Nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản xuất nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

TẠ THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU XỬ LÝ CHẤT THẢI
TỪ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NẤM ĂN
ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số:
60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2009


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học :PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Cán bộ chấm nhận xét 1 :...................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2 :...................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại :
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Ngày . . . . . tháng . . . . năm 2009


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------------oOo--Tp. HCM, ngày 03 tháng 08 năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Tạ Thị Hiền

Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 25/02/1983

Nơi sinh : Lâm

Đồng
Chun ngành : Cơng Nghệ Sinh Học

Khố (Năm trúng tuyển) : 2007
1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản xuất

nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh”
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

9 Tuyển chọn chủng Trichoderma reesei có hoạt tính CMCase cao
9 Tối ưu hóa điều kiện nhân giống Trichoderma reesei
9 Xác định các điều kiện tối ưu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm
9 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân đươc sản xuất
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Tháng 02/2009
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Tháng 07/2009
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin chân thành cám ơn q Thầy Cô thuộc bộ môn Công Nghệ Sinh Học,

trường đại học Bách Khoa TP.HCM đã hết lòng dạy bảo và hướng dẫn cho tôi
trong một thời gian dài học tập tại trường. Nhờ đó mà tơi nâng cao được kiến thức
và khả năng chun mơn để giúp ích cho bản thân tơi trong cuộc sống và có ích
cho xã hội trong tương lai.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG đã hướng
dẫn tận tình và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Một lần nữa xin chân thành cám ơn Thầy và kính chúc Thầy Cơ vui khỏe, và
gia đình ln hạnh phúc.
Tơi xin cảm ơn tất cả bạn bè và những người cộng tác với tơi đã giúp đỡ và
động viên tơi hồn thành tốt luân văn này.


TÓM TẮT
Nấm ăn gồm nhiều loại như nấm bào ngư, nấm rơm, nấm mèo, nấm đông cô, …
Nguyên liệu trồng nấm rất đa dạng và phong phú chủ yếu là từ các loại phế phẩm
nông lâm nghiệp như xơ dừa, rơm rạ, bả mía, vỏ cây đậu, cùi bắp, mạt cưa… Với
nhu cầu trồng nấm ngày một gia tăng, thì lượng chất thải sau mỗi vụ thu hoạch nấm
ngày một nhiều. Ước tính hàng năm số lượng chất thải lên tới hàng triệu tấn, phần
lớn là mạt cưa sau trồng nấm. Trong chất thải đó có hàm lượng chất hữu cơ vẫn duy
trì ở mức cao khoảng 90%. Cùng với các thành phần khó phân hủy như cellulose,
chiếm từ 35% đến 45%, nên quá trình phân hủy tự nhiên trong đất sẽ tốn thời gian
rất dài.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng mạt cưa thải ra sau mỗi vụ thu hoạch nấm
bào ngư (có tỉ lệ C/N là 49.1), được xử lý bằng Trichoderma reesei, sau 14 ngày
hàm lượng cellulose còn lại 18.14%, và C/N là 19.5.
Qua kết quả đánh giá chất lượng phân cho thấy sản phẩm sau phân giải bởi
Trichoderma đạt tiêu chuẩn của phân hữu cơ vi sinh như thành phần nitơ 1.89 %,
kali 2.71%, photpho 0.73 %,
Đề tài này có ý nghĩa trong việc xử lý phế thải ô nhiễm và tạo sản phẩm xã hội
có giá trị, góp phần cải thiện mơi trường, tiến đến một nền nông nghiệp sinh thái

bền vững.


ABSTRACT
There are many kind of mushrooms such as peziza, volvariella, pleurotus,
auricularia spp, flammulina velutipes. Materials for mushroom manufacturing is
very plentiful and variety from the wastes of the agriculture and forestry include
straw, sawdust, bagasse, comcob, coconut fiber, etc. The increase in mushroom
manufacturing goes together with the release of the waste matters. In the estimation,
the waste matters after every mushroom harvest were released came up to millions
of tons, the main is sawdust. In that waste matters still have a lot of organic matter
about 90 percent. And the percentage of cellulose is about 35 to 45, so the natural
degradation processes for this component takes along time and cause environment
contaminated.
In our research, sawdust from pleurotus mushroom manufacturing with C/N is
49.1 was treated with Trichoderma reesei which can produce cellulase with strong
activities by fermentation technology. As a result, the remain of cellulose percent is
18.14 and the rate of C/N is 19.5. This product is meet the standard of microorganisms fertilizer with nitrogen 1.89 %, potassium 2.71%, phosphore 0.73 %,etc.
On the other hand, this research is also helpful to reuse polluted wastes to make new
social products useful for human being. Its also contributes to the improvement the
environment for a better long lasting ecological agriculture.


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

PHẦN I. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
II.1. Cellulase .........................................................................................................3
II.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế ............................................................3
II.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc khơng gian ..............................................3
II.1.3. Tính chất cellulase ..................................................................................4
II.1.4. cơ chế tác dụng.......................................................................................4
II.1.4.1.giới thiệu cellulose – cơ chất của cellulase ......................................4
II.1.4.2. Tính chất chung của cellulose .........................................................4
II.1.4.3. Cơ chế tác dụng cellulase ................................................................5
II.1.5. Điều kiện hình thành cellulase ở sinh vật.............................................6
II.1.6. Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp
enzym cellulase của vi sinh vật .........................................................................6
II1.6.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .........................................................6
II.1.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ..............................................................7
II.1.6.3. Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng ................................................7
II.1.6.4. Ảnh hưởng bởi những yếu tố khác.................................................7
II.1.6.7. Nguồn thu nhận................................................................................8
II.2. Trichoderma ...................................................................................................9
II.2.1. Đặc điểm sinh học của Trichoderma. ...................................................9
II.2.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................9
II.2.1.2. Đặc điểm hình thái .........................................................................10
II.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa....................................................................10
II.2.2.1. Đặc điểm sinh thái..........................................................................10
II.2.2.2. Môi trường sống.............................................................................10
II.2.2.3. Môi trường nhân sinh khối ...........................................................11
II.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma ............................12
II.2.3.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng
........................................................................................................................12
II.2.3.2. Trong lĩnh vực xử lý mơi trường ..................................................13
II.2.3.3 Trong các lĩnh vực khác .................................................................13

II.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................13
II.4. Giới thiệu phân hữu cơ – vi sinh ................................................................15
II.4.1 Phân hữu cơ............................................................................................16
II.4.2 Phân vi sinh ............................................................................................16
II.4.2.1. Định nghĩa.......................................................................................16
II.4.2.2. Phân loại .........................................................................................16
PHẦN III..................................................................................................................18
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................18


III.1. NGUYÊN LIỆU .........................................................................................18
III.1.1. Giống vi sinh vật..................................................................................18
III.1.2. Phế thải sau trồng nấm: .....................................................................18
III.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật.........................................................18
III.1.4. Hóa chất và thiết bị .............................................................................18
III.1.4. 1. Các hóa chất làm mơi trường.....................................................18
III.1.4. 2. Các hóa chất phân tích................................................................19
III.2. Dụng cụ, thiết bị .........................................................................................20
III.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................20
* Phương pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................20
III.3.1.Tuyển chọn chủng Trichoderma có khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp cellulose cao. ............................................................................................20
III.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu đến hoạt
tính cellulose trên mơi trường bán rắn. .........................................................22
III.3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến
khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 .........................................22
III.3.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của T3 ................................................................................................23
III.3.2.3. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme cellulase của T3...................................................................................23

III.3.2.4. Tối ưu hóa các điều kiện ni cấy để thu nhận chế phẩm có
hoạt tính CMCase cao..................................................................................24
III.3.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính CMCase của chế
phẩm ..............................................................................................................25
III.3.3. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu để xử lý
mạt cưa sau trồng nấm....................................................................................26
III.3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống Trichoderma reesei đến khả
năng phân giải mạt cưa sau trồng nấm......................................................26
III.3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng phân giải mạt
cưa sau trồng nấm của T.reesei...................................................................27
III.3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng phân giải
mạt cưa sau trồng nấm của T. reesei. .........................................................28
III.3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải mạt cưa
sau trồng nấm của T. reesei. ........................................................................28
III.3.3.5. Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân được sản xuất. .......29
III.3.4. Các phương pháp hóa lý.....................................................................29
III.3.4.1. Phương pháp xác định pH...........................................................29
III.3.4.2. Phương pháp xác định độ ẩm......................................................30
III.3.5. Các phương pháp hóa sinh.................................................................30
III.3.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính CMCase.................................30
III.3.5.2. Phương pháp xác định tro và tổng hữu cơ.................................33
III.3.5.3. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose ..............................33
III.3.5.4. Phương pháp xác định nitơ tổng số ............................................34
III.3.6. Các phương pháp vi sinh vật .............................................................35
III.3.6.1. Phương pháp cấy chuyển và giữ giống.......................................35
III.3.6.2. Phương pháp gieo cấy nấm mốc .................................................35


III.3.6.3. Phương pháp cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi
trường sản xuất. ...........................................................................................35

III.3.6.4. Phương pháp xác định số tế bào vi sinh vật ..............................36
III.3.6.5. Phương pháp xác định lượng sinh khối tạo thành ....................36
III.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................36
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................37
IV.1. Xác định thành phần chính trong mạt cưa sau trồng nấm...................37
IV.2. Tuyển chọn chủng Trichoderma có khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp cellulose cao. .................................................................................................37
IV.3. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 ................................................39
IV.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu trong môi trường đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T3 ....................................................39
IV.3. 2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của T3 ................................................................................................40
IV.3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase của T3 ................................................................................................41
IV.4. Tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải cellulose
của Trichoderma reesei. .......................................................................................43
IV.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm.45
IV.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase của chế phẩm .....45
IV.5.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chế phẩm..............47
IV.6. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ban đầu để xử lý mạt
cưa sau trồng nấm. ..............................................................................................49
IV.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng lượng giống T. reesei đến khả năng phân
giải mạt cưa sau trồng nấm.............................................................................49
IV.6.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng phân giải mạt cưa
sau trồng nấm của T.reesei..............................................................................51
IV.6.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng phân giải
mạt cưa sau trồng nấm của Trichoderma reesei............................................52
IV.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải mạt cưa sau
trồng nấm của Tichoderma reesei...................................................................54

IV.7. Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân được sản xuất......................56
IV.7.1. Đánh giá cảm quan..............................................................................56
IV.7.1.1. Mùi .................................................................................................56
IV.7.1.2. Màu sắc..........................................................................................56
IV.7.1.3. Các thành phần đa lượng và vi lượng và tổng số vi sinh vật
phân giải cellulose ........................................................................................57
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................59


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng II.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase ................... 10
Bảng III.1: Thành phần hóa học của cám gạo. ...................................................... 24
Bảng III.2: Thành phần khoáng chất và vitamin của cám gạo............................... 24
Bảng III. 3: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của Trichoderma ......... 27
Bảng III. 4: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase ............................... 27
Bảng III. 5: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase ........ 28
Bảng III. 6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase .......................... 29
Bảng III. 7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến hoạt tính CMCase ..................... 29
Bảng III.8. Biến số thí nghiệm ............................................................................... 30
Bảng III.9. Ma trận các nghiệm thức ..................................................................... 30
Bảng III. 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase .............................. 31
Bảng III. 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của hoạt tính CMCase .......... 31
Bảng III. 12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase....................................... 32
Bảng III. 13: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase .................... 32
Bảng III.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa
sau trồng nấm .............................................................................................. 33
Bảng III.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 33
Bảng III.16: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau
trồng nấm .................................................................................................... 34

Bảng III.17: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm...34
Bảng III.18: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 35
Bảng III.19: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm.. 35
Bảng III.20: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 35
Bảng III.21: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau
trồng nấm .................................................................................................... 36
Bảng III.22: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm... 36
Bảng IV.1 Các thành phần chính trong mạt cưa sau trồng nấm ............................ 46


Bảng IV.2: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase của Trichoderma.... 47
Bảng IV.3: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh trưởng của Trichoderma... 48
Bảng IV.4: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase ......... 49
Bảng IV. 5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase.......................... 51
Bảng IV.6: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến hoạt tính CMCase...................... 52
Bảng IV.7. Ma trận các nghiệm thức ..................................................................... 53
Bảng IV.8. Bảng thí nghiệm leo dốc...................................................................... 55
Bảng IV.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase ................................. 56
Bảng IV.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase ..................... 57
Bảng IV.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase ....................................... 58
Bảng IV.12 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase ...................... 60
Bảng IV.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 60
Bảng IV.I4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa
sau trồng nấm .............................................................................................. 61
Bảng IV.I5: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm
..................................................................................................................... 62
Bảng IV.I6: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau

trồng nấm .................................................................................................... 63
Bảng IV.17: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm.. 64
Bảng IV.18: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 65
Bảng IV19: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm.............................................................................................................. 66
Bảng IV.20: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau
trồng nấm .................................................................................................... 67
Bảng IV.21: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm ... 68
Bảng IV.22: Thành phần đa lượng của sản phẩm sau lên men.............................. 70
Bảng IV.23 Các chỉ tiêu hóa học và vi sinh của sản phẩm sau lên men ............... 71
Bảng IV.24: Đỉểm nhiệt chết của một số VSV gây bệnh ...................................... 72


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình II.1: Tác động enzym cellulase lên cellulose theo Mandels & Reesei............ 6
Hình II.2 : Tác động enzym cellulase lên Cellulose theo Ogawa & Toyona........... 6
Hình II.3: Trichoderma reesei ................................................................................ 12
Hình IV.1: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính CMCase của Trichoderma .... 47
Hình IV.2: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh trưởng của Trichoderma 48
Hình IV.3: Ảnh hưởng của hàm lượng cám và trấu đến hoạt tính CMCase.......... 50
Hình IV. 4: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase .......................... 51
Hình IV. 5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính CMCase .......................... 52
Hình IV.6:Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase................................... 56
Hình IV.7: .Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase ...................... 57
Bảng IV.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase ......................................... 58
Hình IV.9 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính CMCase......................... 59
Hình IV.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm ........................................................................................................... 61
Hình IV.11: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa

sau trồng nấm ........................................................................................... 62
Hình IV.12: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm
.................................................................................................................. 63
Hình IV.13: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau
trồng nấm.................................................................................................. 64
Hình IV.14: Ảnh hưởng của pH đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng nấm .. 65
Hình IV.15: Ảnh hưởng của pH đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau trồng
nấm ........................................................................................................... 66
Hình IV.16: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng gãy vỡ của mạt cưa sau trồng
nấm ........................................................................................................... 67
Hình IV.17: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng giảm cellulose của mạt cưa sau
trồng nấm.................................................................................................. 68
Hình IV.18: Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ số C/N của mạt cưa sau trồng nấm .... 68


PHẦN I. MỞ ĐẦU

Ở nước ta, chỉ hơn 10 năm trở lại đây, ngành trồng nấm phát triển mạnh, được coi như một
nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nấm được nuôi trồng trên khắp 61 tỉnh, thành phố. Ở các
tỉnh phía Nam như: Đồng Nai – Kiên Giang - Bến Tre; chủ yếu trồng nấm bào ngư, nấm rơm
và mộc nhĩ, sản lượng các loại nấm trồng đạt hàng chục ngàn tấn mỗi năm. Và các tỉnh phía
Bắc như Hải Dương, Hà Tây, Ninh Bình đã có nhiều cơ sở quốc doanh, tập thể, hộ gia đình
trồng nấm. Tổng sản lượng đạt trên 10 ngàn tấn/năm. Mặc dù đứng thứ 3 thế giới về xuất khẩu
nấm nhưng theo đánh giá chung của nhiều chuyên gia, việc sản xuất, chế biến nấm ở nước ta
chưa tương xứng với tiềm năng và giá trị của nó. Do ngành sản xuất nấm ăn đem lại nhiều lợi
ích thiết thực (tận dụng các phế liệu trong nông nghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp nên các kết
quả nghiên cứu của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật về nấm đã được nhiều địa phương
áp dụng nhanh chóng. Đến nay, sản lượng nấm nước ta đạt trên 1 triệu tấn/năm, sử dụng
khoảng 6 triệu tấn phế liệu, phụ phẩm nông nghiệp cho nuôi trồng nấm.
Đi đơi với việc gia tăng sản lượng thì lượng chất thải từ quá trình trồng nấm cũng gia tăng

khơng kém. Hiện nay lượng chất thải đó chưa được tận dụng một cách có hiệu quả. Một phần
chất thải sau trồng nấm được tái sử dụng để trồng lại nấm nhưng năng suất kém, hoặc chất thải
đó được dùng để chôn lấp làm phân nhưng thời gian ủ rất lâu, và phần còn lại của chất thải
được thải ra môi trường gây ô nhiễm môi trường. Mà nguyên vật liệu để làm nấm chủ yếu bao
gồm mạt cưa từ gỗ cây vườn, cây rừng, gỗ tạp. Ngồi ra cịn sử dụng rơm, rạ, bả mía, bơng phế
liệu, cùi bắp, bẹ chuối khơ, lục bình. Những ngun liệu này có thành phần chính là cellulose,
rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên.
Chính vì thế việc nghiên cứu xử lý chất thải sau trồng nấm một cách hiệu quả là rất cần thiết.
Hơn nữa, nhu cầu sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh ngày càng tăng; thay thế dần việc bón phân
hóa học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch.
Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm
tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây
trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chất chuyển hoá khác nhau liên tục do nhiều quần
thể vi sinh vật khác nhau tạo ra. Giá thành hạ, nơng dân dễ chấp nhận, có thể sản xuất được tại
địa phương và giải quyết được việc làm cho một số lao động, ngoài ra cũng giảm được một
phần chi phí ngoại tệ nhập khẩu phân hố học.
Từ nhu cầu rất thiết thực đó, chúng tơi chọn đề tài “nghiên cứu xử lý chất thải từ quá trình sản
xuất nấm ăn để sản xuất phân hữu cơ vi sinh”. Trong phạm vi đề tài chúng tôi chỉ nghiên cứu


xử lý chất thải từ quá trình trồng nấm bào ngư từ mạt cưa và tập trung giải quyết những vấn đề
sau:
9 Xác định thành phần chủ yếu của mạt cưa sau trồng nấm
9 Tuyển chọn chủng Trichoderma reesei có hoạt tính CMCase cao
9 Tối ưu hóa điều kiện nhân giống Trichoderma reesei
9 Xác định các điều kiện tối ưu để xử lý mạt cưa sau trồng nấm
9 Thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân đươc sản xuất.


PHẦN II. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

II.1. Cellulase
Trong thiên nhiên không gặp enzyme cellulase ở dạng tinh khiết mà nằm trong một phức hệ
các enzyme khác hemicellulase, pentozanase mà chúng có một tên chung là xitolase. Enzyme
này được vi sinh vật tổng hợp nên, đặc biệt là hệ sản sinh enzyme có hoạt lực rất cao. Cho đến
nay người ta cũng chưa tách riêng cellulase ra khỏi hệ enzyme để sản xuất theo qui mơ cơng
nghiệp. Đây là một enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong công nghiệp rượu bia và các thức
uống lên men từ dịch chiết trái cây. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn cho gia súc và một
hướng sản xuất mới trong xử lý rác, phế phụ liệu nông nghiệp.
II.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế
Có thể chia cellulase thành 3 enzyme như sau :
1. Enzyme C1
2 Enzyme Cx
Trong loại này có thể chia ra làm 2 loại enzyme nhỏ :
a. Cellobiohydrolase (CBH) có tên khác là exo-β-1,4 Glucanase hay exocellulase có mã số
E.C..3.2.191 ; CAS 37329-65-0
b.Endoglucanase có tên khác là endo β-1,4-D-glucanase hay β-1,4-glucan-4-glucanohydrolase
có mã số E.C.3.2.1.4: CAS 9012-54-8.
3. β- glucozitase có tên khác là β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase có mã số
E.C.3.2.1.21: CAS 9001-22-3.
II.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc khơng gian
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin bởi liên kết peptit –CONH-, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm
một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác
nhưng được gắn thêm vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng
gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường -CO-NH-của protein và việc
thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 Kda (Beguin 1990; Gilkes và cọng sự
1991). Cấu trúc không gian khoảng 280-600aa nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300 450aa (Gilkes và cộng sự 1991) và trung tâm xúc tác cỡ khoảng 250aa.


II.1.3. Tính chất cellulase

Theo sự hiểu biết, cho đến ngày nay thì quá trình phân hủy cellulose trong tự nhiên được thực
hiện bởi một phức hệ enzyme bao gồm enzyme C1, Cx, và β-glucosidase.
* Enzym C1 là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác dụng của enzyme này cellulose tự nhiên
như bông, giấy,…vv, trương lên và chuẩn bị cho tác động của enzyme tiếp theo (Whiterker
1971). Với tính chất như thế, vi sinh vật có enzym C1 thì có thể nới lỏng vùng kết tinh của
cellulose. Cơ chế tác động của enzyme C1 cho đến nay vẫn chưa được biết rõ và vẫn còn tiếp
tục nghiên cứu. Khi các sinh vật phân hủy phát triển trên cơ chất cellulose thì yếu tố C1 có tác
dụng biến đổi cellulose nhưng khi tách ra thì tác dụng này khơng cịn thấy rõ.
*

Enzyme Cx còn gọi là enzym β-glucanase, enzyme này thủy phân cellulose thành

cellobiose. Chữ x có nghĩa đây là loại enzyme có nhiều thành phần khác nhau. Người ta chia
nó làm hai loại :
-

Exo- β-1,4 glucan cellobiohydrolase: đây là một exocellulase thực hiện phản ứng cắt liên

kết β-1,4 glucozit giải phóng cellobiose từ đầu không khử của chuỗi cellulose (chuỗi glucan và
cellodestrine).
- Endo- β-1,4 glucane cellobiohydrolase: đây là endocellulase thực hiện phản ứng cắt liên kết
β-1,4 glucozit ở bất kỳ chổ nào trong chuỗi cellulose.
Kết quả của sự tác động của C1 tạo một lượng lớn cellobiose, đây là cơ chất cho sự tác động
của nhóm enzyme thứ ba. Tuy nhiên có tác giả Ogawa và Toyama (1967) cho rằng cịn có một
enzyme khác có tác dụng trung gian giữa C1 và Cx đó là enzyme C2. Enzyme này tác động vào
các cellobiose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những loại cellodestrine hòa
tan. Enzyme sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodestrine này thành cellobiose.
* Enzyme β-glucosidase: hay có tên khác là cellobiase, đây là enzyme phân cắt đặc hiệu
cellobiose, cellodestrine thành D-glucose.
II.1.4. Cơ chế tác dụng

II.1.4.1.Giới thiệu cellulose – cơ chất của cellulase
Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn hữu cơ được thực vật tổng hơp nhờ q trình quang hợp.
Trong số này có 172 tỷ tấn được hình thành ở đất liền và 60 tỷ tấn hình thành trong đại dương.
Trong số này có 30% là màng thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Hàm lượng
cellulose trong thực vật thường thay đổi lớn 40 - 80%, ví dụ trong bơng chiếm đến 80% nhưng
trong gỗ khơ chiếm 40 – 50%.
II.1.4.2. Tính chất chung của cellulose


Cellulose là một trong những hợp chất khá bền, không tan trong nước, nhưng có thể hút nước
và trương nở lên. Tuy nhiên, chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nước có nhiệt độ cao và
áp suất lớn, hay trong dung dịch có chứa tác nhân axid hay kiềm mạnh
Cellulose có thể bị phân hủy ở nhiệt độ 40 – 50oC thường nhưng với điều kiện phải có mặt
enzyme cellulase.
Cellulose có cấu tạo từ các đơn vị C6H10O5 nhưng cấu tạo phức tạp hơn rất nhiều so với tinh
bột và cho màu nâu với Iot.
Trong tế bào thực vật cellulose liên kết chặt chẻ với hemicellulose, pectin, lignin. Điều này ảnh
hưởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme. Trong tự nhiên khơng có vi sinh vật nào
có đầy đủ tất cả các hệ enzyme vì thế để phân hủy cellulose thì địi hỏi có sự kết hợp của nhiều
VSV khác nhau.
Dạng kết tinh vơ định hình dễ bị phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhưng dạng kết tinh thì có
cấu trúc rất chặt chẻ nên khó bị phân hủy. Ở các loại gỗ càng có nhiều kết tinh thì gỗ càng
chắc. Muốn phá hủy hồn tồn cellulose thì trước tiên phải chuyển chúng sang dạng vơ định
hình nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật.
II.1.4.3. Cơ chế tác dụng cellulase
Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có nhiều kiểu tác
động khác nhau.
+ Theo Mandels và Resee (1964) thì:
Cellulose
C1

cellulose hoạt động

cellobiose
Cx

glucose
β-glucozitase

Hình II.1: Tác động enzym cellulase lên cellulose theo Mandels & Reesei
Trong đó C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương tạo thành các
chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuổi này lại bị tấn công bởi Cx. Các vi sinh vật sinh trưởng
trên cellulose mạch ngắn hòa tan chỉ tổng hợp thành phần Cx, trong khi những vi sinh vật sinh
trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C1 và C2. Trong tự
nhiên thì người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là Cx lại sinh ra từ một loai nấm
mốc khác.
β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn cellobiose thành
glucose.
- Theo Ogawa và Toyana (1967) thì việc phân giải cellulose có cơ chế như sau :


Cellulose

Cellulose trương
C1

Các sản phẩm hịa tan
C2

cellulose

Cx

Hình II.2 : Tác động enzym cellulase lên Cellulose theo Ogawa & Toyona
Enzym Cx sẽ tác động vào các cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành
những cellodestrine hòa tan. Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodestrine hòa tan.
Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại cellodestrine thành cellobiose.
II.1.5. Điều kiện hình thành cellulase ở sinh vật.
Enzyme tạo ra ở vi sinh vật không chỉ phụ thuộc vào hoạt tính riêng của từng loại vi sinh vật
mà cịn phụ thuộc vào nhiều thành phần, mơi trường , điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ…) nên
sự hiện diện của chất cảm ứng trong môi trường là điều quan trọng nhất [4]
Enzyme thủy phân của vi sinh vật đều là enzyme cảm ứng, khi mơi trường ni cấy có một
chất khó đồng hóa thì vi sinh vật phải tiết vào trong môi trường hoặc những enzyme tương ứng
để thuỷ phân chất đó thành chất đơn giản hơn là sinh vật có thể sử dụng. Chính vì thế mà
người ta đã đưa ra môt định nghĩa tổng quát : “ Một quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng
nếu như nó xảy ra với mức độ đáng kể khi trong mơi trường có chất đặc hiệu của enzyme này
hoăc các chất có cấu trúc tương tự, các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng. Các
chất kích thích trong quá trình tổng hợp này gọi là chất cảm ứng”.
Để tổng hợp cellulase thì nhất thiết phải có chất cảm ứng, thông thường là chất cellulsoe 1%.
Các nguồn cacbon khác: glucose, cellobiose, acetat, citrat, succinate và những sản phẩm trung
gian của chu trình Krebs có tác dụng làm kiềm hãm sinh tổng hợp celluosase, song song mơi
trường có nồng độ rất ít chất kích thích sự phát triển sinh khối vi sinh vật và tạo ra các chất
enzyme [25].
II.1.6. Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase
của vi sinh vật
II1.6.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Thực tế cho thấy sự tổng hợp cellulase mang tính chất cảm ứng. Cellulose gây cảm ứng cho
việc hình thành cellulase ở nhiều loại nấm khác nhau. Một số tác giả nhận thấy các chất gây
cảm ứng đối với enzyme này, ngồi cellulose cịn có cellobiose , acetat, lactat,…Nghiên cứu
của Tozamacho biết cellulose nội bào của Trichoderma viride và Trichoderma konigi được tạo
thành khá nhiều. Khi được nuôi cấy trên mơi trường có cám tiểu mạch (mùn cưa, mùn ở 3-4

ngày 25-30oC). Nhiều nguồn C (glucose, cellobiose, acetat, xitrat, oxalat, succinat.) làm ức chế


quá trình tổng hợp enzyme phân giải cellulose. Acid citric và nhiều sản phẩm trung gian của
chu trình Krebs là chất ức chế đối với sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở Allenaria lenni.
Chaetomium globosum.
Nấm Aspergillus gumigatus và các loại nấm ưa nhiệt thì nguồn C thích hợp là: Bột rơm
nghiền, giấy lọc. Cịn Trichoderma reesei lại thích hợp trong nguồn cám bã củ cải đường. [24]
Tác giả Lê thị Hồng Mai khi nghiên cứu cellulase ở Asp. Niger VS-1 trên môi trường đặc nhận
thấy: cám gạo là cơ chất thích hợp nhất để thu nhận enzyme từ chủng này [11].
II.1.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến việc tạo thành cellulase ở nấm.
Theo Sin và Sinden (1951), khi sử dụng hết 1 g nitơ, nhiều vi sinh vật phân giải cellulose sẽ
phân gỉải được khoảng 24-35 g cellulose. Nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase
ở nhiều lồi nấm khác nhau. Điều này có thể giải thích như sau: Nitrat làm cho mơi trường
kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. (12)
Nói chung các muối amơn có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí cịn ức chế q
trình tổng hợp, vì rằng trong môi trường các muối này làm cho môi trường axit hóa, điều này
có thể làm mất hoạt tính enzyme khi tạo thành [20].
Các hợp chất nitơ có ảnh hưởng khác nhau trong sinh hoạt tổng hợp cellulase điều này phụ
thuộc đặc tính sinh lý của từng chủng giống.
Tác giả Lê Thị Hồng Mai cũng đã so sánh ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự tổng hợp CMC-ase
trên môi trường dịch thể. Với chủng Asp, niger VS-1, tác giả nhận thấy: Trái với mơi trường
đặc, ở đây hoạt tính CMC-ase cao nhất với NaNO3 (0,51 đv/ml) cao hơn trên môi trường đặc
với (NH4)2SO4 là 18,6%. [11]
II.1.6.3. Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng
Trong số các nguyên tố vi lượng thì Fe, Mn, Zn, Co là những nguyên tố ảnh hưởng nhiếu nhất
đến việc tạo cellulase. Nồng độ thích hợp nhiều nhất với nhiều loại nấm là 0,11-2,2mg/l (Zn :
2-10mg/l ; Fe : 3,1-21,2mg/l).
II.1.6.4. Ảnh hưởng bởi những yếu tố khác

* Nhiệt độ nuôi cấy [23]
Nhiệt độ nuôi cấy với sinh trưởng và tích lũy cellulase của nhiều loại nấm khác nhau là 28 –
30oC. Các chủng Asp. Fumigatus ưa nhiệt thích hợp sinh trưởng và hình thành enzyme phân
hủy cellulose ở 65oC.


Những chủng nấm có khả năng phân giải cellulose cao (như Trichoderma viride, Trichoderma
Koningi, Asp. Niger…) đều là các loại nấm ưa nấm, chúng phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ
25 – 30oC
Stutgenberger và cộng sự (1971) cho biết trong số các vi sinh vật phân giải cellulose phân lập
được từ phân rác ủ thì chiếm ưu thế là loài xạ khuẩn ưa nhiệt Thermonospora curvata. Loài này
phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 50 – 60oC và tích lũy nhiều enzyme phân giải cellulose trên
môi trường nuôi cấy chứa cellulose và tinh thể (Avicel) và cao nấm men.
* pH ban đầu của mơi trường [5]
Nhiều loại nấm thích hợp phát triển và hình thành mạnh mẻ cellulase ở pH = 4.6, Fusarium
osysporum và Tr. Koningi có thể tiếp tục phát triển và phân hủy cellulose ngay cả ở những mơi
trường có pH = 1.8 – 2.0
Tác giả Lê Thị Hồng Mai khi nghiên cứu cellulase chủng Asp.Niger VS-1 trên môi trường đặc
nhận thấy: Khả năng sinh CMC-ase Asp.Niger VS-1 rất thấp ở pH = 3,0, có thể do nấm sinh
trưởng rất kém ở độ pH này. Khơng có sự khác biệt rõ rệt giữa pH 4,0 và 5,0. Với pH = 6,0
hoạt tính thu được cao hơn là 7,4%. Hoạt tính đạt được cao nhất khi pH ban đầu là 7,0. [11]
II.1.6.7. Nguồn thu nhận
Enzyme cellulase là một hệ enzyme khá phổ biến ở hầu hết các loài vi sinh vật như xạ khuẩn,
nấm mốc, vi khuẩn. Popov (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của
một số VSV kỵ khí. Người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose của các vi khuẩn
hiếu khí là G. Va Iterson (1903). Về sau các nghiên cứu về vi khuẩn được phát triển lên rất
nhiều nhờ các cơng trình nghiên cứu sâu sắc của S.N Vinogradskii và của A.A Imtcheniezkii.
Những vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao ngồi xạ khuẩn cịn phải kể đến nấm mốc, và một
số đại diện khác .
Những chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose như Trichoderma viride, Trichoderma

Komingi, Asp, niger, Myrotheciun verrucaria…đều là các loại nấm ưa ấm, chúng phát triển
thích hợp nhất mở nhiệt độ 25 – 30oC (Norkans 1967) và nấm mốc hiếu khí sản sinh cellulase.
Bảng II.1 Một số lồi nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase
Alternaria tenuis (các chủng

-

Asperillus fumigatus

56160, 12217, 13869

-

Asperillus flavus

-

Asperillus amsterlodamy

-

Asperillus luchnensis

-

Asperillus oryzae

-

Penicillium notatum

-

Asperillus sydovii

-

Penicillium variabite

-


-

Asperillus terrus

-

Pericoria stemoniters (2 chủng)

-

Cellvibrio gilvus

-

Polyporus versicolor

-

Cephalosporium sacchar

-

Pullularia pullulans (35 chủng)

-

Chaetomium globosum

-

Pyrenochaeta terristis

-

Ch. Elatum và Ch. Funicolum

-

Rhizina undulata

-

Crysosporium ligaorum

-

Rhizopus specis

-

Cladosporium herbarum (11

-

Stachybotrys alternaus (S.
lobulata, S. atra)

chủng)
-

Coniophora putaena

-

Stemphylium macrsporoidea

-

Fusarium culmorum

-

Stereumsangguinolentum

-

Fusarium oxyporum

-

Strysamus stemonites (3 chủng)

-

Fusarium solani

-

Trichoderma konongi

-

Helmin thosporium sativum (45

-

Trichoderma lignorum

chủng)

-

Trichoderma roseum

-

Irpex lacteus

-

Trichoderma viride

-

Merolins laccrymans

-

Verticillum

-

Microhecium verrucqaria

Những nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulase thuộc các giống Aternaria, Trichoderma,
Mychrotecium, Asperilllus, Penicillium, Cladosporium,… Chúng được tách từ đất xung quanh
vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có q trình phân
hủy cellulase. Trong giống Alternaria tenuis thấy có 150 chủng có thể phân hủy giấy lọc tới
80%, 100 chủng Alternaria circinans phân hủy được 85% và 130 chủng Clodosporium
herbarum 8% [20].
II.2. Trichoderma
II.2.1. Đặc điểm sinh học của Trichoderma.
II.2.1.1. Vị trí phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho cơng tác phân loại do
cịn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Harman and Kubicek (1998) đã phân loại Trichoderma như sau :
Giới : Fungi
Ngành : Ascomycota

Lớp

: Euascomycetes

Bộ

: Hypocreales

Họ

: Hypocreaceae


Giống : Trichoderma
Ainsworth, G.S. and Sussman, A.S (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp
Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae. Trong lúc đó theo hai nhà khoa học Elisa
Esposito và Manuela da Silva đã phân Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp túi
Ascomycetes; loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm : Trichoderma, Longibrachiatum,
Saturnisporum, Pachibasium và Hypocreanum. Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachibasium,
Longibrachiatum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là
Hypocrea. Nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập; nhóm
Saturnisporum khơng tìm thấy hình thái teleomorph.

Hình II.3: Trichoderma reesei
II.2.1.2. Đặc điểm hình thái
Trichoderma sinh sản vơ tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu,
cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào
tử trần khơng có vách ngăn, khơng màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất
nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng,
xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát` triển nhanh, chúng có

thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 20oC.
II.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
II.2.2.1. Đặc điểm sinh thái
II.2.2.2. Mơi trường sống
Trichoderma sp. Là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất
sa mạc. Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhưng chúng cũng có khả năng tấn cơng
các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh


với thực vật. Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực Bắc đến những
vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới. Tuy nhiên, có một sự tương quan giữa sự phân bố các
lồi và các điều kiện môi trường.
Trichoderma polysporum và Trichoderma viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi
Trichoderma hazianum có ở các vùng khí hậu nóng. Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ
tối đa cho từng loài.
Các loài Trichodema thường xuất hiện ở đất acid, và Gochenaur (1970) cho rằng có thể có
tương quan giữa sự hiện diện của Trichoderma viride với đất acid trong vùng khí hậu rất lạnh
ở Peru. Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn và có thể phát triển tốt ở đất kiềm
nếu như ở đó có sự tập trung một lượng CO2 và Bicarbonate [12].
Tricoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt, những khu
rừng khác nhau. Trichoderma hamatum và Trichoderma pseudokoningi có thể chịu điều kiện
có độ ẩm cao hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, Trichoderma sp. Thường không chịu
được độ ẩm thấp mà điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Tricoderma
giảm rõ rệt trong những nơi có độ ẩm thấp, song các lồi Trichoderma sp. Khác nhau thì yêu
cầu vế nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau.
II.2.2.3. Mơi trường nhân sinh khối
Kết quả thí nghiệm trong phịng thí nghiệm cho thấy nấm Trichoderma có khả năng ức chế
một số nấm bệnh và sinh tổng hợp nhiều enzyme trong đó có enzyme cellulase phân giải
cellulose rất tốt. Để mở rộng khả năng ứng dụng của chúng trong sản xuất thì vấn đề nhân sinh
khối để tạo lượng lớp chế phẩm đã được đặt ra.

Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên mơi trường có nhiều cellulose như: Bã
đậu phụ, lõi ngơ, cám gạo, thóc , bã mía…Đặc biệt là trên mơi trường bã đậu phụ nấm phát
triển tốt nhất với lượng bào tử sản sinh 7,5.109 bào tử/g môi trường. Tuy nhiên việc bảo quản
chế phẩm này gặp rất nhiều khó khăn do độ ẩm. Thay vào đó có mơi trường thóc tuy lượng bào
tử sản sinh thấp hơn khoảng 3,2.109 bào tử/.g môi trường nhưng việc bảo quản thì dễ dàng
hơn.
Trong thời gian ni nhân sinh khối cần điều kiện thống khí, sau khi vô trùng cần làm cho
môi trường xốp bằng cách lắc, không để cho chúng kết lại thành mảng, nếu bị kết mảng bào tử
hình thành rất ít thậm chí sợi nấm khơng lan vào được.
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng nước, nguyên liệu làm môi
trường cho thấy mơi trường thóc là thích hợp cho việc nhân nuôi nấm [Nguyễn văn Tuất và Lê
văn Thuyết, 2001]


II.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
II.2.3.1. Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng
* Bảo vệ thực vật [34]
Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma được quan tâm nhiều nhất đó là khả
năng đối kháng một số vi sinh vật gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều
loại Trichoderma khác nhau để kiểm sốt có hiệu quả nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau. Ví
dụ: Rhizoctonia sp : Gây mục rễ, thân và hạt,… Penicillium diditatum: Hỏng trái ở chanh và
chuối
Hiện nay người ta đã sử dụng nhiều chủng Trichoderma trong các chế phẩm sinh học thương
mại như: GlioGard là chế phẩm để ngăn chặn sự úng thối của cây con. Chế phẩm Trichodex
với thành phần chính là Trichoderma harzianum là thành phần chính được dùng để chống lại
sự thối rửa của táo sau thu hoạch. Trichoderma harzianum còn được kết hợp với Trichoderma
polysorum trong việc sản xuất Binabt để trị các vết thương bị nhiễm trùng ở cây trồng.
Trong nước đã có nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Tricoderma xử lý đất
trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng loại mục trước khi bón ruộng 510 ngày, rồi rãi lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khơ vằn hai bắp [22].
* Cải thiện năng suất cây trồng

Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thối hóa, chai
sạn; các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp, đồng thời độ thơng khí cho
cây cũng bị thiếu hụt. Vì vậy các nước có nền nơng nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng
sử dụng các loại phân bón hữu cơ thế hệ mới – thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và
thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học. Các loại phân bón vi sinh này có tác
dụng như sau :
- Phòng ngừa bệnh gây thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh nấm sương mai, bệnh đốm
nâu….và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme
của các nấm gây bệnh, đồng thới bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân [26].
- Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng
cáp hơn. Gần đây, khi khảo sát các loài Tricoderma spp ở các lớp đất sâu, người ta cịn tìm
thấy Tricoderma spp, làm tăng số lượng các rễ sâu (các rễ cách mặt đất khoảng 1m). Điều này
góp phần giúp cho các cây lương thực như ngơ hay các lồi dùng để trang trí cỏ lát có khả
năng chống chịu tốt với hạn hán [40].

Vài lồi Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy

mầm và sự ra hoa đã cho nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Tricoderma harzinum và
Tricoderma koningi kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây. Đối với các loài hoa được


trồng trong nhà kính, Tricoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra
hoa hay tăng số lượng hoa [39].
-

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật và nốt sần cố
định trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất, bảo tồn và tăng độ
phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng.

-

Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và
kích thích tăng trưởng của cây.

-

Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Tricoderma harzianum cịn có thể xâm nhập
vào mơ bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng.
Như vậy, các chủng nấm Tricoderma spp ..trong các chế phảm phân hữu cơ vi sinh không
những cung cấp một nguồn phân bón an tồn, hiệu quả mà cịn kiềm chế các bệnh gây hại cây
trồng và tạo đựơc những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên.
II.2.3.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường
Tricoderma harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học California) có thể phân
giải DDT, endosulfan, pentacholoroitropenzen và pentacholorophenol. Nấm này phân giải
endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt q trình sống của nó.
Tricoderma harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong dất trong 24 giờ,
đây là một tiềm năng tốt để xữ lý sinh học các chất gây ô nhiễm trong đất và đầm lầy.
Một cơng trình nghiên cứu khác để xử lý nấm mốc Tricoderma reesei RUT-30 để xử lý chất
thải sinh họat đô thị hứa hẹn một nền sản xuất enzyme cellulase rẻ tiền, đồng thời giảm lượng
rác thải. Các enzym cellulase thu được từ đây được đánh giá là tốt hơn và kinh tế hơn so với
enzyme celluase được lấy từ các nguồn cơ chất cellulose tinh chế.
II.2.3.3 Trong các lĩnh vực khác
Tricoderma spp.là nguồn sản xuất hiệu quả các enzym cellulase ngoại bào. Chúng được sử
dụng để sản xuất cellulase và những enzyme khác để làm giảm tính phức tạp của polisa
charide. Các enzyme này được sử dụng rất nhiều trong lương thực và trong cơng nghiệp sợi,
do chúng có thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn [40].
L.Grange và cộng sự đã biểu hiện Gen-xylanase (XYN) của Tricoderma reesei ở
Saccharomyces cersvisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa
hemicellulose trong lúa mạch và các cây lương thực khác. [38]
II.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Trichoderma được bắt đầu từ năm 1990 bộ môn bệnh cây
Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành phân lập các chủng Trichoderma từ các nguồn khác nhau