

Nine-cis-epoxy

Trình tự nhận biết NAC
adenin

dinucleotit phosphat

carotenoid Nine-cis-epoxy

carotenoid

dioxygenase

dioxygenase

O2-

Superoxide

Superoxit

OE

Overexpression

Sự biểu hiện

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

POD

Peroxidase

Peroxidase

PSI

Photosystem I

Hệ thống quang hợp I

PSII

Photosystem II

Hệ thống quang hợp II

qRT-PCR

Quantitative real-time PCR

PCR định lượng thời gian thực

viii


RD20

Responsive to desiccation 20 Đáp ứng với sự mất nước 20

RD29B

Responsive to desiccation 29B

Đáp ứng với sự mất nước 29B

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

RNAi

RNA interference

RNA can thiệp

ROS

Reactive oxygen species

Các loại phản ứng oxi hóa

RT-PCR

Reverse

RuBisCO

transcription Chuỗi phản ứng polymerase

polymerase chain reaction

phiên mã ngược

Ribuloses-bisphosphate

Ribuloses-bisphosphate

carboxylase/oxygenase

carboxylase/oxygenase

sAPX

Stromal ascorbate peroxidase Stromal ascorbate peroxidase

SD

Synthetic dropout

Môi trường nuôi nấm men

SOD

Superoxide dismutase

Superoxide dismutase

SSC

Saline-sodium citrate

Saline-sodium citrate

TF

Transcription factor

Yếu tố phiên mã

Trp

Tryptophan

Tryptophan

TRR

Transcriptional regulatory region Vùng điều hịa phiên mã

WT

Wild-type

Lồi (cây) gốc, lồi ngun
thủy, cây đối chứng không
chuyển gen
Tưới nước đầy đủ

WW

Well-watered

WRKY

WRKY transcription factor Yếu tố phiên mã WRKY

YEB

Yeast Extract Broth

Dịch chiết nấm men nuôi
khuẩn Agrobaceria

ix


DANH MỤC BẢNG
TT Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Diện tích canh tác của một số cây trồng bị ảnh hưởng

7

bởi hạn hán trên thế giới
1.2

Ảnh hưởng của hạn hán đến năng suất của các cây trồng

9

ở một số nước trên thế giới
1.3

Một số yếu tố phiên mã NAC ở cây trồng khác nhau

29

1.4

Một số gen NAC được nghiên cứu chức năng trong quá

33

trình đáp ứng với hạn hán ở cây trồng
1.5

Sản lượng đậu tương theo từng năm trên thế giới (triệu tấn)

37

1.6

Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những

38

năm gần đây
1.7

Tình hình sản suất đậu gà trên thế giới năm 2018

40

1.8

Ảnh hưởng của hạn hán đến một số giai đoạn của cây đậu

44

tương và đậu gà
1.9

Một số gen ứng viên đã được chuyển vào cây họ đậu

45

nhằm tăng cường khả năng chịu hạn
3.1

Kết quả dự đốn trình tự nhận biết NAC (CACG) trong

79

vùng promoter 1000bp của một số gen chỉ thị
3.2

Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở lá trong giống đậu

88

gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở điều kiện
xử lý mất nước
3.3

Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở rễ trong giống

90

đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở
điều kiện xử lý mất nước
3.4

Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở lá trong giống
x

96


đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở
điều kiện xử lý ABA
3.5

Mức độ biểu hiện của các gen CaNAC ở rễ trong giống

98

đậu gà chịu hạn tốt ILC482 và chịu hạn kém Hashem ở
điều kiện xử lý ABA
3.6

So sánh tỷ lệ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của

105

giống ILC482 và Hashem ở điều kiên thường, xử lý mất
nước và ABA
3.7

So sánh các mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong
rễ của giống ILC482 và Hashem ở điều kiên thường, xử
lý mất nước và ABA

xi

108


DANH MỤC HÌNH
TT Hình

Nội dung

Trang

1.1

Biểu đồ nhiệt độ trên thế giới

7

1.2

Bản đồ diện tích khơ hạn tỉnh Ninh Thuận năm 2014-2016

10

1.3

Ảnh hưởng của hạn hán tới cây trồng và cơ chế chống chịu

13

của cây trồng đối với hạn hán
1.4

Sự đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

28

1.5

Cấu trúc đặc trưng của yếu tố phiên mã NAC

30

1.6

Ảnh hưởng của hạn hán tới cây họ đậu

41

3.1

Kết quả thiết kế vector pGBKT7:TRR cho phân tích sự

64

biểu hiện ở nấm men
3.2

Kết quả phân tích khả năng phiên mã của GmNAC085

64

trong nấm men
3.3

Kết quả nhân dòng gen GmNAC085 từ thư viện cDNA

66

và PCR kiểm tra khuẩn lạc của vector tái tổ hợp
pKS:GmNAC085
3.4

Kết quả sàng lọc và lựa chọn cây Arabidopsis chuyển

68

gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 trên mơi trường GM
có chứa kháng sinh kanamycin
3.5

Kết quả phân tích southern blot của các cây Arabidopsis

69

chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2
3.6

Kiểu hình lá và thân của cây Arabidopsis chuyển gen

70

35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều kiện bình thường
3.7

Kiểu hình rễ và hàm lượng diệp lục trong lá của cây
Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và
OE2 ở điều kiện bình thường
xii

71


3.8

Kiểu hình chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển

72

gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sử dụng phương
pháp phân tích tỷ lệ cây sống sót

3.9

Kiểu hình chịu hạn của các cây 35S:GmNAC085 OE1 và

73

OE2 sử dụng phương pháp phân tích giảm sinh khối
3.10

So sánh tỷ lệ thành phần nước và mức độ dò rỉ ion của

75

cây WT và cây chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và
OE2 ở điều kiện xử lý hạn.
3.11

So sánh nhiệt độ bề mặt lá của cây WT và cây

76

chuyển gen 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 ở điều
kiện xử lý hạn
3.12

Hàm lượng Malondialdehyde (MDA) ở trong lá của cây WT

77

và cây 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau 12 ngày xử lý hạn

3.13

Hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa và mức độ biểu

78

hiện của các gen liên quan ở trong lá của cây WT và cây
35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau 12 ngày xử lý hạn
3.14

Mức độ biểu hiện của các gen liên quan tới bất lợi ở trong

80

lá của cây WT và cây 35S:GmNAC085 OE1 và OE2 sau
12 ngày xử lý hạn
3.15

Cơ chế đáp ứng của cây Arabidopsis chuyển gen

84

35S:GmNAC085 với điều kiện hạn
3.16

So sánh tỷ lệ thành phần nước giữa hai cây đậu gà ILC482 và

86

Hashem trong quá trình xử lý mất nước

3.17

Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của giống

89

chịu hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở
điều kiện xử lý mất nước
3.18

Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong rễ của giống chịu
xiii

91


hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử
lý mất nước
3.19

Sự trùng lặp của các gen CaNAC ở cả rễ và lá của hai

92

giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý mất nước
3.20

Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong lá của giống chịu

97

hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện
xử lý ABA
3.21

Mức độ biểu hiện của 19 gen CaNAC trong rễ của giống

99

chịu hạn kém Hashem và giống chịu hạn tốt ILC482 ở
điều kiện xử lý ABA
3.22

Sự trùng lặp của các gen CaNAC ở cả rễ và lá của hai
giống Hashem và ILC482 trong điều kiện xử lý ABA

xiv

100


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hạn hán được biết tới như là một trong những yếu tố bất lợi phi sinh học
ảnh hưởng tiêu cực tới năng suất cây trồng và an ninh lương thực trên toàn thế
giới. Hơn nữa, hạn hán là nguyên nhân gây ra một số ảnh hưởng bất lợi khác
nhau về quá trình trao đổi chất ở thực vật như sự co giãn tế bào, phá hủy màng
tế bào, giảm chức năng của các enzyme tham gia q trình liên kết màng, oxy
hóa lipid và các protein bởi việc tích lũy sản phẩm dư thừa của các phản ứng
oxy hóa, và ức chế khả năng quang hợp. Để đối phó với hạn, cây trồng kích

hoạt một số cơ chế đáp ứng với bất lợi ở các mức độ sinh hóa, sinh lý và phân
tử khác nhau để giúp chúng sống sót. Hơn nữa, thực vật cũng có thể đáp ứng
với hạn hán một cách gián tiếp thông qua một số mạng lưới điều khiển khác
nhau, trong đó các yếu tố phiên mã (TF) đóng vai trò quan trọng trong việc điều
hòa biểu hiện của các gen mục tiêu. Các protein NAC được biết tới như là một
siêu họ trong số các họ TF và có mặt ở hầu hết các lồi thực vật. Các TF NAC
tham gia vào tất cả các quá trình sinh trưởng, phát triển và đáp ứng với các môi
trường bất lợi khác nhau ở thực vật.
Trong những năm gần đây, nhiều cơng bố đã chỉ ra vai trị của các TF NAC
tham gia quá trình đáp ứng hạn ở thực vật. Cụ thể, một vài gen NAC đã được
phát hiện và nghiên cứu chức năng trong điều kiện stress hạn hoặc stress thẩm
thấu ở cây mơ hình Arabidopsis (ANAC019, ANAC055, ANAC072/RD26 và
ANAC016), và một số cây trồng quan trọng như cây lúa (OsNAC5, OsNAC6 và
OsNAC10), cây lúa mỳ (TaNAC2, TaNAC29 và TaNAC67), cho thấy tiềm năng
trong việc cải thiện khả năng chống chịu hạn cho cây trồng.
Tuy nhiên, có rất ít các công bố nghiên cứu chức năng cụ thể của các TF
NAC trên đối tượng cây họ đậu. Trong khi, cây đậu tương (Glycine max L.) và
đậu gà (Cicer arietinum L.) được biết tới như là những cây trồng họ đậu quan
trọng được trồng ở nhiều vùng trên thế giới và là nguồn thực phẩm cung cấp
1


dinh dưỡng thiết yếu cho con người và vật nuôi cũng đã bị ảnh hưởng nghiêm
trọng bởi hạn hán. Cụ thể, hạn hán ảnh hưởng tới tất cả các giai đoạn sinh
trưởng và phát triển của cây họ đậu dẫn đến làm giảm năng suất và sản lượng
cây đậu tương và đậu gà trên tồn thế giới.
Chính từ những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng nói chung
và cây họ đậu nói riêng; cùng với đó là vai trò và tầm quan trọng của cây họ
đậu, cụ thể là cây đậu tương và đậu gà đối với nền nông nghiệp của Việt Nam
cũng như trên thế giới, chúng tôi đã xây dựng một luận án nghiên cứu khoa học

với tiêu đề “Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã NAC đáp ứng với
điều kiện hạn ở cây họ đậu”. Trong đó, nghiên cứu sẽ tập trung làm rõ chức
năng của gen GmNAC085 trong quá trình đáp ứng với hạn hán trên đối tượng
cây mơ hình Arabidopsis thaliana. Sau đó, dựa trên các kết quả nghiên cứu
chức năng cụ thể của gen GmNAC085 được làm sáng tỏ, sẽ tiếp tục sàng lọc và
phân tích để phát hiện ra các gen NAC khác có tiềm năng đáp ứng tốt với hạn
trên đối tượng cây họ đậu quan trọng khác, cụ thể là cây đậu gà.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
2.1. Mục tiêu tổng quát
Mục tiêu của đề tài nhằm làm rõ chức năng của gen GmNAC085 trong quá
trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây mơ hình Arabidopsis và tìm ra các gen
CaNAC tiềm năng liên quan đến đáp ứng với điều kiện hạn ở cây đậu gà.
2.2. Mục tiêu cụ thể
 Nghiên cứu để làm rõ chức năng của gen GmNAC085trong quá trình
đáp ứng với điều kiện xử lý hạn ở cây mơ hình Arabidopsis, từ đó tìm ra các cơ
chế chịu hạn của cây Arabidopsis chuyển gen 35S:GmNAC085.
 Phân tích, đánh giá mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống
đậu gà chịu hạn kém Hashem và chịu hạn tốt ILC482 ở điều kiện xử lý mất
nước và ABA bằng kỹ thuật qRT-PCR để tìm ra các gen CaNAC tiềm năng có
2


khả năng đáp ứng tốt với hạn hán.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
3.1. Ý nghĩa khoa học
 Các kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy GmNAC085 là gen đáp
ứng với bất lợi ở cây đậu tương đóng vai trị như một yếu tố hoạt hóa phiên mã.
Sự biểu hiện liên tục của GmNAC085 trong cây Arabidopsis dưới sự điều khiển
của promoter 35S đã làm tăng cường khả năng chống chịu hạn của các cây
chuyển gen thơng qua sự điều chỉnh q trình sinh trưởng của cây, giảm tỷ lệ

thoát hơi nước và sự phá hủy màng tế bào, nhưng tăng mức độ hoạt động của
các enzyme chống oxy hóa và tăng sự biểu hiện của các gen đáp ứng tới bất lợi
trong các cây chuyển gen.
 Kết quả của luận án cũng đã cung cấp các dữ liệu khoa học về sự biểu hiện
khác nhau của các gen CaNAC ở cả hai giống đậu gà chịu hạn kém Hashem và
chịu hạn tốt ILC482 trong điều kiện xử lý mất nước và ABA; đồng thời dựa vào
kết quả so sánh về mức độ biểu hiện của các gen CaNAC giữa hai giống đậu gà
này và tiêu chí lựa chọn gen ứng viên, xác định được một số gen CaNAC có tiềm
năng đáp ứng với hạn tốt cho nghiên cứu chức năng cụ thể ở trên đối tượng cây
mơ hình/cây trồng quan trọng.
 Ngồi ra, luận án được xem như tài liệu tham khảo có ý nghĩa cho công
tác giảng dạy cũng như các hoạt động nghiên cứu khoa học liên quan tới lĩnh
vực cải tạo cây trồng nơng nghiệp có khả năng đáp ứng tốt với hạn hán.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Kết quả của luận án cung cấp cái nhìn chi tiết về vai trị tích cực của
gen GmNAC085 trong việc điều khiển sự thích nghi của cây trồng với hạn hán,
từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của gen GmNAC085 đối với việc phát triển
cây trồng chuyển gen chịu hạn.
 Mặt khác, luận án cũng cung cấp 5 gen CaNAC ứng cử viên đầy triển
3


vọng đáp ứng với mất nước cho nghiên cứu chức năng cụ thể trước khi sử dụng
chúng trong kỹ thuật di truyền để phát triển cây đậu gà chuyển gen, cũng như
các cây trồng khác có năng suất vượt trội ở điều kiện thiếu nước.
4. Những đóng góp mới của luận án
 Kết quả của luận án cho thấy GmNAC085 đóng vai trị như là một
chất hoạt hóa phiên mã trong nấm men, với vùng hoạt hóa nằm ở đầu C- của
GmNAC085. Khi so sánh với cây đối chứng không chuyển gen (WT), các
cây Arabidopsis chuyển gen (35S:GmNAC085) đã cho thấy là giảm sự tăng

trưởng, nhưng cải thiện khả năng chịu hạn thơng qua việc tăng cường tính
tồn vẹn của màng tế bào và giảm tốc độ thoát hơi nước ở điều kiện thiếu
nước. Hơn nữa, sự giảm hàm lượng MDA đi kèm với việc tăng khả năng
hoạt động của các enzyme chống oxy hóa SOD, CAT và APX trong các cây
35S:GmNAC085. Cùng với đó, sự biểu hiện mạnh hơn của các gen mã hóa
các enzyme chống oxy hóa và các gen đáp ứng với hạn trong cây
35S:GmNAC085 so với cây WT ở điều kiện hạn. Các kết quả này cung cấp
cái nhìn rõ nét về vai trị tích cực của GmNAC085 trong việc điều hòa sự
đáp ứng của cây trồng với hạn hán, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của
GmNAC085 trong công tác phát triển giống cây trồng kháng hạn.
 Cùng với đó, luận án đã đánh giá sự biểu hiện của 19 gen CaNAC đáp
ứng với mất nước trong lá và rễ của hai giống đậu gà đối lập nhau về tính chịu
hạn ở trong các điều kiện ngâm nước (đối chứng), xử lý mất nước và ABA, để
kiểm tra sự tương quan giữa mức độ biểu hiện khác nhau của các gen CaNAC
và khả năng chịu hạn khác nhau của hai giống này. Kết quả phân tích qRT-PCR
cho thấy mối quan hệ tích cực giữa số lượng gen tăng và giảm bởi xử lý mất
nước và khả năng chịu hạn. Khả năng chịu hạn cao hơn của giống ILC482 có
thể, hoặc ít nhất một phần là do nhiều gen CaNAC tăng mức độ biểu hiện hơn
và ít gen giảm mức độ biểu hiện hơn trong cả mô lá và rễ của giống ILC482 so
với Hashem. Ngoài ra, khi so sánh đặc trưng biểu hiện của các gen CaNAC
trong lá và rễ của giống đậu gà ILC482 và Hashem cho thấy các đặc trưng biểu
hiện đáp ứng với xử lý mất nước là khác nhau, điều này chỉ ra rằng sự biểu hiện
4


của các gen CaNAC là liên quan tới đặc trưng của mơ và kiểu gen. Hơn nữa,
kết quả phân tích cho thấy khả năng chịu hạn tốt hơn của giống ILC482 so với
Hashem có thể liên quan tới 5 gen CaNAC02, 04, 05, 16 và 24. Do vậy, các kết
quả trong luận án này cũng đã cung cấp các gen CaNAC tiềm năng hứa hẹn cho
việc nghiên cứu chức năng cụ thể của chúng, làm tiền đề cho việc phát triển các

giống đậu gà/các cây họ đậu quan trọng khác có khả năng cải thiện năng suất
trong điều kiện hạn hán.
 Tóm lại, luận án đã cung cấp cơ sở khoa học về sự tham gia của TF
NAC vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn ở cây họ đậu. Qua đó, cho thấy
tiềm năng ứng dụng của TF NAC trong cải tạo giống cây trồng có khả năng
chống chịu hạn.

5


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hạn hán và những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán đối với cây trồng
1.1.1. Những thiệt hại của ngành trồng trọt do hạn hán gây ra
Nền nơng nghiệp tồn cầu trong thế kỷ 21 đang phải đối mặt với một thách
thức khó khăn là cần phải tăng năng suất cây trồng lên gần 70% để có thể đáp
ứng nhu cầu lương thực cho khoảng 9,7 tỷ người vào năm 2050 [24], [59]. Tuy
nhiên, mục tiêu tăng năng suất cây trồng gặp phải nhiều thách thức docác khu
vực canh tác đang ngày càng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi.
Trong số các yếu tố bất lợi phi sinh học khác nhau thách thức tới sản xuất cây
trồng trên toàn cầu, thì hạn hán là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực nhất đang diễn ra
ở hầu khắp các lục địa [59], [102], [106], [110]. Cùng với đó, sự ấm lên tồn
cầu do biến đổi khí hậu (Hình 1.1) đang là ngun nhân làm cho diện tích hạn
hán trên thế giới được dự đốn có khả năng sẽ vượt q 20% vào cuối thế kỷ
này, đặc biệt ở vùng Trung và Nam Mỹ, các khu vực Trung và Tây Âu, và khu
vực Nam Á [59]. Ở khu vực Nam Á, nơi có hơn 75% nông dân làm nông nghiệp
phụ thuộc vào lượng mưa đã bị thiệt hại khoảng 84 tỷ USD được cho là do biến
đổi khí hậu tồn cầu. Hầu hết các loại cây trồng nhạy cảm với hạn hán, dẫn đến
năng suất bị thiệt hại hơn 50% [109]. Khu vực Châu Phi bị ảnh hưởng nghiêm
trọng bởi hạn hán gần như cứ sau 12 năm, nhưng thiệt hại nhất là vào giai đoạn
2009 – 2011 [102]. Trong khi đó, ở khu vực Đông Nam Á, hạn hán gây thiệt

hại khoảng 40% năng suất cây trồng hàng năm [64]. Ngoài ra, biến đổi khí hậu
cũng đã ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất cây trồng cũng như vật nuôi ở khu
vực Địa Trung Hải và Trung Đông [109].

6


Hình 1.1. Biểu đồ nhiệt độ trên thế giới.
Chú thích: Cập nhật ngày 03/07/2018 tại />
Hạn hán đã và đang xảy ra trên tất cả các châu lục trên thế giới với cường
độ và tần suất khác nhau. Khoảng 17% diện tích đất canh tác tồn cầu bị ảnh
hưởng bởi hạn hán trong giai đoạn 1980 – 2006. Hạn hán chủ yếu ảnh hưởng
tới cây trồng phụ thuộc vào lượng nước mưa tự nhiên, chiếm 80% tổng diện
tích canh tác trên toàn thế giới [59]. Theo nghiên cứu của [94], có ít nhất 23
triệu hecta lúa nước ở khu vực châu Á (chiếm 20% tổng diện tích lúa trên thế
giới) được canh tác trong điều kiện dễ bị hạn hán. Ở Pakistan, khoảng 33% lúa
mỳ, 27% ngô, 56% cao lương và kê, 52% lúa mạch, 77% đậu gà, 84% lúa mạch,
24% cải dầu và mù tạt, và 100% cây thầu dầu là được canh tác trong điều kiện
phụ thuộc vào nước mưa và do đó bị ảnh hưởng nặng nề bởi hạn hán [40].
Trong khi đó, phần diện tích canh tác bị ảnh hưởng vĩnh viễn bởi hạn hán trên
thế giới được ước tính là khoảng 28% đối với cao lương, 20% lúa mỳ, 19% lúa
mạch và 19% ở ngô [102], [106]. Các tỷ lệ phần trăm khác nhau đáng kể giữa
các khu vực và từng năm (Bảng 1.1).

7


Bảng 1.1. Diện tích canh tác của một số cây trồng bị ảnh hưởng bởi hạn
hán trên thế giới
Diện tích cây trồng bị

Loại cây trồng

Vùng

ảnh hưởng bởi hạn
hán (%)

Lúa mạch (Hordeum vulgare L.)

Ngô (Zea mays L.)

Lúa (Oryza sativa L.)

Lúa mỳ (Triticum aestivum L.)

Australia

65-70

Nam Mỹ

50

Đông Á

50

Châu Âu

60

Đông Nam Á

65

Châu Phi

80

Nam Mỹ

47

Nam Á

65
Nguồn: [102]

Hơn nữa, hạn hán cũng ảnh hưởng đến tổng năng suất cây trồng, sự ảnh
hưởng này thay đổi theo từng vùng và mùa vụ và sự xuất hiện của stress khác
như nhiệt độ cao (Bảng 1.2). Theo công bố của [102] ước tính rằng, khoảng
36% tổng sản lượng cây trồng ở miền Đông Ấn Độ bị mất do hạn hán. Đặc biệt,
biến đổi khí hậu tồn cầu làm gia tăng sự xuất hiện và mức độ nghiêm trọng
của hạn hán, trong đó nhiệt độ tăng làm gia tăng sự bốc hơi nước. Số liệu ghi
nhận Bảng 1.2 cho thấy, hạn hán đã làm giảm năng suất của một số cây trồng
quan trọng như lúa, ngô, đậu tương, đậu gà, lạc, ngô,... ở một số nước trên thế
giới. Theo dự báo thì tình trạng hạn hán sẽ cịn nghiêm trọng hơn trong những
năm tới và các khu vực bị ảnh hưởng bởi hạn hán có thể tăng gấp đơi vào năm
2050. Các khu vực bị ảnh hưởng nhất trên thế giới có thể bao gồm Bắc và Trung
8

Mỹ, Nam Trung Quốc và Nam Brazil. Tính chất thất thường và khơng thể đốn
trước của chu kỳ hạn hán và lũ lụt cũng sẽ tăng lên [33], [102].
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của hạn hán đến năng suất của các cây trồng ở một
số nước trên thế giới
Năng suất giảm (%)

Quốc gia

60

Pakistan

46-71

Jordan

15

Pakistan

50-80

Pháp

55-72

Ấn Độ

43-80

Iran

48

Cộng hòa Séc

89

Cộng hòa Séc

42-46

Ấn Độ

Lúa mạch đen (Secale cereale L.)

52

Cộng hòa Séc

Cao lương (Sorghum bicolor L.)

17

Pakistan

Loại cây trồng
Thầu dầu (Ricinus communis L.)

Đậu tương (Glycine max L.)
Đậu gà (Cicer arietinum L.)

Lạc (Arachis hypogea L.)
Ngô (Zea mays L.)

Khoai tây (Solanum tuberosum L.)
Lúa (Oryza sativa)

Nguồn: [33], [102]
Trong khi đó, Việt Nam cũng là nước chịu tác động không nhỏ bởi sự biến
đổi khí hậu tồn cầu (Hình 1.1). Tình trạng khô hạn cũng đã và đang ảnh hưởng
trực tiếp tới sản xuất nông nghiệp Việt Nam. Theo [8], các vùng sản xuất nơng
nghiệp chính của Việt Nam hàng năm đều phải đối mặt với nhiều đợt hạn lớn,
có thời điểm hạn đã ảnh hưởng tới 60% diện tích canh tác của các vùng sản
xuất. Dựa theo báo cáo của Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn tính đến
cuối tháng 3/2014, hơn 26 nghìn hecta diện tích cây trồng vụ Đông Xuân năm
9