Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo quản lạnh van tim trên thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MẦU VĂN CẢNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH
VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MẦU VĂN CẢNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN LẠNH
VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Ngơ Duy Thìn
2. PGS.TS. Nguyễn Lai Thành

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, Phòng đào tạo Sau
đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Tế bào, Trƣờng đại học khoa học tự nhiên,
ĐHQGHN.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Bộ môn Mô – Phô học trƣờng Đại học
Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp tôi trong suốt quá trình làm việc và
thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Ngơ Duy Thìn ngƣời
thầy đã hết lịng giúp đỡ, dìu dắt và hƣớng dẫn tơi trong suốt q trình học
tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Lai Thành
ngƣời thầy đã hết lịng giúp đỡ, dìu dắt và hƣớng dẫn tơi trong suốt q trình
học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn này
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cơ trong hội đồng chấm luận văn đã
có ý kiến đóng góp q báu, sẽ là bài học cho tơi trên con đƣờng nghiên cứu
khoa học.
Tôi chân thành cảm ơn những đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ và động
viên tơi trong q trình hồn thành luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến cha, mẹ và gia đình tơi những
ngƣời ln bên tơi động viên, chia sẻ khó khăn và dành cho tơi những điều
kiện thuận lợi nhất.
Học viên

Mầu Văn Cảnh


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Mầu Văn Cảnh, học viên lớp cao học khóa 24 chuyên ngành
Sinh học thực nghiệm, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên,ĐHQGHN, xin
cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS.TS. Ngơ Duy Thìn và PGS.TS. Nguyễn Lai Thành
2. Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
đƣợc công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác,
trung thực và khách quan.
Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 1 tháng 1 năm 2018
Học viên

Mầu Văn Cảnh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN MÔ, TỔ CHỨC VAN TIM . 3
1.2. MỘT SỐ VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN PHƢƠNG PHÁP BẢO
QUẢN LẠNH SÂU MÔ VAN TIM .................................................... 5
1.2.1. Khử trùng bằng hỗn hợp kháng sinh ............................................... 7
1.2.2. Môi trƣờng bảo quản ....................................................................... 7
1.2.3. Tốc độ hạ nhiệt độ ......................................................................... 12
1.2.4. Nhiệt độ bảo quản ......................................................................... 14
1.2.5. Rã đông và loại bỏ dung dịch bảo quản ........................................ 15
1.3. Một số quy trình bảo quản van tim ngƣời tại một số ngân hàng van tim
trên thế giới ......................................................................................... 17
1.4. GIẢI PHẪU MÔ HỌC VAN TIM ...................................................... 20

1.4.1. Cấu trúc chung van động mạch chủ. ............................................. 21
1.4.2. Cấu trúc vi thể và siêu vi thể của lá van động mạch chủ .............. 22
1.5. KHẢ NĂNG SỐNG VÀ THẢI GHÉP CỦA TẾ BÀO MÔ VAN TIM
SAU BẢO QUẢN............................................................................... 26
1.5.1. Khả năng sống của nguyên bào sợi ............................................... 26
1.5.2. Khả năng sống của tế bào nội mô ................................................. 28
1.5.3. Khả năng thải ghép của mô van tim.............................................. 29
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 31
2.1. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ............ 31
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 31
2.2.1. Phân nhóm nghiên cứu .................................................................. 31
2.2.2. Thiết kế thí nghiệm ....................................................................... 32


2.2.3. Phƣơng pháp, kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ........................ 32
2.2.4. Đánh giá kết quả bảo quản lạnh sâu van tim ................................ 35
2.2.5. Đạo đức trong nghiên cứu ............................................................. 38
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................... 39
3.1. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN VAN TIM TRÊN
THỰC NGHIỆM ................................................................................ 39
3.1.1. Kết quả lấy mẫu nghiên cứu ......................................................... 40
3.1.2. Kết quả thực hiện qui trình xử lý và bảo quản van tim................. 42
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VAN TIM SAU BẢO QUẢN ... 48
3.2.1. Hình thái đại thể ............................................................................ 49
3.2.2. Hình thái vi thể .............................................................................. 50
3.2.3. Hình thái siêu vi thể ...................................................................... 53
3.2.4. Chất lƣợng sống tế bào mô van tim .............................................. 58
3.2.5. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng mô van tim sau bảo quản ... 61
KẾT LUẬN .................................................................................................... 65
KHUYẾN NGHỊ............................................................................................ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BME

: Basal Medium Eagle/ Môi trƣờng cơ bản.

CPA

: Cryoprotectant agents /Chất bảo vệ lạnh.

DMEM

: Dulbecco’s modified Eagle’s medium.

DMSO

: Dimethylsulphoxide.

FBS

: Fetal bovine serum / Huyết thanh bào thai bò.

GAGs

: Glycosaminoglycans.

H.E

: Hematoxyline Eosin/ Nhuộm với Hematoxyline và Eosin.

M199

: Medium 199/ Môi trƣờng 199.

RPMI-1640

: Roswell Park Memorial Institute medium 1640/ Môi trƣờng
RPMI1640.

TEM

: Transmission electron microscopy/ Hiển vi điện tử truyền qua


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt quy trình bảo quản tại một số ngân hàng van tim ở châu Âu ....... 18
Bảng 1.2. Tóm tắt quy trình bảo quản tại một số ngân hàng van tim ở Bắc Mỹ ......... 19
Bảng 1.3. Tóm tắt quy trình bảo quản tại một số ngân hàng van tim ở Châu Á
- Úc và Nam Phi ........................................................................... 20
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra quy trình lấy van tim. ......................................... 40
Bảng 3.2. Kết quả thực hiện qui trình xử lý và bảo quản van tim ................. 42
Bảng 3.3. Kết quả cấy khuẩn và nấm các mẫu van tim bảo quản trong các
bƣớc lấy tim, xử lý van tim và bảo quản. .................................... 43
Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả quan sát cấu trúc đại thể van tim của các nhóm
nghiên cứu. ................................................................................... 49
Bảng 3.5. Tổng hợp kết quả quan sát cấu trúc vi thể van tim của các nhóm

nghiên cứu trên tiêu bản nhuộm H.E và nhuộm Masson............ . 52
Bảng 3.6. Kết quả tỷ lệ sống của ngun bào sợi mơ van tim ở các nhóm bảo
quản lạnh sâu................................................................................ 58


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mơ hình hình thành tinh thể đá ngồi tế bào ................................. . 5
Hình 1.2. Mơ hình hình thành tinh thể đá trong tế bào ................................... 6
Hình 1.3. Mơ hình CPA bảo vệ mơ, tế bào trong bảo quản lạnh sâu ............. 11
Hình 1.4. Cơ chế vật lí về sự biến đổi của tế bào tại các tốc độ hạ nhiệt độ
khác nhau trong bảo quản lạnh .................................................. . 13
Hình 1.5. Hình ảnh 4 van tim, nhìn từ trên xuống ....................................... . 21
Hình 1.6. Hình vẽ lá van tim cắt dọc .............................................................. 22
Hình 1.7. Hình ảnh sợi collagen và sợi chun của lá van động mạch chủ (A) ảnh
hiển vi quang học và (B) ảnh hiển vi điện tử quét ....................... 24
Hình 1.8. Hình ảnh tiêu bản nhuộm H-E các lớp lá van tim .......................... 25
Hình 2.1. Sơ đồ mơ hình nghiên cứu ............................................................. 32
Hình 2.2. Lấy một trong ba lá van làm mẫu nghiên cứu ............................... 33
Hình 2.3. Sơ đồ lấy mẫu lá van tim nghiên cứu ............................................. 33
Hình 3.1. Hình ảnh đại thể mơ van tim trƣớc bảo quản và sau bảo quản lạnh.... 49
Hình 3.2. Hình ảnh vi thể mơ van tim sau bảo quản 3 tháng trong mơi trƣờng
có FBS. ......................................................................................... 50
Hình 3.3. Hình ảnh vi thể mơ van tim sau bảo quản 6 tháng ......................... 51
Hình 3.4. Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của van tim sau bảo quản 3
tháng. Hình A, hình B độ phóng đại 2890 lần; hình C độ phóng đại
11560 lần. ..................................................................................... 54
Hình 3.5. Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của van tim sau bảo quản 6
tháng, độ phóng đại 2900 lần. ...................................................... 54
Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm Trypan Blue ngun bào sợi mơ van tim trƣớc và
sau bảo quản với độ phóng đại 300 lần. ...................................... 58

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh lý về tim mạch, trong đó có bệnh về van tim đang gia tăng trên
thế giới. Mỗi năm có gần 300.000 ngƣời cần thay van tim, dự báo lên tới
850.000 ngƣời trƣớc năm 2050 [89]. Có 2 loại van tim đƣợc sử dụng thay thế
van bệnh lý hiện nay đó là: van cơ học và van sinh học bao gồm: van nhân tạo
sinh học từ động vật và van đồng loài (homograft). Thực tế, van sinh học đƣợc
ƣu tiên sử dụng ở các trung tâm phẫu thuật tim mạch trên thế giới [79]. Ví dụ
tại Đức, năm 2008 trong tổng số 12000 bệnh nhân có tới 78% bệnh nhân ghép
van sinh học, 21% là ghép van cơ học và chỉ 1% van đƣợc sửa [27].
Van nhân tạo sinh học có nguồn gốc từ động vật nhƣ lợn, bị..., đã qua
các khâu xử lý, có ƣu điểm là ít phải sử dụng thuốc chống đơng, nhƣng lại có
thời gian sử dụng rất ngắn, chỉ khoảng 6-8 năm ở ngƣời trẻ tuổi. Để giải quyết
tình trạng này, nhiều nhà khoa học đã sử dụng van tim từ ngƣời cho chết não,
cịn tế bào sống để ghép đồng lồi. Trong giai đoạn đầu là kỹ thuật ghép van
tim tƣơi – tức là lấy van + bảo quản tƣơi + sử dụng trong vòng 2 tuần. Tuy
nhiên, việc lấy và ghép van tim tƣơi từ ngƣời cho chết não thƣờng bị động, mô
van tim chỉ sống đƣợc trong một thời gian rất ngắn. Vì vậy việc chuẩn bị bệnh
nhân để ghép phải hết sức khẩn trƣơng. Trong nhiều trƣờng hợp kích thƣớc van
tim của ngƣời cho và ngƣời nhận khơng phù hợp. Để khắc phục hiện tƣợng
này, nhằm chủ động đƣợc nguồn cho và nguồn nhận, nhiều nhà khoa học trên
thế giới đã nghiên cứu quy trình bảo quản van tim phục vụ cấy ghép đồng loài.
Việc bảo quản van tim, mạch máu nhằm giúp cho các bác sỹ lâm sàng ln có
đƣợc nguồn van tim dự trữ để có thể sử dụng một cách chủ động và phù hợp
với kích cỡ, chủng loại của từng bệnh nhân cần thay thế. Van tim lấy từ đồng
lồi vừa khơng cần dùng thuốc chống đơng, lại có thể sử dụng đƣợc tới trên 20
năm mới thối hóa, có ƣu thế vƣợt trội các van tim nhân tạo khác.

1

Trên thế giới hiện có nhiều qui trình bảo quản van tim, mạch máu cho nhiều
mục đích khác nhau. Để có thể sử dụng trên lâm sàng, van tim sau bảo quản
lạnh cần phải đảm bảo yêu cầu không biến đổi cấu trúc hình thái cũng nhƣ khả
năng sống của tế bào. Nhằm nghiên cứu, ứng dụng qui trình bảo quản lạnh van
tim và đánh giá hiệu quả của nó thông qua chất lƣợng van tim sau bảo quản giúp
các đơn vị, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng quy trình bảo
quản lạnh van tim trên thực nghiệm” với hai mục tiêu:
1. Đánh giá hiệu quả xử lý van tim về khía cạnh vi sinh để ứng dụng làm mơ
ghép y tế.
2. Đánh giá hình thái cấu trúc mô, siêu cấu trúc và khả năng sống của
nguyên bào sợi trong mô van tim lợn sau bảo quản lạnh sâu làm mô ghép
y tế.
Đây là một phần của đề tài cấp Bộ y tế đã phê duyệt : “Nghiên cứu xây dựng
quy trình lấy, bảo quản và ghép van tim đồng loại”.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1.

LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN MÔ, TỔ CHỨC VAN TIM
Van tim ngƣời tự thân (homograft) đã đƣợc sử dụng trong phẫu thuật

cách đây hơn 50 năm. Ca cấy ghép đầu tiên thực hiện bởi Gordon Murray
bằng việc sử van động mạch chủ tƣơi tại Toronto đƣợc báo cáo năm 1956
[19]. Bắt đầu từ đó, homograft hay van tim đồng loại đƣợc sử dụng trong

ghép van tim. Điều này đƣợc thiết lập rõ ràng bằng việc ghép van động mạch
chủ đầu tiên trên lâm sàng của Donald Ross năm 1962 và Barratt Boyes năm
1965 [10, 15]. Vào thời điểm đó, họ là những ngƣời duy nhất thành cơng trong
việc ghép van tim sinh học bên cạnh ghép van cơ học. Những năm sau đó việc
xử lý van tim đã có nhiều thay đổi lớn, những van tim ngƣời đầu tiên đƣợc bảo
quản sử dụng các tác nhân hóa học nhƣ formalin, glutaraldehyde,
betapropriolactone và sau đó là decade ethylene oxide. Van tim nhân tạo đƣợc
giới thiệu và sử dụng vào những năm 1960 trƣớc khi mơ ghép dị lồi ra đời
vào những năm 1970 [63]. Tuy nhiên, do kém độ bền lâm sàng và khả năng
sống tế bào của mơ ghép đồng loại đã qua xử lý hóa học mà việc sử dụng mô
ghép loại này ngày càng giảm [20] cho đến khi sử dụng kháng sinh khử trùng
liều thấp và sau đó là bảo quản lạnh sâu và bảo quản trong nitơ lỏng ra đời.
Năm 1987, O’Brien đã báo cáo ca ghép van đồng loài bảo quản lạnh sâu cho
kết quả sau ghép rất tốt đã mở ra kỷ nguyên mới cho việc sử dụng van đồng
loài bảo quản lạnh sâu trên toàn thế giới [62].
Năm 2011, Kelvin G.M và cộng sự đã nghiên cứu trên thực nghiệm bảo
quản 15 van tim cừu bằng kỹ thuật bảo quản lạnh khơng hình thành tinh thể
đá. Các van tim đƣợc bảo quản trong dung dịch chứa 12,6 mol/l chất bảo vệ

3


lạnh (4,65 và 3,31 mol/l dimethylsulfoxide, formamide and 1,2-propanediol)
và bảo quản ở - 80°C. Trƣớc khi đƣa vào bảo quản lạnh, các van tim đƣợc
làm lạnh theo chƣơng trình trong thiết bị đặc biệt. Sau ba tháng, một số van
đƣợc lấy ra khỏi môi trƣờng để đánh giá chất lƣợng trên hình ảnh đại thể, vi
thể và siêu vi thể. Kết quả cho thấy khơng có biểu hiện tổn thƣơng cấu trúc do
các tinh thể đá. Các van còn lại đƣợc ghép đồng loại trên cừu. Sau ba và sáu
tháng sau ghép, kiểm tra bằng siêu âm doppler cho thấy các van tim hoạt động
tốt. Các tác giả nhận xét đây là phƣơng pháp bảo quản lạnh khơng hình thành

tinh thể đá. Van tim đƣợc bảo quản bằng phƣơng pháp này không bị tổn
thƣơng, chức năng hoạt động tốt khi kiểm tra ở hai thời điểm 6 và 12 tháng
sau ghép trên cừu [38].
Hiện nay nhiều cơng trình tập trung nghiên cứu khả năng sống của tế bào
sau khi van tim đƣợc bảo quản lạnh. Niwaya K nghiên cứu khả năng sống của
tế bào van tim ngƣời ghép đồng loại sau khi đƣợc bảo quản lạnh, Gall KL
nghiên cứu khả năng sống của tế bào và quy trình xử lí van tim ghép đồng
loại, O'Brien MF nghiên cứu các tế bào trong các van tim ghép đồng loại bảo
quản lạnh sâu, Wassenaar C nghiên cứu sự đứt gẫy các mô trong trong van
động mạch chủ bảo quản lạnh sâu rã đông nhanh [21, 59, 85].
Tại Việt Nam, từ những năm 1997, Tôn Thất Bách, Nguyễn Ngọc
Hùng, Nguyễn Hữu Ƣớc và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng quy trình lấy
và bảo quản van tim từ 21 ngƣời cho chết não. Tuy nhiên cơng trình mới
chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá khả năng nhiễm khuẩn và biến đổi đại thể
sau bảo quản ở các thời điểm khác nhau, tối đa là 118 ngày, chƣa đƣợc ứng
dụng trên lâm sàng [3].
Năm 2010, khoa phẫu thuật tim mạch và lồng ngực, Bệnh viện Việt Đức
đã cấy ghép thành công hai van tim, một bệnh nhân đƣợc thay van là nam, 35
tuổi, ngƣời Hà Giang, bị hỏng van động mạch chủ, trƣờng hợp còn lại là một

4


cháu bé 11 tuổi, bị dị tật bẩm sinh ở tim và phải ghép van động mạch phổi.
Hai van tim này đƣợc lấy từ một bệnh nhân tử vong do chết não - đƣợc ngƣời
nhà hiến nội tạng cho bệnh viện. Cho đến nay, đã có hàng chục bệnh nhân
đƣợc cấy ghép van tim, mạch máu tƣơi đồng loài lấy từ ngƣời cho chết não tại
Bệnh viện Việt Đức.
1.2.

MỘT SỐ VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN PHƢƠNG PHÁP BẢO
QUẢN LẠNH SÂU MÔ VAN TIM
Nguyên lý của việc trữ lạnh là khi ở nhiệt độ thấp thì chuyển hóa tế bào

giảm, sự tiêu thụ oxy và các chất dinh dƣỡng cũng giảm. Nhờ đó, tế bào sống
ở “trạng thái ngủ” và có thể bảo quản trong một thời gian dài. Nhiệt độ của
mẫu mô sẽ đƣợc giảm đến mức âm sâu -135OC với hơi nitơ lỏng hay -196OC
trong nitơ lỏng.
Tuy nhiên, điểm bất lợi đầu tiên gặp phải là các mô, tế bào khi bảo quản
ở nhiệt độ âm sâu sẽ có hiện tƣợng hình thành tinh thể đá bên trong và ngoài
tế bào gây hậu quả phá hủy màng tế bào, làm giảm khả năng sống của tế bào
sau rã đông (hình 1.1 và 1.2) [17].

Hình 1.1. Mơ hình hình thành tinh thể đá ngồi tế bào [17].
A: Tế bào bình thường; B: Tinh thế đá hình thành khiến tế bào co lại;
C: Các tế bào đã bị đè bẹp bởi các những tinh thế đá lớn.

5


Hình 1.2. Mơ hình hình thành tinh thể đá trong tế bào [17].
A: Nước ở trạng thái lỏng di chuyển tự do trong tế bào;
B: Nước hình thành tinh thể đá có thể phá vỡ màng tế bào và dịch chuyển các
thành phần trong tế bào.

Ngoài ra, bảo quản lạnh mơ cịn gặp một số khó khăn nhƣ: Mỗi mơ là
một hỗn hợp của các loại tế bào khác nhau. Một mặt, chúng thể hiện sự nhạy
cảm khác nhau với các tổn thƣơng đông lạnh nên việc lựa chọn của một
chƣơng trình bảo quản lạnh có thể bảo quản đƣợc một số loại tế bào này,
nhƣng có thể gây tổn thƣơng một số loại tế bào khác. Mặt khác, sự khơng

đồng nhất về cấu trúc mơ, có thể dẫn đến những nứt, vỡ mơ trong q trình
bảo quản lạnh. Khối lƣợng và hình dạng mơ cũng là một yếu tố có thể gây
khó khăn nếu mơ q dày hoặc khối lƣợng lớn sẽ ngăn cản cân bằng nhiệt độ
ở bề mặt và bên trong mẫu mô, dẫn đến sự không đồng nhất nhiệt độ trong
mẫu mô bảo quản lạnh. Quá trình đóng gói ảnh hƣởng đến sự tiếp cận của mơ
với các chất bảo quản lạnh (CPA) có thể dẫn đến sự trao đổi nƣớc qua màng
và hình thành tinh thể đá [93]. Vì vậy, mỗi bƣớc tiến hành trong quy trình bảo
quản lạnh sâu đều là những yếu tố tác động đến chất lƣợng của mô sau bảo
quản. Cần phải tiến hành các nghiên cứu từng bƣớc giải quyết các vấn đề khó
khăn, đem lại kết quả bảo quản tốt nhất, đƣa ra một quy trình bảo quản lạnh
sâu phù hợp và thống nhất cho mô van tim.

6


1.2.1. Khử trùng bằng hỗn hợp kháng sinh
Quá trình thu thập và xử lý mẫu van tim rất khó có thể thực hiện trong
mơi trƣờng vơ khuẩn hồn tồn. Vì vậy, việc khử khuẩn trong quá trình xử lý
là cần thiết.
Trƣớc đây, các chất đƣợc dùng để khử khuẩn ban đầu bao gồm: ethylene
oxide, beta-propiolactone, formalin, phóng xạ gamma… Tuy nhiên các chất trên
làm cho cấu trúc của van tim bị hƣ hỏng, gây ra hiện tƣợng vơi hóa làm giảm
hiệu quả trên lâm sàng, nên những chất này không đƣợc sử dụng nữa. Hiện nay,
phƣơng pháp khử khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến và chấp nhận rộng rãi là sử
dụng các kháng sinh phổ rộng nhƣ: Gentamycin, Methicillin, Erythromycin,
Penicillin, Streptomycin, Kanamycin, Metronidazol, Cefoxitin, Lincomycin,
PolymyxinB, Vancomycin, Amphotericin B…[93].
Một số tác giả cho rằng nên khử khuẩn bằng hỗn hợp kháng sinh ở nhiệt
độ 4°C có thể tăng tác dụng và giảm độc tính của kháng sinh với mơ tế bào [93].
Tuy nhiên, khơng thể loại trừ có những trƣờng hợp nhiễm vi khuẩn

kháng kháng sinh nên trƣớc khi cấy ghép bất cứ mẫu ghép nào cũng cần sàng
lọc tránh ghép những mẫu bị nhiễm khuẩn cho bệnh nhân [8].
Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản lạnh sâu, các thuốc kháng sinh cịn
lại trong mơ sẽ tập trung lại gây tổn thƣơng tế bào tƣơng tự nhƣ các tinh thể
đá. Hơn nữa hầu hết các kháng sinh đều có độc tính nhất định đối với mơ, tế
bào. Do đó, sau khi khử khuẩn thì cần, loại bỏ các kháng sinh cịn trong mẫu
van tim trƣớc khi tiến hành bảo quản lạnh [8].
1.2.2. Môi trƣờng bảo quản
Để bảo quản lạnh mô, tế bào thì tổ chức này cần đƣợc ngâm trong mơi
trƣờng bảo quản. Môi trƣờng bảo quản là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần
khác nhau, thơng thƣờng gồm có 3 loại: môi trƣờng cơ bản, huyết thanh và
chất bảo vệ lạnh.

7


1.2.2.1. Môi trường cơ bản
Môi trƣờng cơ bản là môi trƣờng có chứa các chất dinh dƣỡng thiết yếu
(MEM – Minimum Essential Media) cung cấp cho tế bào sống và phát triển
nhƣ: các acid amin, glucose, muối khống, vitamin….
Mơi trƣờng cơ bản nhân tạo đầu tiên đã đƣợc Harry Eagle tạo ra (gọi là
BME - Eagle's Basal Medium) là một trong những môi trƣờng nuôi dƣỡng
đƣợc sử dụng rộng rãi. Mục đích ban đầu của ơng nhằm để ni dƣỡng
ngun bào sợi của động vật có vú bình thƣờng. Sau đó, những nhà nghiên
cứu khác đã chỉ ra rằng việc cải biến môi trƣờng cơ bản của Eagle, bổ sung
hoặc thay đổi nồng độ các chất có thể hỗ trợ tăng trƣởng cho nhiều loại tế bào
khác nhau, có thể gồm cả những tế bào khó ni cấy.
Mơi trƣờng cơ bản hiện nay hay sử dụng cho bảo quản lạnh sâu mô van
tim là DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium), RPMI 1640 (Roswell
Park Memorial Institute 199), M199 (Medium 199) [29].

1.2.2.2. Chất bảo vệ lạnh
Nƣớc là thành phần chủ yếu ở môi trƣờng ngoại bào cũng nhƣ trong tế
bào. Khi nhiệt độ xuống thấp dƣới 0oC, nƣớc ở bên trong tế bào hay bên ngoài
tế bào từ trạng thái lỏng sẽ chuyển sang trạng thái rắn bằng việc hình thành
các tinh thể đá. Đây chính là yếu tố ảnh hƣởng quan trọng nhất đến khả năng
sống của tế bào. Tinh thể đá có thể gây tổn thƣơng cơ học lên màng tế bào
cũng nhƣ các bào quan bên trong tế bào (hình 1.2). Thêm nữa, khi nhiệt độ
càng thấp, các phân tử nƣớc hình thành tinh thể đá càng nhiều dẫn đến lƣợng
nƣớc ở thể lỏng giảm dần, hậu quả là nồng độ các chất hịa tan trong mơi
trƣờng ngoại bào tăng gây mất cân bằng về áp lực thẩm thấu giữa bên trong tế
bào và bên ngoài tế bào. Nƣớc từ bên trong tế bào sẽ bị kéo ra ngoài, làm tế
bào bị co nhỏ lại, nếu bị co nhỏ quá mức sự tổn thƣơng màng lipoprotein là
không thể phục hồi. Vì vậy, điều tiên quyết trong quá trình bảo quản lạnh là
hạn chế việc hình thành tinh thể đá.

8


Việc bảo quản lạnh mô van tim chỉ thực sự phát triển từ khi chất bảo
quản lạnh (Cryoprotectant agents - CPA) đƣợc đƣa vào sử dụng. Đây là các
chất hòa tan đƣợc trong nƣớc và gây cản trở sự chuyển trạng thái giữa nƣớc
và đá. Chúng tƣơng tác với những phân tử sinh học với vai trò “thay thế
nƣớc” trong tế bào vì vậy gây hạn chế hình thành tinh thể đá nội bào. Điều
này cũng sẽ giúp làm giảm sự gia tăng nồng độ của các chất hòa tan. Ngồi
ra, các chất CPA cịn gắn lên màng bào tƣơng để bảo vệ tế bào khi các phân
tử nƣớc ngoại bào bắt đầu chuyển sang dạng tinh thể. Hai nhóm chất bảo vệ
lạnh thƣờng đƣợc sử dụng trong bảo quản lạnh là CPA có khả năng thẩm thấu
(permeable CPA) và CPA khơng có khả năng thẩm thấu (non- permeable
CPA). Hai loại này có tính chất và cơ chế hoạt động khác nhau, nhƣng hỗ trợ
nhau trong vai trò là tác nhân khử nƣớc bên trong tế bào, giúp hạn chế hình

thành tinh thể đá nội bào (hình 1.3).
CPA có khả năng thẩm thấu (permeable CPA) là những phức hợp
oligohydroxy: ethylene glycol, propylene glycol, acetamid, glycerol,
dimethylsulphoxide (DMSO)…, hòa tan đƣợc trong nƣớc, khả năng gây độc
cho tế bào thấp, có khối lƣợng phân tử nhỏ nên có thể xâm nhập vào tế bào
qua màng bào tƣơng. Khi đó chúng sẽ thế chỗ các phân tử nƣớc, giúp giảm
hình thành tinh thể đá nội bào do đó giảm tổn thƣơng tế bào. Mặt khác, sự có
mặt của các CPA này ở bên ngoài tế bào sẽ làm gia tăng đáng kể nồng độ các
chất hòa tan ngoại bào so với bên trong tế bào điều đó làm mất cân bằng về áp
suất thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Nƣớc bên trong tế bào sẽ
rút bớt ra ngoài tế bào. Đồng thời, do có vai trị thay thế các phân tử nƣớc bên
trong tế bào của CPA giúp cho kích thƣớc tế bào nhanh chóng phục hồi sau
khi nƣớc rút khỏi tế bào, nhờ vậy làm giảm đƣợc hiện tƣợng tổn thƣơng màng
tế bào khi tế bào ở trạng thái co nguyên sinh quá lâu.

9


CPA khơng có khả năng thẩm thấu (non-permeable CPA) thƣờng đƣợc
sử dụng là sucrose hay các oligosaccharide khác: trehalose, glucose,
galactose..., có trọng lƣợng phân tử cao khơng có khả năng xâm nhập vào tế
bào qua màng bào tƣơng. Trong pha đầu tiên, khi làm lạnh, do có trọng lƣợng
phân tử lớn và không thấm nên chất này sẽ kéo nƣớc ra ngồi tế bào nhanh
hơn các CPA có khả năng thấm qua màng tế bào. Ngƣợc lại, khi rã đông nƣớc
từ ngoại bào sẽ có xu hƣớng đi vào tế bào nhanh hơn do nồng độ chất tan
trong tế bào cao. Tình trạng này làm cho hình dạng tế bào bị thay đổi, co nhỏ
trong quá trình mất nƣớc và nở to khi rã đông. Nếu sự thay đổi về thể tích
vƣợt q 40% so với ban đầu thì có thể ảnh hƣởng đến cấu trúc bên trong tế
bào. Vai trị của các CPA khơng thẩm thấu lúc này (do có trọng lƣợng phân tử
cao khơng xâm nhập đƣợc vào tế bào) sẽ giúp đỡ các CPA thẩm thấu trong

việc duy trì sự chênh lệch thẩm thấu trong pha khử nƣớc tế bào làm hạn chế
sự thay đổi thể tích quá mức của tế bào.
CPA đƣợc lựa chọn trong quản lạnh sâu cần phải có độc tính thấp với
mơ bảo quản. Thời gian tiếp xúc của mô với CPA phải đủ dài để hấp thụ
lƣợng CPA cần thiết có tác dụng bảo vệ, đồng thời cũng phải đủ ngắn để giảm
thiểu thời gian tiếp xúc với các thuộc tính độc hại của các chất đó.
Một số CPA thƣờng đƣợc sử dụng trong bảo quản mô van tim nhƣ:
DMSO, glycerol, glycol, sucrose,…Trong đó, DMSO là chất đƣợc lựa chọn
sử dụng trong nhiều nghiên cứu. DMSO có khả năng hịa tan nhiều loại chất
hữu cơ hòa tan khác nhau nhƣ carbohydrate, polymer và peptid cũng nhƣ các
chất vơ cơ và khí. Khả năng thấm nhanh qua màng tế bào của DMSO làm rút
ngắn đƣợc thời gian tiếp xúc của tế bào với môi trƣờng CPA, do vậy hạn chế
bớt những tác động không mong muốn của CPA lên tế bào. Tuy nhiên, nhƣợc
điểm của DMSO là khả năng gây độc cho tế bào cao, đặc biệt là khi ở nhiệt
đô cao và thời gian tiếp xúc kéo dài. Do đó, trong bảo quản lạnh ngƣời ta

10


thƣờng để mơ tiếp xúc với mơi trƣờng có DMSO ở nhiệt độ thấp (0 - 4oC)
nhằm giảm độc tính của DMSO với tế bào.
Năm 1985, Armiger thực hiện nghiên cứu bảo quản lạnh van tim chó và
ngƣời có sử dụng dung dịch 10% DMSO sau thời gian bảo quản khác nhau từ
23 - 380 ngày, kết quả thu đƣợc cho thấy cấu trúc và tỷ lệ tế bào sống khơng
có sự khác biệt đáng kể. Nhƣ vậy, việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh để ngăn
chặn sự hình thành tinh thể đá, với kiểm sốt tỷ lệ đóng băng và tan băng
nghiêm ngặt, cho phép cả giữ lại cấu trúc và khả năng sống của tế bào [7].
Trong quy trình bảo quản lạnh sâu mơ van tim của Robert, Kelvin và các
cộng sự đƣợc cấp bằng sáng chế tại Mỹ năm 1990, các tác giả cũng đã lựa
chọn sử dụng chất bảo vệ lạnh là DMSO [68].

Hình 1.3. Mơ hình CPA bảo vệ mơ, tế bào trong bảo quản lạnh sâu[7].
A: Bảo quản lạnh sâu khơng có CPA, các phân tử nước kết hợp với nhau
thành tinh thể đá;
B: Bảo quản lạnh sâu có CPA (phân tử màu vàng) các phân tử nước không
kết tinh thể đá.

1.2.2.3. Huyết thanh
Huyết thanh sử dụng trong môi trƣờng bảo quản cũng đƣợc nhiều tác
giả tán thành. Theo các tác giả này thì mơi trƣờng bảo quản cần bổ sung ít
nhất là 20% huyết thanh có tác dụng dinh dƣỡng cho tế bào giai đoạn sau rã

11


đơng, góp phần tăng tỷ lệ sống của tế bào, mô. Loại huyết thanh hay đƣợc sử
dụng hiện nay là FBS (huyết thanh bào thai bò) [8, 55, 61, 67].
Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu nhận định rằng việc sử dụng
huyết thanh trong môi trƣờng bảo quản là không cần thiết đối với các loại mô
van tim của cả ngƣời và động vật. Năm 1994, Nakayama và cộng sự đã tiến
hành nghiên cứu so sánh giữa hai nhóm mơ van tim bảo quản lạnh sâu có và
khơng sử dụng FBS, kết quả thu đƣợc khơng có sự khác biệt đáng kể về khả
năng sống của các nguyên bào sợi giữa hai nhóm vào bất cứ thời điểm nào.
Theo đó, FBS khơng nhất thiết phải sử dụng trong bảo quản lạnh mô van tim
[57]. Mới đây, năm 2011, Kelvin và cộng sự cũng đƣa ra kết quả nghiên cứu
cho rằng khơng có sự khác biệt đáng kể nào về mơ học, sinh học giữa các
nhóm van tim bảo quản lạnh sâu có và khơng sử dụng FBS [37].
Khơng những thế, có tác giả cịn cho rằng việc sử dụng FBS trong quá
trình bảo quản lạnh sâu làm suy giảm đáng kể số lƣợng tế bảo sống của mô
van tim so với nhóm khơng sử dụng FBS. Feng và cộng sự (1996) đã đánh giá

sự ảnh hƣởng của FBS đến lớp nội mô của van động mạch chủ lợn bảo quản
lạnh sâu, kết quả chỉ ra rằng nhóm mơ van tim có sử dụng FBS có số lƣợng tế
bào nội mơ sống thấp hơn đáng kể so với nhóm khơng sử dụng FBS [18].
1.2.3. Tốc độ hạ nhiệt độ
Cơ chế vật lí, tại -10 oC màng tế bào bắt đầu thay đổi, nƣớc từ trong tế
bào thoát ra khoảng gian bào. Ở khoảng nhiệt độ từ -10o C đến -30o C, nếu tốc
độ làm mát tế bào diễn ra chậm (theo các nghiên cứu là khoảng 0,15-1,7o
C/phút) nƣớc thoát ra khoảng gian bào nhiều do tăng áp lực thẩm thấu, tế bào
mất nƣớc rất nặng, dẫn đến kích thƣớc tế bào giảm đi và lúc này các tinh thể
đá đƣợc hình thành ở khoảng gian bào.
Nếu tốc độ làm lạnh tế bào đủ chậm, khoảng 1o C/phút, tế bào cũng mất
nƣớc nhƣng khơng q nhanh, thể tích tế bào cũng giảm đi nhƣng ít hơn. Và
để giữ đƣợc thể tích của tế bào cần phải cho thêm các chất bảo vệ lạnh.
12


Nếu tốc độ làm lạnh nhanh (5 - 10o C/phút hoặc hơn), nƣớc bên trong tế
bào không bị mất đi nhanh, mà bị giữ lại trong tế bào, dẫn đến hình thành các
tinh thể đá ở cả trong và ngồi tế bào (hình 1.4). Nhƣ vậy, muốn duy trì thể tích
tế bào cũng nhƣ tránh hình thành tinh thể đá cả trong và ngồi tế bào cần có một
tốc độ làm lạnh hợp lí, khơng q nhanh và khơng q chậm và phù hợp với
từng loại mô gọi là hạ nhiệt độ theo chƣơng trình. Hiện có khá nhiều chƣơng
trình hạ nhiệt độ đang áp dụng trên thế giới cho từng loại mơ, tế bào.

Hình 1.4. Cơ chế vật lí về sự biến đổi của tế bào tại các tốc độ hạ nhiệt độ
khác nhau trong bảo quản lạnh [40, 93].
Các nghiên cứu về khả năng sống của các loại tế bào khác nhau của
động vật có vú, bảo quản lạnh sâu tế bào hoặc mô, sử dụng glycerol hoặc
DMSO, làm lạnh với các tốc độ khác nhau cho thấy rằng khả năng sống tối ƣu
của mô, tế bào động vật có vú bảo quản lạnh sâu với một tốc độ làm lạnh ở

khoảng giữa 0,3°C/phút đến 10°C/phút [40, 93].
Theo Muller (2009), để giảm thiểu tổn thƣơng tế bào phải cân bằng các
chất CPA, việc làm lạnh phải đƣợc thực hiện từ từ, có thể lập trình 1°C/phút
đối với mơ động mạch, 0,6°C/phút đối với mô tĩnh mạch [17]. Năm 2013,
Stacy và David đã chỉ ra tốc độ làm lạnh phù hợp với mô tim mạch là

13


1°C/phút, và chỉ cần một sự thay đổi nhỏ trong dung dịch chất bảo quản cũng
dẫn đến không thể duy trì đƣợc hằng định 1°C/phút, nhƣ vậy chƣơng trình bảo
quản lạnh có kiểm sốt rất nhạy với những thay đổi của dung dịch bảo quản [76].
Năm 1996, Ketheesan và cộng sự tiến hành nghiên cứu bảo quản mô van tim với
các tốc độ làm lạnh khác nhau cho thấy khả năng sống của mô van tim giảm
đáng kể khi sử dụng những tốc độ làm lạnh lớn hơn 1°C/phút [42].
1.2.4. Nhiệt độ bảo quản
Nhiệt độ bảo quản mô cần phải đủ thấp để ngăn chặn sự gia tăng của các
tinh thể đá qua thời gian. Nhiệt độ này nên thấp hơn điểm nhiệt độ chuyển
tiếp sang dạng thủy tinh của mơi trƣờng để ngăn chặn các phản ứng hóa học.
Nhiệt độ chuyển tiếp sang dạng thủy tinh của nƣớc tinh khiết là -139°C, của
các môi trƣờng thông thƣờng trong khoảng xung quanh -120°C. Một hệ thống
bảo quản tiện lợi là nitơ lỏng ở -196°C hoặc pha hơi của nitơ lỏng (-150°C
đến -160°C). Ngồi ra, hiện nay thị trƣờng cịn có ngày càng nhiều các loại tủ
lạnh cơ học có thể duy trì nhiệt độ dƣới -135°C một cách an tồn [93].
Kelvin và cộng sự (1992), cho rằng các lá van tim đƣợc bảo quản ở nhiệt
độ dƣới -135°C bảo tồn đƣợc các nguyên bào sợi, trong khi bảo quản ở nhiệt
độ trên -80°C cho thấy sự giảm đáng kể các nguyên bảo sợi [39].
Năm 1996, Feng và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu sự ảnh hƣởng
của nhiệt độ đến tế bào nội mô van động mạch chủ lợn, kết quả cho thấy
+ Các van bảo quản ở 4°C, sau 4 ngày, số lƣợng tế bảo giảm không đáng

kể, sau 14 ngày hầu nhƣ không thấy tế bào sống.
+ Các van bảo quản ở -80°C thì sau 8 tuần các tế bào cịn lại rất ít.
+ Các van bảo quản ở -170°C thì cho đến 6 tháng sau đó mới phát hiện
giảm số lƣợng tế bào có ý nghĩa thống kê, và tỷ lệ này vẫn không đổi đến 1
năm sau bảo quản [18]
Tuy nhiên, đến năm 2011, Kelvin cùng nhiều cộng sự đã đƣa ra kết
luận rằng việc bảo quản mô van tim ở nhiệt độ xung quanh -80°C vẫn bảo tồn

14


đƣợc những thuộc tính cơ học của van tim. Các tác giả dự đốn rằng chính
khả năng sống của tế bào thấp có thể làm giảm phản ứng miễn dịch trong cơ
thể sau khi ghép. Việc bảo quản van tim ở nhiệt độ -80°C cịn có thể làm giảm
chi phí bảo quản và đảm bảo tốt hơn về an toàn lao động khi không phải dùng
nitơ lỏng [41].
1.2.5. Rã đông và loại bỏ dung dịch bảo quản
Rã đông cũng là một giai đoạn quan trọng để tránh tái xuất hiện tinh thể
đá. Yêu cầu của mô sau bảo quản lạnh:
 Về mặt sinh học: phải còn tế bào sống, trong đó chú ý đến nguyên bào
sợi - nguồn sản sinh collagen đầy đủ chủng loại, kích thƣớc - thành
phần chính của các mô van tim, mạch máu và là yếu tố quyết định khả
năng hoạt động của các cơ quan này.
 Về mặt cơ học: Không biến đổi cấu trúc, giữ đƣợc độ bền.
Chất lƣợng của mỗi mẫu mô sau bảo quản lạnh sâu phụ thuộc vào hai
yếu tố chính là: khả năng sống mô, tế bào sau thời gian bảo quản và hiệu quả
loại bỏ CPA độc hại tiềm tàng trong mơ.
Tốc độ rã đơng nhanh và pha lỗng CPA đƣợc thực hiện đa bƣớc để
tránh tổn thƣơng mô, tế bào do mức độ chênh lệch áp lực thẩm thấu nhỏ là
quan điểm đƣợc nhiều tác giả đồng ý [23, 60, 93].

Năm 1987, Robert, Kelvin và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đƣa
ra một quy trình đầy đủ cho bảo quản lạnh sâu mô van tim. Họ cho rằng một
tốc độ rã đơng nhanh và pha lỗng CPA bằng nhiều bƣớc sẽ giúp giảm thiểu
các tổn thƣơng mô tế bào sau bảo quản. Các mô van tim đƣợc rã đơng và pha
lỗng CPA theo một quy trình chung là: Các túi mô van tim lấy ra từ nơi bảo
quản đƣợc đặt trong một chậu nƣớc muối hoặc nƣớc nhiệt độ từ 37°C đến
42°C trong vòng 10 phút đến 15 phút, sau đó lần lƣợt chuyển sang các môi
trƣờng chứa 7,5% CPA trong 1 phút, 5% CPA trong 1 phút, cuối cùng là

15


ngâm ở môi trƣờng không chứa chất bảo quản. Quy trình này đã đƣợc cấp
bằng sáng chế lần đầu tiên tại Mỹ vào năm 1990 [68].
Nghiên cứu của Gatto và cộng sự (2013), cho thấy mô van tim và mô
động mạch bảo quản lạnh sâu có khả năng phát tán DMSO chậm hơn đáng kể
hơn so với mô tĩnh mạch. Khoảng 20% lƣợng CPA (so với ban đầu) vẫn đƣợc
phát hiện trong các mô van và động mạch sau 15 phút rửa liên tục. Trong khi,
các mô tĩnh mạch gần nhƣ rửa hết CPA trong cùng điều kiện. Theo đó, các tác
giả đã đề xuất một quy trình rửa gồm có hai bƣớc rửa liên tiếp với tổng cộng
25 phút đối với các mô van tim, mô động mạch và 15 phút đối với các mô
tĩnh mạch. Đây là quy trình đƣợc các tác giả này đánh giá là đáng tin cậy đảm
bảo việc loại bỏ hơn 95% lƣợng DMSO bổ sung ban đầu [22].
Tuy nhiên, Armitage và cộng sự (2004) đã tiến hành nghiên cứu nhằm
giảm bớt thời gian rã đơng và pha lỗng CPA. Các tác giả cho rằng mô van
tim thƣờng chỉ tiếp xúc với 10% DMSO và DMSO có xu hƣớng vƣợt qua
màng tế bào dễ dàng, vì vậy một quy trình pha lỗng đa bƣớc cho việc loại bỏ
DMSO với nồng độ này sau khi rã đông là điều không nên. Kết quả trong
nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự pha loãng đơn bƣớc vẫn giữ đƣợc tỷ lệ các
nguyên bào sợi của lá van tim tốt tƣơng đƣơng với một quy trình pha lỗng 4

bƣớc. Đồng thời trong nghiên cứu này, Armitage và cộng sự cho rằng cách
duy nhất để tăng tốc độ nóng lên mà không làm tăng nhiệt độ của chậu nƣớc
rã đơng (37°C) là giảm thể tích dung dịch CPA đƣợc sử dụng để bảo quản
lạnh trƣớc đó. Theo đó, các mẫu van tim sẽ đƣợc làm tăng nhiệt độ từ từ đến 80°C, sau đó chúng đƣợc đem ngâm vào chậu nƣớc 37°C. Thời gian cần thiết
để làm nóng từ -79°C đến 0°C là 8 phút (SD = 1,1 phút) cho 100 ml dung
dịch CPA và 4 phút (SD = 0,6 phút) cho 50 ml dung dịch CPA. Tƣơng đƣơng
với tốc độ rã đông từ 10 - 20°C/phút mà vẫn khơng ảnh hƣởng đến sự tồn
vẹn của ngun bào sợi. Điều đó đã rút ngắn thời gian thực hiện rã đông và

16