Tìm hiểu quy trình phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

..

TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO
KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ

Ngành

:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LƯ NHẬT HUY

MSSV:207111018

Lớp: 08CSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2011

LỜI CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan:
- Tự thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
- Khơng sao chép khóa luận tốt nghiệp dưới bất cứ hình thức nào.
- Các số trích dẫn trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực.
Tơi chịu trách nhiệm hồn tồn về lời cam đoan này.

i


MỤC LỤC
i. Danh mục các từ viết tắt................................................................................ 1
ii. Danh mục các hình ....................................................................................... 2
iii. Danh mục các bảng, biểu ñồ, sơ ñồ ............................................................ 3
CHƯƠNG MỞ ðẦU......................................................................................... 4
1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................... 5
2. Mục đích nghiên cứu.............................................................................. 5
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................. 5
4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 5
5. Các kết quả ñạt ñược của ñề tài.............................................................. 6
Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO........................................................... 7
1.1. Bệnh lao ............................................................................................... 8
1.1.1. Lịch sử bệnh lao .......................................................................... 8
1.1.2. Khái niệm về bệnh lao ................................................................ 8
1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao ................................................................... 8
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới.................................................. 8
1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam................................................... 9
1.3. Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao ................................................... 10

1.3.1. Phân loại.................................................................................... 10
1.3.2. ðặc ñiểm ................................................................................... 11
1.3.3. Bộ gen của vi khuẩn lao ........................................................... 12
1.4. Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh.............................. 13
1.4.1. Nguồn lây .................................................................................. 13
1.4.2. ðường xâm nhiễm..................................................................... 13
1.4.3. Diễn biến nhiễm bệnh ............................................................... 13
Chương 2 : BỆNH LAO KHÁNG THUỐC ................................................. 15
2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc............................................................ 16
2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc ........................................................ 16
2.2.1. Trên thế giới.............................................................................. 16
ii


2.2.2. Ở Việt Nam .............................................................................. 18
2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc ..................................... 19
2.4. Vi khuẩn lao kháng thuốc .................................................................. 20
2.4.1 ðặc điểm giúp vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc .............. 20
2.4.1 Vi khuẩn lao ñột biến gen kháng thuốc...................................... 21
Chương 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH LAO .................. 25
3.1. Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao cổ điển ............................... 26
3.1.1. Chuẩn đốn lâm sàng ................................................................ 26
3.1.2. Phương pháp nhuộm soi ñàm.................................................... 26
3.1.3. Phương pháp ni cấy tìm vi khuẩn lao.................................... 26
3.1.4. Phương pháp X-quang phổi ..................................................... 26
3.1.5. Phương pháp thử phản ứng Tuberculin..................................... 27
3.2. Các phương pháp chuẩn đốn bệnh lao hiện đại ............................. 27
3.2.1 Phương pháp ELISA .................................................................. 27
3.2.2. Phương pháp PCR..................................................................... 29
3.2.3. Phương pháp Real-time PCR .................................................... 32

Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR ........................................................... 35
4.1. Giới thiệu quy trình............................................................................ 36
4.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất .............................................................. 36
4.2.1. Vật liệu sinh học....................................................................... 36
4.2.2. Mồi và mẫu dò .......................................................................... 36
4.2.3. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................... 38
4.2.4. Hóa chất .................................................................................... 39
4.3. Quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng phương pháp real-time PCR
4.3.1. Mẫu ........................................................................................... 41
4.3.1.1. Thu mẫu ......................................................................... 41
4.3.1.2. Xử lý mẫu ...................................................................... 41
4.3.2. Tách chiết DNA ........................................................................ 41
iii


4.3.3. Thực hiện Real-time PCR ......................................................... 42
4.3.4. ðọc kết quả ............................................................................... 46
4.3.5. Nhận xét quy trình..................................................................... 46
Chương 5: KẾT LUẬN................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 50

iv


Khoá luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFB

: Acid-fast Bacillus

Bp

: Base Pair

Ct

: Threshod Cycle

dATP

: Deoxyadenosine Triphosphate

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

dNTP

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

dTTP

: Deoxyguanine Triphosphate

ELISA

: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

EMB

: Ethambutol

HIV

: Human Immunodeficiency Virus

HRSE

: Isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol.

INH

: Isoniazid

Kb

: Kilo base

KN

: Kháng nguyên

KT

: Kháng thể

LAM

: Lipoarabinomannan

MDR

: Multidrugs Resistant

MTB

: Mycobacterium Tuberculosis

NALC

: N-acetyl-L-cystein

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RIF

: Rifampicin

RNA

: Ribonucleic Acid

RMP

: Rifampicin

Taq-DNA polymerase: Thermus Aquaticus DNA Polymerase
TB

: Tuberculosis

XDR

: Extensively Drug-resistant

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 1


Khố luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi....................................... 11
Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi điện tử quét ................. 11
Hình 1.3 : Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis ............................................... 12
Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới ........................................ 17
Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao ở Việt Nam.............................................................. 18
Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao ......................................................... 20
Hình 2.4 : ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB ............................ 21
Hình 2.5 : Vùng khả năng bị đột biến ..................................................................... 22

Hình 2.6 : ðột biến trong codon Ser95 ................................................................... 22
Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang .................................................................... 26
Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp ............................................................... 27
Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA.................................... 29
Hình 4.1 : Các thiết bị và dụng cụ trong quy trình.................................................. 38
Hình 4.2 : Primer thiết kế hướng dẫn của CDS....................................................... 44
Hình 4.3 : Chu trình nhiệt Phát hiện Mycobacterium tuberculosis (MTB) kháng thuốc
bằng kỹ thuật real-time PCR .......................................................................................... 45
Hình 4.4 : ðường biểu diễn khuyếch ñại mẫu thử nghiệm ..................................... 46

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 2


Khoá luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỀU ðỒ, SƠ ðỒ
Trang
Bảng 1.1

: Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009.......................... 9

Bảng 4.1

: Các mồi và mẫu dò ñược sử dụng .................................................... 37

Biểu ñồ 2.1

: Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới .............18

Biểu ñồ 3.1 : Biểu ñồ ñường biểu diễn khuếch ñại ................................................ 34

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 3


Khoá luận tốt nghiệp

CHƯƠNG MỞ ðẦU

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 4


Khố luận tốt nghiệp
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh lao đã xuất hiện hàng nghìn năm nay và là căn bệnh khó chữa trị. Hiện nay
có khoảng 1/3 dân số trên thế giới đã nhiễm lao, mỗi năm có khoảng 3 triệu người chết vì
lao. Nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. ðây là vi khuẩn
hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, khơng có tiêm mao, hai đầu trịn, tế bào có
hạt.
Trong những năm 70-80 cơng tác phịng chống và điều trị lao đã trở nên khơng
hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây
lan nhanh và đã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao. Những người mắc chủng
vi khuẩn lao mới này phải ñiều trị trên 2 năm so với ñiều trị 6- 8 tháng như trước kia và
chi phí tăng lên gấp 100 lần. Tổ chức Y tế thế giới ước tính, đến nay đã có 2700 ca bệnh
lao kháng thuốc ở 41 quốc gia. Việc ñiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc hết sức

nghiêm ngặt và cần phải theo dõi liên tục.
Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản và tăng trưởng chậm nên các phương pháp như:
ni cấy truyền thống, nhuộm soi đàm...mất nhiều thời gian, chậm trễ trong phát hiện và
ñiều trị bệnh lao. Chính vì vậy một phương pháp phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc
nhanh chóng và chính xác là ñiều cần thiết nhất. ðề tài thực hiện nhằm tìm hiểu về quy
trình phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc bằng một số kỹ
thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm một số thông tin về vấn đề này.
2. Mục đích nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình chẩn đốn bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân
tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác ñể ñiều trị kịp thời.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
ðánh giá ñược ñộ nhạy và chính xác của quy trình.
4. Phương pháp nghiên cứu
Thu thập tài liệu.
Tìm hiểu các quy trình phát hiện khuẩn lao.
Xác định quy trình về mặt lý thuyết.
Dự đốn đánh giá quy trình đề xuất.
SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 5


Khố luận tốt nghiệp
5. Các kết quả đạt được của đề tài
Tìm hiểu thành cơng về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh
học phân tử, ñiều quan trọng ở ñây là việc tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn lao
ñể tránh trường hợp dương tính giả có thể xảy ra.
ðánh giá được độ nhạy và chính xác của quy trình.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 6


Khoá luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ BỆNH LAO

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 7


Khoá luận tốt nghiệp
1.1. Bệnh lao
1.1.1. Lịch sử bệnh lao [4]
Theo phát hiện di tích bộ xương người cổ đại cho thấy những tổn thương ñặc trưng
của bệnh lao, chứng tỏ bệnh lao xuất hiện cách ñây 4000 năm trước cơng ngun. Nhiều
loại thuốc phục vụ cho việc điều trị bệnh lao cũng ñã xuất hiện cách ñây 7000 năm ở Ấn
ðộ và 5000 năm ở Trung Quốc.
1.1.2. Khái niệm về bệnh lao [6]
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây
nên. Bệnh lao có thể gặp ở tất cả các bộ phận cơ thể, trong ñó lao phổi là thể lao phổ biến
nhất (chiếm 80-85%) và là nguồn lây nhiễm chính.
1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay trên thế giới có khoảng 1/3 dân số (hơn 2,2 tỉ người) ñã nhiễm lao. Thống
kê cho thấy cứ 3 người trên thế giới, có một người bị nhiễm vi khuẩn lao. ðến năm 2005,

có 8,8 triệu ca lao mới (tỷ lệ: 140/100000 dân), trong đó thì 3,9 triệu trường hợp nhiễm
lao mới (62/100000dân). Số người chết do lao khoảng 1,7 triệu (28/100000). [23]
Năm 2008, số người chết ñược thống kê là 1,1-1,2 triệu người, số người mới nhiễm
là 8,9-9,9 triệu người, trung bình mỗi ngày có khoảng 48 nghìn người chết. Tỉ lệ này
chiếm ña số trong các trường hợp tử vong do vi khuẩn lao thuộc các nước ñang phát triển,
ñặc biệt là ở Châu Á (chiếm hơn ½ trong tổng số trường hợp). Tỉ lệ nhiễm lao tính trên
tồn cầu đang có xu hướng giảm, nhưng rất chậm dưới 1%.
Năm 2009, có 1,7 triệu người chết vì lao, tương ñương với 4700 ca tử vong mỗi
ngày và có 9,4 triệu ca nhiễm lao mới. Tỷ lệ mắc ước tính trên tồn cầu năm 2009 giảm
xuống 137 ca/100000 dân. Tỷ lệ này vẫn ñang giảm nhưng rất chậm. [22]
Hàng năm vùng Tây Thái Bình Dương có 2 triệu ca lao mới. Số trường hợp nhiễm
lao ở vùng này chiếm 1/3 tổng số ca lao trên toàn cầu, trong ñó 70% ca lao ở ñộ tuổi 15 –
54. Năm 2005 vùng này có 990000 ca lao được báo cáo, trong đó 455000 ca là nguồn lây.
9/10 ca lao trong vùng được tìm thấy tại 7 quốc gia: Campuchia, Trung Quốc, Lào, Mông
Cổ, Papua New Guinea, Philippines và Việt Nam.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 8


Khố luận tốt nghiệp
Bảng 1.1: Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009
“Nguồn: ”
Khu vực

Tính trên ngàn dân

% của tổng tồn cầu

Châu Phi

2800

30

Châu Mỹ

270

2,9

Châu Âu

420

4,5

ðơng Nam Á

3300

35

ðơng ðịa Trung Hải

660

7,1

Tây Thái Bình Dương

1900

21

Tổng số tồn cầu

9400

100

1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Trong giai đoạn từ 1997 – 2002 phát hiện 530 nghìn bệnh nhân lao các thể, đã điều
trị 260 nghìn bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi là 92%. So với khu vực Tây Thái Bình
Dương, Việt Nam chiếm 12% bệnh nhân nhiễm lao các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi
mới.
Tính đến thời ñiểm tháng 7 năm 2006, Việt Nam xếp thứ 13 trong 22 nước có số
lượng bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam
ñứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin.
Theo kết quả điều tra dịch tễ học tồn quốc năm 2006 - 2007, tình hình bệnh lao ở
nước ta cao hơn ước tính trên thế giới của WHO 1,6 lần. Số bệnh nhân được phát hiện
muộn hoặc khơng được phát hiện ngồi cộng đồng cịn chiếm tỷ lệ cao. Thực tế tỷ lệ phát
hiện bệnh nhân mắc lao là khoảng 55%.
ðến năm 2008, Việt Nam có tỷ lệ bệnh nhân tái phát và ñiều trị thất bại tăng (năm
2004 là 6,4%, năm 2008 là 7,7%). ðặc biệt lao đang có xu hướng giảm ở lứa tuổi già và
có xu hướng tăng ở lứa tuổi trẻ. Ở lứa tuổi 15 -24, tỷ lệ phát hiện lao phổi mới (tính trên
100 nghìn dân), tăng từ 19,5 (2000) lên 37,5 (2008) ñối với nam giới, cịn nữ giới là từ
16,9 lên 42,8. Ước tính tử vong do lao ở nước ta là 20000 ca /năm. Tỷ lệ dân số bị nhiễm

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 9


Khoá luận tốt nghiệp
lao ở nước ta là 44%. Số bệnh nhân lao ước tính mỗi năm. Số mới mắc các thể: 154000
người. Trong đó bệnh nhân lao phổi 69000 người. [23]
Nhiều nguyên nhân ñã ñược ñưa ra là dịch vụ y tế chăm sóc sức khỏe cơng cộng
của Việt Nam chưa tốt, ñặc biệt là ở vùng sâu vùng xa, tình trạng tự điều trị lao của người
dân, hay ñiều trị chưa triệt ñể ñã làm xuất hiện các thể lao kháng thuốc.
Mục đích của chương trình chống lao quốc gia tại Việt Nam là giảm tỷ lệ mắc, chết
và lây truyền bệnh trong cộng ñồng, bao gồm cả ảnh hưởng về tâm lý- xã hội gây ra bởi
bệnh lao và phịng ngừa bệnh lao kháng thuốc nhằm góp phần vào chiến lược xóa đói
giảm nghèo và tăng trưởng của Việt Nam. [25]
1.3. Phân loại và ñặc ñiểm vi khuẩn lao [6]
1.3.1.Phân loại
Giới: Monera
Ngành: Bacteria
Lớp: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Mycobacteriaceae
Chi: Mycobacterium
Loài: Mycobacterium tuberculosis
Phân loại dựa vào ñối tượng gây bệnh cho người và các vật, vi khuẩn lao bao gồm:
- Vi khuẩn lao người - Mycobacterium tuberculosis homonis.
- Vi khuẩn lao bò - Mycobacterium bovis.
- Vi khuẩn lao chim - Mycobacterium avium.
- Vi khuẩn lao chuột - Mycobacterium microti.
Phân loại dựa trên ñoạn gen IS6110 chiều dài 1361 bp nằm trong cấu trúc DNA

của vi khuẩn thì chỉ có ở 4 loài Mycobacteria là M.tuberculosis, M.bovis, M. microti,
M.africanum (gọi chung là M.tuberculosis complex), mà khơng có ở các Mycobacteria
khác. Tại khoa vi sinh của Bệnh viện Lao- Phổi Trung ương, các nhà nghiên cứu nhận
thấy 71% các chủng vi khuẩn lao hiện nay có từ 5 đoạn IS6110 trở xuống, trong khi vi
khuẩn cổ ñiển tỷ lệ này là 10%.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 10


Khố luận tốt nghiệp
1.3.2.ðặc điểm

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi
“Nguồn: http:/www.Giangduongykhoa.wordpess.com”

Hình 1.2: Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét (X 15549)
“Nguồn: http:/www.Microbeworld.org”
Vi khuẩn lao là vi khuẩn hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, khơng có
tiêm mao, hai đầu trịn, tế bào có hạt, đứng riêng lẻ hoặc thành ñám trên tiêu bản nhuộm
(Hình 1.1 và 1.2).
Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở mơi trường bên ngồi cơ thể vật chủ. Trong
điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng, chết sau 1,5h dưới ưới ánh sáng mặt
trời. Vi khuẩn lao ngừng phát triển ở 420 C, chết sau 10 phút ở 800 C, có thể sống được
trong 3 phút với cồn 90 ñộ và sống ñược 1 phút trong acid phenic 5%.
Vi khuẩn phát triển tốt nhất ở pH từ 6,2-7,2 và có thể phát triển tốt nhất ở pH acid
(5,5) hoặc ở pH kiềm (8,0). Trong phịng thí nghiệm, có thể bảo quản vi khuẩn lao trong
nhiều năm. Trong ñàm của bệnh nhân lao đặt trong phịng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn
lao vẫn tồn tại và giữ ñược ñộc lực.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 11


Khoá luận tốt nghiệp
Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí, khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, cũng
chính vì vậy vi khuẩn lao ở phổi là chiếm tỷ lệ lớn nhất.
Vi khuẩn lao sinh sản chậm, trong ñiều kiện bình thường, trung bình 20-24 giờ
sinh sản một lần và có khi hàng tháng chúng mới sinh sản, thậm chí có thể nằm ở vùng
tổn thương rất lâu mà khơng sinh sản hay hoạt động khi gặp điều kiện thuận lợi thì chúng
phát triển trở lại.
1.3.3 Bộ gen của vi khuẩn lao
Bộ gen của vi khuẩn lao ñã được giải trình tự vào năm 1998, có chiều dài 4411522
bp trong đó có 3924 bp trình tự được dự đốn là mã hóa protein, tỷ lệ G + C chiếm đến
65,6%. Bộ gen của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6
gen giả. [20]
Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen. ðây là đoạn gen có tính bảo
tồn cao. Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis đều dựa trên tín hiệu khuếch đại vùng gen này.

Hình 1.3: Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis
“Nguồn: http:/www.Clcbio.com”

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 12


Khố luận tốt nghiệp

1.4. Nguồn lây, đường xâm nhiễm và diễn biến bệnh
1.4.1. Nguồn lây [6]
Tất cả các bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhưng mức độ rất khác nhau.
ðối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, lao màng bụng, xương khớp…) ñược gọi là
các thể lao “kín”, vi khuẩn ít có khả năng lây nhiễm. Ngược lại, lao phổi là thể bệnh dễ
ñưa vi khuẩn ra bên ngồi. Vì vậy lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất. Nhưng ngay ñối
với bệnh lao phổi thì khả năng lây bệnh cũng khác nhau tùy thuộc vào lượng vi khuẩn
trong ñàm. Những bệnh nhân lao phổi trong đàm có nhiều vi khuẩn gây bệnh khác nhau
có thể phát hiện bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp thì khả năng lây cho người khác
gấp 2-10 lần các bệnh nhân lao phổi phải nuôi cấy mới phát hiện ñược vi khuẩn. Những
bệnh nhân này ñược xem là nguồn lây nguy hiểm nhất hay là nguồn lây chính. Bệnh lao ở
trẻ em không phải là nguồn lây quan trọng vì có tới 95% trẻ em mắc bệnh thì khơng tìm
thấy vi khuẩn lao trong các mẫu bệnh phẩm.
1.4.2. ðường xâm nhiễm [6]
Bệnh nhân lao phổi khi ho (hoặc hắt hơi) bắn ra các hạt rất nhỏ lơ lửng trong
không khí, phân tán xung quanh người bệnh, người lành khi hít các hạt này khi thở có thể
bị bệnh. Ngồi ra vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể bằng đường tiêu hóa gây lao ruột,
đường da gây lao da, niêm mạc gây lao mắt nhưng ít gặp. Vi khuẩn lao cũng có thể lây
nhiễm sang thai nhi bằng ñường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính, hoặc nước
ối khi chuyển dạ. ðường lây quan trọng nhất vẫn là đường hơ hấp.
1.4.3. Diễn biến nhiễm bệnh [6]
Bệnh lao diễn biến qua hai giai ñoạn: nhiễm lao và bệnh lao.
+ Nhiễm lao
Khi vi khuẩn xâm nhập vào phổi đến phế nang sẽ kích thích các tế bào miễn dịch
của cơ thể - chủ yếu là ñại thực bào vì độc lực cao nên sự tương tác giữa vi khuẩn và đại
thực bào khơng tiêu diệt được tất cả vi khuẩn, vi khuẩn tiếp tục phát triển nhân lên trong
các tế bào này. Sự thay ñổi về hình thể và chức năng của một số tế bào tại vùng bị tổn
thương dần dần hình thành mang lao. Trong đa số trường hợp tổn thương có thể tự khỏi
(có hiện tượng lắng đọng calci, hình thành nốt vơi) và khơng có biểu hiện lâm sàng. Phản

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 13


Khố luận tốt nghiệp
ứng da với tuberculin bắt đầu dương tính từ tuần thứ 3, sau khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ
thể, nhưng miễn dịch ñầy ñủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2-3 tháng.
Như vậy nhiễm lao là giai ñoạn ñầu tiên khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gây
những tổn thương ñặc hiệu. ða số trường hợp khơng có biểu hiện lâm sàng, cơ thể hình
thành dị ứng và miễn dịch chống lao.
+ Bệnh lao [6]
ðây là giai ñoạn vi khuẩn ñã vào máu và gây ra tổn thương tại các cơ quan trong
cơ thể. Vi khuẩn lao có thể gián tiếp theo mạch bạch huyết ñến các nốt bạch huyết ở
cuống phổi hoặc vùng trung thất và sau đó theo hệ thống ống dẫn ở lồng ngực vào trong
dòng máu, hoặc trực tiếp vào dòng máu từ hệ thống mạch máu ở vùng phổi có các u lao.
Khi đã xâm nhập thành cơng vào dịng máu, chúng lan tỏa khắp cơ thể, tạo vô số ổ nhiễm,
với biểu hiện là củ lao màu trắng ở mô.
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, chúng có thể sống tiềm ẩn, khi sức ñề
kháng của cơ thể suy yếu thì chúng mới phát triển và tấn công gây bệnh. Việc chuyển từ
nhiễm lao sang bệnh lao phụ thuộc vào ba yếu tố chính: số lượng và độc tính của vi khuẩn
lao, sức đề kháng của cơ thể.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 14


Khoá luận tốt nghiệp

Chương 2
BỆNH LAO KHÁNG THUỐC

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 15


Khoá luận tốt nghiệp
2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc
Bệnh lao kháng thuốc lần ñầu tiên ñược xác ñịnh trong năm 2006. Bệnh ñược phát
hiện ở 57 quốc qia và gây khó khăn điều trị. Bệnh lao kháng thuốc phổ biến ở ðông Âu,
Liên Xô cũ, Trung Quốc và Ấn ðộ và ñang tăng lên ở châu Phi. MDR-TB là viết tắt của
nhiều bệnh lao kháng thuốc, nó kháng với hai trong số các loại thuốc bệnh lao hiệu quả
nhất dịng đầu tiên. Lao XDR- kháng thuốc diện rộng bệnh lao, mơ tả một hình thức cao
gây chết người của bệnh lao kháng thuốc. [32]
2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc
2.2.1. Trên thế giới
Tổ chức Y tế Thế giới mở cuộc khảo sát dựa vào số liệu của các phòng thí nghiệm
chuẩn trên thế giới. Trong số 17.690 mẫu phân lập được từ năm 2000-2004 và từ nhiều
quốc gia có 20% chủng kháng nhiều thuốc (MDR-TB), 2% chủng kháng thuốc diện rộng
(XDR-TB). Lao kháng thuốc diện rộng xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều nhất ở
Hàn Quốc là nơi có điều tra dịch tễ về độ nhạy của vi khuẩn, ðông Âu và Tây Á châu.
Bệnh nhân bị lao kháng thuốc diện rộng có tỉ lệ tử vong cao hơn bệnh nhân khác. [31]
Ở Hoa kỳ trong 169654 trường hợp lao từ năm 1993 đến 2004 có 1.6% vi khuẩn
kháng nhiều thuốc, 0,04% là kháng thuốc diện rộng. Tuy bệnh lao ở Hoa kỳ giảm, số lao
kháng nhiều thuốc tăng từ 113 trong năm 2003 lên 128 trong năm 2004. Tuy các con số
ghi nhận ñược chưa thực sự phản ảnh tình hình lao kháng thuốc diện rộng vì các phịng
thí nghiệm. Tại các quốc gia (trừ Hoa Kỳ, Hàn Quốc và Latvia) khơng thường xun xét
nghiệm độ nhạy của vi khuẩn ñối với tất cả các thuốc trị lao loại 2, các phương pháp xét

nghiệm lại khác nhau. [31]

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 16


Khố luận tốt nghiệp

Ước tính trung bình
trên 100000 dân

Chưa thống kê

Hình 2.1: Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới năm 2007
“Nguồn: www.thefullwiki.org”
Năm 2007 có 289000 ca lao kháng thuốc trong những ca nhiễm mới (chiếm 3.1%
tổng số ca nhiễm lao mới) và 221000 ca lao kháng thuốc ñã từng điều trị trước đó (chiếm
19% tổng số ca qua ñiều trị).
Riêng ở khu vực Tây Thái Bình Dương tỷ lệ kháng ña thuốc trong số những bệnh
nhân nhiễm lao mới dao ñộng trong khoảng 0% ñến 10.8%.
ðối với bệnh lao kháng thuốc thì người ta phân làm 2 nhóm: nhóm nhiễm mới, trải
qua điều trị,
♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca nhiễm mới: kháng bất kỳ thuốc nào 17%, kháng
isoniazid là 10.3% và MDR là 2.9%.
♦ Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị: kháng bất kỳ thuốc nào 35%,
kháng isoniazid là 27.7% và MDR là 15.3%.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 17


Khố luận tốt nghiệp

40%
35%

35%
27.70%

30%
25%
17%

20%

qua điều trị

15.30%

15%

nhiễ m mớ i

10.30%

10%

2.90%

5%
0%
khá ng bấ t kỳ

khá ng isoniazid

MDR

Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca ñã trải qua ñiều trị và nhiễm mới
“Nguồn: www.thefullwiki.org”
2.2.2. Ở Việt Nam

100% cho 100000 dân

Hình 2.2: Tình hình bệnh lao kháng thuốc ở Việt Nam năm 2007
“Nguồn: www.thefullwiki.org”
Năm 2007, Việt Nam ước tính có 150 ca nhiễm lao mới/nghìn dân và tỷ lệ mắc
bệnh là 192 ca/nghìn dân. Tỷ lệ lao đa kháng thuốc trong tổng số ca nhiễm lao mới là
2,7%, lao ña kháng thuốc trong tổng số ca ñã qua ñiều trị là 19%.

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 18


Khố luận tốt nghiệp
Theo số liệu bệnh nhân lao đăng ký ñiều trị lao tại TP. HCM năm 2008, với tỷ lệ
kháng đa thuốc (kháng ít nhất với Rifampicin và Isoniazid) vào khoảng 3.8% trong số
bệnh nhân mới và trên 22% ở bệnh nhân lao tái điều trị.

2.3. Tình hình nghiên cứu bệnh lao kháng thuốc
► Nghiên cứu thành công bộ kit ña mồi phát hiện lao kháng thuốc: [28]
Trên thế giới đã có một số kít thương phẩm chẩn đốn nhanh vi khuẩn lao kháng
thuốc do nước ngồi sản xuất nhưng vì chưa có dữ liệu nào về đặc ñiểm phân tử của vi
khuẩn lao kháng ña thuốc ở Việt Nam nên khơng có cơ sở để sử dụng. Hơn nữa, các bộ
kít do nước ngồi sản xuất hiện giá thành khá cao. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển
kít chẩn đốn lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là nhu cầu cấp thiết. Tại
Việt Nam trải qua một thời gian dài nghiên cứu, vào tháng 5 năm 2011, PGS-TS Nguyễn
Thái Sơn, chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh Y học Bệnh viện 103 (Học viện Qn y - Bộ Quốc
Phịng) và các cộng sự đã nghiên cứu thành cơng bộ kít đa mồi có tên mPCR, giúp nâng
cao hiệu quả chẩn đốn vi khuẩn lao. Bộ kít đa mồi có chứa các cặp mồi dùng phát hiện 3
gen ñặc hiệu (IS6110, IS1081, 23S rDNA) của vi khuẩn lao trong cùng một phản ứng,
trong khi kít nhập ngoại chỉ phát hiện một gen (IS6110). Do đó, kít đa mồi khơng bỏ sót
chẩn đốn, đồng nghĩa với việc hạn chế nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn lao ra cộng ñồng, hạn
chế biến chứng ở người bệnh và giúp kiểm sốt bệnh lao được tốt hơn. Mặt khác giá
thành dự kiến của bộ kit này chỉ bằng 1/2 so với kit nhập ngoại. Với bộ kit này, các cơ sở
y tế có thể phát hiện vi khuẩn lao trong vịng 24 giờ vì chúng đạt độ nhạy, độ ñặc hiệu ñến
trên 90%.
► Xét nghiệm bệnh lao phổi trong vòng 100 phút: [29]
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ñã ñưa vào sử dụng trên toàn cầu thiết bị xét nghiệm
mới cho phép chẩn đốn và phát hiện nhanh, chính xác bệnh lao phổi trong vịng 100
phút. Giá thành thiết bị này sẽ ñược giảm 75% cho 116 nước thu nhập trung bình và thấp
trên thế giới, mở ra triển vọng điều trị và kiểm sốt bệnh lao phổi hiệu quả ở cả những
nước nghèo và chậm phát triển nhất thế giới.
Xét nghiệm mới này ñược gọi là "xét nghiệm khuếch đại axít nucleic" (Nucleic
acid amplification tests) được thử nghiệm lâm sàng trong 18 tháng ñã chứng tỏ hiệu quả

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 19

Khố luận tốt nghiệp
chính xác trong chẩn đốn phát hiện sớm bệnh lao phổi, bệnh lao kháng nhiều thuốc
(MDR-TB) và bệnh lao bội nhiễm HIV rất khó phát hiện.
Phương pháp xét nghiệm mới có hiệu quả cao gấp 3 lần so với xét nghiệm hiện
hành, ñặc biệt ñối với các bệnh lao kháng thuốc và gấp 2 lần ñối với bệnh lao bội nhiễm
HIV. Xét nghiệm Nucleic acid amplification tests kết hợp với cơng nghệ DNA hiện đại
hồn tồn tự ñộng và dễ sử dụng nên có thể sử dụng bên ngồi các phịng xét nghiệm
thơng thường.
2.4. Vi khuẩn lao kháng thuốc
2.4.1 ðặc điểm giúp vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc
Lipoarabinomanna
Lipid

Mycolic
Thành tế bào
xương

Phosphatidylino
sitol mannoside
Polysaccharides
Peptidoglycan
Màng plasma
Hình 2.3: Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao
“Nguồn: ”

Vi khuẩn lao có cấu trúc vỏ khá hoàn hảo, giúp chống chịu tốt với nhiều ñiều kiện
bất lợi. Thành tế bào gồm các mycolic acid, chất sáp và các glycolipid chuỗi ñơn. Các
mycolic acid có cấu tạo mạch nhánh rất dài (C60 đến C90) gắn với các muramic acid của

lớp peptidoglycan bằng những liên kết phosphodiester và liên kết với arabinogalactan bởi
các nối glycolpid. Mycolic acid ñem lại nhiều chức năng cho vi khuẩn lao, giúp vi khuẩn
có sức chịu đựng cao, làm tăng kháng thuốc do làm hư hại các hoá chất, khử nước và
ngăn chặn hiệu quả hoạt ñộng của kháng sinh. Nó làm cho vi khuẩn phát triển được bên
trong ñại thực bào và ẩn tránh hệ thống miễn dịch của chủ thể. Hai thành phần quan trọng

SVTH: LƯ NHẬT HUY

Trang 20