Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG
THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG CÂY HƯƠNG
THẢO (ROSMARINUS OFFICINALIS L.) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC

Chun ngành:

Hóa phân tích

Mã số:

8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. Tạ Thị Thảo
2. TS. Lê Thị Huyền

Hà Nội - 2020


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất
tới PGS. TS. Tạ Thị Thảo và TS. Lê Thị Huyền - những người Thầy đã tận tâm
hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô trong bộ mơn hố phân tích và
các cán bộ phịng đào tạo sau đại học của trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại
học Quốc Gia Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn các anh chị phịng Nghiên cứu cấu trúc - Viện
Hóa Sinh biển đã quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý
q báu trong việc thực hiện và hồn thiện luận văn.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới tồn thể gia đình,
bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tơi trong
suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2020

Học viên

Lê Thị Oanh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC ...................................................................................................................i
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae)

2

1.2. Chi Rosmarinus
1.3. Loài Hương thảo (R. officinalis L.)

2
3

1.3.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3
1.3.2. Nguồn gốc phân bố ...................................................................................4
1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học ...........................................4
1.3.4. Cơng dụng và hoạt tính sinh học lồi R. officinalis ..................................9
1.4. Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của lồi R. officinalis
11
1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu ..............11
1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong lồi R. officinalis

………………………………………………………………………….12
1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu ........14
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu
16
2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
16
2.2.1. Chất chuẩn ............................................................................................... 16
2.2.2. Các hoá chất khác....................................................................................17
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu
18
2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất ...........18
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất .................................................21
2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký .....................................................21
2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu ..........................................................................22
2.4. Đánh giá phương pháp phân tích
25
2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................25
i


2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu ....................................................................25
2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................26
2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................26
2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi).......................................................... 27
2.5. Phân tích mẫu thực tế
28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 29
3.1. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được

3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký

29
33

3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC .......................... 33
3.2.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn ...............................................37
3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R. officinalis
42
3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ..................................................................42
3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết ....................................................................43
3.4. Đánh giá phương pháp phân tích
46
3.4.1. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký ............................................46
3.4.2. Độ đặc hiệu.............................................................................................. 47
3.4.3. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................48
3.4.4. Độ đúng của phương pháp ......................................................................49
3.5. Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực
51
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
13

1

Tiếng Anh

Diễn giải
Phổ cộng hưởng t hạt nhân carbon
13

C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic
resonance spectroscopy

H-NMR

Proton nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng t hạt nhân proton

ACN

Acetonitrile

Acetonitrile

CDL

Limit of detection of calibration

Giới hạn phát hiện của đường chuẩn

CDQ

Limit of quantitation of
calibration

Giới hạn định lượng của đường
chuẩn

DAD

Diod Array Detector

Detector mảng diod

EtOH

Ethanol

Ethanol

EtOAc

Ethyl acetate

Ethyl acetate

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MeOH

Methanol

Methanol

R2

Correlation coefficient

Hệ số tương quan

RO1

7α-methoxyrosmanol

7α-methoxyrosmanol

RO2

Carnosol

Carnosol

RO3

Demethylsalvicanol

Demethylsalvicanol

RO4

Rosmarinoside A

Rosmarinoside A

RO5

Sageone

Sageone

RO6

20-deoxocarnosol

20-deoxocarnosol

RO7

11,12,20-trihydroxy-abieta8,11,13-triene

11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13triene

RO8

Rosmanol

Rosmanol

RO9

7 -methoxyrosmanol

7 -methoxyrosmanol

RO10

7α-ethoxyrosmanol

7α-ethoxyrosmanol

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SKĐ
v/v

Sắc ký đồ
Volume/volume

Thể tích/thể tích

iii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu .............................................................. 16
Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo..................................... 30
Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R. officinalis ................................................ 31
Bảng 3. 3. Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R. officinalis .............................................. 32
Bảng 3. 4. Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O. ............................................... 35
Bảng 3. 5. Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải..................... 35
Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất ........................ 36
Bảng 3. 7. Hệ gradient chạy HPLC ................................................................................................... 37
Bảng 3. 8. Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................. 38
Bảng 3. 9. Giá trị hệ số b’ .................................................................................................................... 40
Bảng 3. 10. Các đại lượng thống kê................................................................................................... 40
Bảng 3. 11. Phương trình đường chuẩn của các chất ...................................................................... 41
Bảng 3. 12. CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD .......................... 41
Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.............................................................. 46
Bảng 3. 14. Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử ..................................................................... 48
Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1.................................. 49
Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực................................... 49
Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................................... 50
Bảng 3. 18. Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R. officinalis ........ 52

iv


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. 1. Cây Bạc hà (Mentha arvensis) ........................................................................................... 2
Hình 1. 2. Cây Hồng cầm (Scutellaria baicalensis) ........................................................................ 2
Hình 1. 3. Lồi Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .................................................................. 3
Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t lồi R. officinalis............................................. 6
Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis......................................... 8
Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t lồi R. officinalis .......................................... 8
Hình 2. 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R. officinalis................................... 20
Hình 3. 1. Cơng thức cấu tạo chất RO1 ………………………………………….. 29
Hình 3. 2. Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất ......................................................... 33
Hình 3. 3. Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được ....................................................... 37
Hình 3. 4. Đường chuẩn các chất RO1, RO3 ................................................................................... 38
Hình 3. 5. Đường chuẩn các chất RO9, RO10................................................................................. 39
Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và
RO10 ...................................................................................................................................................... 42
Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1,
RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 43
Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1,
RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 44
Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung mơi chiết/khối lượng dược liệu
đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10..................................................................................... 45
Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1,
RO3, RO9, RO10 ................................................................................................................................. 46
Hình 3. 11. SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10....................................................... 47
Hình 3. 12. SKĐ của mẫu thử ............................................................................................................ 48

v


MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn
dược liệu rất phong phú và đa dạng. Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa
bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa
phương. Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ,
nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó
chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các
lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. Trong số đó có cây Hương thảo
(Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa,
kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các
dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần
kinh.... Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tôi lựa chọn
đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây
Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phƣơng pháp HPLC‖.
Mục tiêu nghiên cứu:

- Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối
chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó.
- Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo
bằng phương pháp HPLC.
- Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu
Hương thảo ở các vùng khác nhau.

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae)
Họ Hoa mơi (Lamiaceae) cịn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ
Bạc hà…là một họ thực vật có hoa [32]. Chúng phân bố rộng khắp trên tồn cầu
nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm
gặp hơn là các dạng dây leo. Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập
hay mọc vịng, thân cây thường hình vng, có nhiều lơng tuyến, nơi giải phóng
những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy.
Các lồi thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của
cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm
thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hồng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình
1.3), Xơ thơm, Tía tơ... Bên cạnh những lồi lấy lá để ăn, làm gia vị cịn một số loài
được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số lồi khác được trồng vì mục đích lấy
hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32].
Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 lồi khác nhau. Ở Việt
Nam có trên 40 chi và khoảng 145 lồi. Chi Rosmarinus có khoảng 40 lồi, chi
Thymus có khoảng 350 lồi và hầu hết chúng sống ở Châu Á. Có khoảng 150 lồi
điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có 1520 lồi, Có hơn 100 lồi thuộc chi Phlonis, 40-50 lồi thuộc chi Lamuim,...[30, 31].

Hình 1. 1. Cây Bạc hà

Hình 1. 2. Cây Hồng cầm

(Mentha arvensis)

(Scutellaria baicalensis)

1.2. Chi Rosmarinus
Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa.
Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím.

2


Chi Rosmarinus được tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải, một phần ở phía nam
bờ biển Châu Âu, Bắc Mĩ và phía đơng Ai Cập, cũng như Cilicia. Chúng được biết
đến với mục đích dùng làm thuốc, nấu nướng, mỹ phẩm và trang trí. Chúng được sử
dụng t rất sớm bởi người La Mã, Hy Lạp và Ai Cập. Rosmarinus được xem là một
trong những lồi thực vật có ích nhất vùng Địa Trung Hải.
Có khoảng 40 lồi trong chi Rosmarinus, tuy nhiên chỉ có 6 lồi được chấp
nhận tên: R. officinalis L., R. eriocalyx Jord. & Fourr., R. eriocalyx var. pallescens
(Maire) Upson & Jury, R. x lavandulaceus Noë, R. x mendizaballii Sagredo ex
Rosua, R. tomentosus Hub. -Mor. & Maire. Mỗi lồi có đặc điểm khác nhau nhưng
quan trọng nhất, nhiều lợi ích nhất là R. officinalis L. [16, 31].
1.3. Loài Hƣơng thảo (R. officinalis L.)
1.3.1. Đặc điểm thực vật

a) Cây Hương thảo

b) Lá Hương thảo khô

c) Thân Hương thảo khơ

Hình 1. 3. Lồi Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)
Họ:

Lamiaceae
Chi:

Rosmarinus

Tên khoa học:

Rosmarinus officinalis L.

Tên thƣờng gọi:

Cây Hương thảo, cây Dương chổi

Mô tả về thực vật: Cây nhỏ cao 1- 2 m, phân nhánh và mọc thành bụi. Lá R.
officinalis nhiều, hẹp, hình dải, dai, có mép gập xuống, khơng cuống, màu xanh sẫm
và nhẵn ở trên, phủ lông rải rác màu trắng ở mặt dưới. Hoa xếp 2 - 10 ở các vòng lá,
dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi có màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các
3


thùy. Tồn cây có mùi rất thơm. Mùa nở hoa vào khoảng t tháng 3 đến tháng 5
[10].
1.3.2. Nguồn gốc phân bố
R. officinalis là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam
Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây. Nó mọc hoang dại dọc theo phía bắc và phía nam
bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng Himalaya. Nó được trồng
t những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ, Venezuela .
Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du phía
Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt.
Cây thích hợp với khí hậu khơ ráo, nhiều nắng nhưng khơng q nóng. Đất trồng
phải thốt nước tốt.
1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài R. officinalis chứa
chủ yếu các thành phần là terpene, flavonoid, tinh dầu và các phenolic acid. Ngồi
ra cây cịn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic,...)

Các hợp chất terpene là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được
cấu tạo bởi một hoặc nhiều đơn vị isoprene (C5H8) và có chung 1 gốc sinh tổng
hợp. Có thể chia thành terpenoid mạch vịng và terpenoid mạch th ng. Ngồi ra dựa
vào số đơn vị isoprene, người ta chia thành monoterpene (C10), sesquiterpene
(C15), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40).
Cấu trúc của một số loại terpene như diterpene, triterpene, phenolic
diterpene,… trong loài R. officinalis đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol (1),
betulin (2) [9]; oleanolic acid (3), ursolic acid (4) [27]; carnosic acid (5), carnosol
(6), 12-O-methylcarnosic acid (7) [21]; 12-methoxy-trans-carnosic acid (8), 12methoxy-cis-carnosic acid (9) [45]; seco-hinokiol (10) [17]; 7β-methoxy-abieta8,13-diene-11,12-dione-(20,6β)-olide (11), 7α-methoxyabieta-8,13-diene-11, 12dione-(20,6β)-olide (12), royleanolic acid (13), rosmanol (14), betulinic acid (15),
23-hydroxybetulinic acid (16), rofficerone (17) [39]; epirosmanol (18), methyl
carnosate (19) [59]; rosmariquinone (20) [29]; rosmadial (21) [43]; isorosmanol
(22), 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [42]. Cấu trúc của các chất này xem
trong hình 1.4.

4


5


Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t lồi R. officinalis
Các hợp chất flavonoid
Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phân của các loài thực vật bậc cao,
đặc biệt là hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ thu hút các loại côn trùng giúp
cho sự thụ phấn của cây. Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo
kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối
với nhau qua một mạch 3 carbon, là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược
liệu có nguồn gốc thực vật. Phần lớn chúng có màu vàng, ngồi ra cịn có những
chất màu xanh, tím, đỏ hoặc khơng màu.
Các flavonoid đã được phân lập t

lồi R. officinalis như: genkwanin (24),

isocutellarein 7-O-glucoside (25), 6''-O-(E)-feruloylhomoplantaginin (26), 6''-O(E)-feruloylnepitrin (27), 6''-O-(E)-p-coumaroylnepitrin (28), 6-methoxyluteolin-76


glucopyranoside (29), luteolin 3'-O-β-D-glucuronide (30), luteolin 3'-O-(3''-Oacetyl)-β-D-glucuronide (31), kaempferol (32), luteolin (33), ladanein (34),
hispiduline

(35),

diosmethine

(36),

diosmine

(37),

sinensetine

(38),

homoplantaginin (39), eriocitrin (40), gallocatechin (41), hesperidin (42), acacetin
(43), cirsimaritin (44) [11, 13, 15, 21, 22, 36, 44]. Cấu trúc của các chất này xem
trong hình 1.5.

7

Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis
Các hợp chất phenolic
Bên cạnh các hợp chất terpene và flavonoid đã được phân lập, các phenolic
cũng được tìm thấy trong lồi R. officinalis như: rosmanic acid (45), rosmarinic acid
(46), caffeic acid (47), 1-O-(4-hydroxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (48), 1-Oferuloyl-β-D- glucopyranose (49) [11, 21, 28].

Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis
8


Nhƣ vậy: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu đã cơng bố cho thấy, thành phần
hố học trong lồi R. officinalis rất đa dạng và phong phú, góp phần tạo cơ sở khoa
học lý giải cho việc sử dụng cây này để chữa bệnh trong y học cổ truyền.
1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học lồi R. officinalis
Lồi R. officinalis có vị chát, mùi thơm nồng, tính ấm nóng. Người ta thường
dùng R. officinalis trong các trường hợp như: cơ thể suy nhược, choáng do huyết áp
thấp, người mệt yếu do tuần hồn kém, mau qn, ăn uống khơng tiêu, đau nhức cơ,
thấp khớp, viêm họng, nhức đầu, căng th ng thần kinh, chống rụng tóc, mau mọc
tóc. Được dùng dưới các dạng: ngâm rượu (cồn thuốc), nước hãm hoặc chiết tinh
dầu để xoa bóp ngồi da.
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã cho thấy rằng các hợp chất trong lồi
R. officinalis có nhiều hoạt tính sinh học như:
 Hoạt tính chống oxi hóa
Năm 2013, Xiaoqiang Chen cùng các cộng sự tiến hành thử nghiệm song
song hoạt tính chống oxi hóa của tinh dầu R. officinalis trong dầu hướng dương
được lưu giữ ở 60°C và việc sử dụng chất chống oxi hóa tổng hợp là butylat
hydroxyanisol (BHA), butylat hydroxytoluene (BHT) và tert-butylhroquinon
(TBHQ). Kết quả thu được là tinh dầu R. officinalis có tính oxi hóa rất mạnh, gần
bằng chất chống oxi hóa tổng hợp (BHA và BHT) [18].
Các hợp chất phenolic diterpene như carnosol (6), rosmanol (14), carnosic

acid (5),.....và phenolic acid như rosmarinic (46), caffeic acid (47) được phân lập t
R. officinalis, trong đó carnosic acid (5) và carnosol (6) được cơng nhận là có hoạt
tính chống oxy hóa cao nhất, chống lại các gốc tự do [54, 55].
 Hoạt tính chống viêm
Năm 2013, các nghiên cứu của Salvan da Rosa đã sử dụng các mơ hình thí
nghiệm và các thử nghiệm in vitro trên chuột. Kết quả cho thấy trong thành phần
hóa học phân lập của R. officinalis thì carnosol (6) và axit rosmarinic (46) có hoạt
tính kháng viêm rất mạnh trong mô mỡ do carrageenan gây ra. Bằng cách ức chế
bạch cầu, bạch cầu trung tính và giảm tiết dịch dẫn đến giảm giải phóng nitricoxide
(chất trung gian gây viêm tiền liệt). Hai hợp chất này có khả năng chống viêm bằng
cách ức chế phản ứng miễn dịch bẩm sinh, ngăn ng a các bệnh lý viêm và tự miễn
dịch [20].

9


 Khả năng kháng khuẩn
Pinene, verbenone, bornyl acetate là thành phần tinh dầu trong R. officinalis
cho thấy hoạt động kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus
aureus, S. epidermidis) và Gram (-) (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) [8].
Theo nghiên cứu của S. Tavassoli, trong dịch chiết MeOH t lá R. officinalis
chứa các thành phần chống vi khuẩn. Chống lại các chủng vi khuẩn Leuconostoc
mesenteroides, Lactobacillus delbruekii, Saccharomyces cerevisia và Candida
krusei (Issatchenikia orientalis) [51].
Rosmarinic acid (46) và carnosic acid (5) theo nghiên cứu của Zampini
chống lại 37 chủng vi khuẩn. Carnosic acid (5) ngăn cản Staphylococcus aureus
methicillin-resistant và Enterococcus faecalis gentamicin cũng như các dòng vi
khuẩn Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas
aeruginosa, Morganella morganii and Providencia stuartii [58].
 Khả năng chống ung thư

Năm 2014, Margarita Gonzalez và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính chống
lại ưng thư vú ở người của các hợp chất được phân lập t dịch chiết của R.
officinalis. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng dịch chiết R. officinalis (SFRE), thể
hiện sự chống lại các tế bào ung thư vú t các phân nhóm khối u khác nhau và sự
điều hòa của các thụ thể ER- và HER2. Hơn nữa, SFRE làm tăng đáng kể hiệu quả
của hóa trị liệu ung thư vú (tamoxifen, trastuzumab và aclitaxed) [25].
Chiết xuất t lá R. officinalis đã được chứng minh có tác dụng chống lại các
tế bào ung thư biểu mô, hạn chế sự tăng sinh tế bào ung thư gan ở người. Một số
chất có tác dụng như: carnosol (6), carnosic acid (5) và rosemanic acid (45) đã được
phân lập t lồi R. officinalis [54].
Jóseph Tai nghiên cứu, đánh giá hoạt tính chống sự phân bào của tế bào ung
thư buồng trứng. Kết quả cho thấy carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) có trong
R. officinalis có hoạt tính chống tăng sinh trên 2 dịng tế bào ung thư buồng trứng
người A2780 và ARL80CP70 vớ IC50 ước tính lần lượt là 1/1000 và 1/400 [50].
Ngồi ra carnosic acid (5) cịn có khả năng ức chế 3 dòng tế bào Caco-2,
HT29 và LoVo của ung thư trực tràng với giá trị IC50 nằm trong khoảng t 2496

[12].
 Cải thiện chức năng thận, giải độc gan, hạ đường huyết

10


Theo Zheng Tu và các cộng sự, sự rối loạn chuyển hóa như béo phì và tiểu
đường đang gia tăng. Chiết xuất R. officinalis giúp giảm lượng đường và cholesterol
trong máu bằng cách tăng cường tiêu thụ glucose trong tế bào HepG2 đồng thời
phosphoryl hóa của AMP được hoạt hóa nhờ enzym AMP-activated protein kinase
(AMPK) và chất nền acetyl-coA carboxylase (ACC) làm tăng glycolysis gan và oxy
hóa acid béo [53].
Nghiên cứu cho thấy các hợp chất phenolic trong R. officinalis giúp cải thiện

khả năng phịng, chống oxy hóa ở các mô khác nhau và giảm lượng cholesterol
trong máu [4].
 Ảnh hưởng lên hệ thần kinh trung ương, hệ hô hấp
Theo nghiên cứu của Machado, ursolic acid (4), carnosol (6) và betulinic
acid (15) thơng qua sự kích hoạt các thụ thể dopamin D1 và D2 tương tác với hệ
thống dopaminegic có tác dụng chống trầm cảm [37, 38].
Luteolin (33), carnosic acid (5) và rosmarinic acid (46) phân lập t R.
officinalis có tác dụng giảm đau, điều tiết monoaminergic và cholinergic. Chúng tác
động đến thần kinh và cải thiện cholinergic ở tế bào PC12, các chất dẫn truyền thần
kinh: dopamine, norepinephrine, serotonin và acetylcholine được thử nghiệm ở
chuột [46].
Nhƣ vậy: Với nhiều cơng dụng và hoạt tính sinh học, nhu cầu sử dụng loài
R. officinalis của người tiêu dùng ngày càng lớn và các sản phẩm t R. officinalis
ngày càng xuất hiện nhiều. Nhằm kiểm sốt chất lượng của lồi R. officinalis, các
sản phẩm t loài R. officinalis để đảm bảo sức khỏe, lợi ích cho người tiêu dùng thì
việc kiểm tra chất lượng là vô cùng quan trọng.
1.4. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của lồi R. officinalis
1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu
Dược liệu là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp. Trong dược
liệu có một hỗn hợp các chất có tính chất giống nhau (terpene, flavonoid,
anthraquinon...). Các chất trong cùng một nhóm chất thì giống nhau khung cơ bản,
khác nhau ở một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau khơng
nhiều về tính chất vật lý, tính chất hóa học. Vì vậy, việc sử dụng các phương pháp
quang phổ (UV-VIS, IR, huỳnh quang) để phân tích định lượng các hoạt chất trong
dược liệu sẽ gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện được.

11


Hiện nay, trong phân tích hiện đại thì sắc ký là một trong những phương

pháp xác định hàm lượng các chất thơng dụng nhất. Người ta có thể định lượng một
chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được
điều kiện thích hợp. Các phương pháp sắc ký thường dùng là: sắc ký khí (GC), sắc
ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trong đó HPLC là phương pháp có
nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu
dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích
nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký
khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi). Có thể dùng HPLC để phân tích
các chất t phân cực tới khơng phân cực, t các chất bay hơi tới các chất không bay
hơi, t các chất trung tính tới các chất điện ly,… Với pha tĩnh ngày càng được hoàn
thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, HPLC ngày
nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí
ppt [2]. Với mục tiêu đặt ra là xây dựng một phương pháp phân tích định lượng
nhanh, chính xác các hoạt chất chính trong lồi R. officinalis L. chúng tơi lựa chọn
phương pháp nghiên cứu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong lồi R. officinalis
Trên thế giới đã có các nghiên cứu về phân lập, định lượng các chất trong
loài R. officinalis sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:
1.4.2.1. HPLC-UV
Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật HPLC-UV trong xây
dựng phương pháp định tính, định lượng và đánh giá chất lượng loài R. officinalis.
Năm 2013, Hcini và các cộng sự đã tiến hành định tính và định lượng
rosmarinic acid (46), carnosol (6), carnosic acid (5), là các hoạt chất chính trong R.
officinalis bằng HPLC. Các điều kiện phân tích: sử dụng cột pha đảo ZORBAX SBC18 (4,6 mm 125 mm; 5 μm), pha động được dùng là acetonitril (A) và nước đã
được acid hóa chứa 5% acid formic (B). Hệ gradient là 0 phút: 5%A; 10 phút:
15%A; 30 phút: 25%A; 35 phút: 30%A; 50 phút: 55%A; 55 phút: 90%A; 57 phút:
100%A; tốc độ dịng chảy: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, detector tử ngoại
khả kiến UV-Vis loại DAD, bước sóng được phát hiện tại 280 và 330 nm [28].
Năm 2018, Tawfeeq cùng với các cộng sự đã phân tích định tính và định
lượng rosmarinic acid (46) trong lá R. officinalis bằng HPLC. Với điều kiện: cột pha

đảo ODS-C18 (250 mm 4,6 mm), pha động: 80% methanol và 20% nước (chứa
12


0,1% acid acetic); tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Detector UV, phát hiện bước sóng
tại 320 nm [52].
Năm 2020, Beateix Sik và các cộng sự cũng đã phân tích rosmarinic acid
(46), là một phenolic trong R. officinalis bằng HPLC. Sử dụng cột pha đảo ODSC18 (250 mm 4,6 mm), nhiệt độ cột 25oC, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Pha động là
hộ hợp ACN (A)và nước chứa 2,5% CH3COOH (B) với hệ gradient: 0-10 phút: 1020% A; 10-30 phút: 20-30% A; 30-35 phút: 30-50% A; 35-50 phút: 50-60% A; 5055 phút: 60-90% A; 55-67 phút: 90-100% A; 67-68 phút: 100-10% A. Detector
DAD, phát hiện ở bước sóng 280 nm [47, 48].
1.4.2.2. LC-MS/MS
LC-MS/MS là phương pháp phân tích có độ chính xác cao. Bên cạnh ý nghĩa
trong phân tích định lượng, LC-MS/MS cịn cung cấp các thơng tin về dữ liệu phổ
khối của các tín hiệu chất phân tích, t tín hiệu này có thể đánh giá về độ tinh khiết
pic, có thể dự đốn được cấu trúc hóa học của một tín hiệu chất phân tích. Có nhiều
nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS hoặc LC-MS về phân tích thành phần hóa học đối
với đối tượng loài R. officinalis.
Axit Rosmarinic là hợp chất polyphenolic tự nhiên được tìm thấy chủ yếu
trong các loại thảo mộc thuộc họ Lamiaceae như hương thảo. Nó thể hiện các hoạt
tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, kháng vi-rút, kháng khuẩn và chống
viêm. LC-MS / MS có một vai trị quan trọng trong nghiên cứu xác định và mơ tả
đặc tính của các hợp chất tự nhiên, chuyển hóa thuốc, phát hiện ra các ứng cử viên
thuốc mới vì tính nhạy cảm và tính đặc hiệu của nó. Baser KHC cùng các cộng sự
đã tiến hành định lượng axit rosmarinic trong chiết xuất methanol của lá
Rosmarinus officinalis thu được t İzmir bằng cách sử dụng phương pháp LCMS/MS. Các phân mảnh 358,9/160,9 và 358,9/197,0 của axit rosmarinic được sử
dụng để định lượng. Kết quả là 0,31g axit rosmarinic đo được trong 100g chiết xuất
methanol của lá Hương thảo[14].
Borrásn Linares và cộng sự đã định tính và định lượng các hoạt chất của 20
mẫu R. officinalis ở các nơi khác nhau bằng electrospray quadrupole-time of flight
mass spectrometry (HPLC–ESI-QTOF-MS). Sử dụng cột Zorbax Eclipse Plus C18

(4.6 mm ×150 mm, 1.8 μm). Tốc độ dòng chảy 0,8 ml/phút, thể tích tiêm 5 μl, nhiệt
độ của buồng lấy mẫu tự động 4oC. Pha động là acetonitrile (B) và nước chứa 0,1%
acid formic (A) với hệ gradient: 0 phút: 5% B; 12 phút: 50% B; 17 phút: 75% B; 22

13


phút: 95% B; 25 phút: 5% B. Hệ thống HPLC được ghép nối với máy quang phổ
khối micro TOF-Q II (Bruker Daltoniks, Bremen, Germany) thông qua ESI (Bruker
Daltoniks, Bremen, Germany) [15].
1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định
lượng đó là phương pháp xử lý mẫu. Thông thường, đối với các mẫu thực vật, sử
dụng dung môi hữu cơ hoặc nước để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật, quá trình
đó gọi là chiết xuất. Sản phẩm thu được của q trình này là một dung dịch các chất
tan hồ tan trong dung mơi, gọi là dịch chiết. Có nhiều cách chiết, phổ biến nhất là
chiết bằng nước đun sôi, tuy nhiên, trong thực vật có rất nhiều chất khơng tan trong
nước, khi đó ta phải dùng thay thế bằng các dung môi hữu cơ như: EtOH, MeOH,
Acetone,dichloromethane… Hiệu quả của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào bản
chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào,…[2].
Có rất nhiều kỹ thuật chiết khác nhau. Trong phịng thí nghiệm, một số các
phương pháp chiết xuất cổ điển thường được sử dụng ở quy mô phân tích như: chiết
soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm,…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa
học cơng nghệ, có nhiều phương pháp chiết khác được sử dụng với mục đích giảm
lượng dung mơi, hố chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi
trường như: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn,… tuy nhiên, các kỹ
thuật này đều tương đối phức tạp và kinh phí tốn kém, vì vậy khó có thể áp dụng
rộng rãi ở mọi đơn vị kiểm nghiệm.
Chiết siêu âm là q trình chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, thường sử
dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích. Khi đó, nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có

chứa nước, sóng siêu âm phát ra t các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và
đi vào hỗn hợp chiết. Ưu điểm của phương pháp là nhanh, đơn giản, dễ sử dụng.
Nhược điểm là trong dịch chiết xuất hiện nhiều tạp.
Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp ngâm chiết truyền thống,
được thực hiện trong một hệ thống ngưng tụ. Ưu điểm của phương pháp là hiệu suất
chiết cao. Nhưng có nhược điểm là phức tạp hơn chiết siêu âm.
Với mục đích chiết tách và phân lập chất, các tác giả [19] đã chiết tách và
tinh chế được 8 hợp chất t R. officinalis. MeOH là dung môi được sử dụng để chiết
các chất này ra khỏi dược liệu, cao MeOH được hòa tan trong nước và chiết lỏng
lỏng với lần lượt các dung môi n-hexane, CHCl3. Phân đoạn CHCl3 được xác định

14


là chứa các hợp chất định tách. Phân đoạn này được tách sơ bộ bằng cột pha thường,
cột RP-18 trước khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng điều chế với cột tách sử dụng
là cột pha đảo. Hệ dung mơi rửa giải là 40-45% MeOH/H2O.
Với mục đích phân tích định lượng [34], Jacotet Navarro và các cộng sự đã
tiến hành so sánh phương pháp chiết xuất siêu âm và chiết bằng lị vi sóng các hợp
chất rosmarinic acid (46), carnosic acid (5) và ursolic acid (4) t lá R. officinalis.
EtOH 90% là dung môi được sử dụng để chiết các chất này ra khỏi dược liệu. Sau
khi khảo sát các ảnh hưởng về thời gian chiết, dung môi chiết và tỷ lệ chiết dung
mơi/dược liệu thì cho thấy chiết siêu âm cho hàm lượng carnosic acid và ursolic
acid nhiều nhất và chiết bằng lị vi sóng cho hàm lượng rosmarinic acid cao nhất.
Hơn nữa, nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất bằng siêu âm và lị vi sóng những
lựa chọn thay thế tốt cho các quy trình thơng thường liên quan đến tiêu thụ năng
lượng và khí thải carbon ở quy mơ phịng thí nghiệm. Điều kiện chiết siêu âm tốt
nhất là tại 40oC, thời gian siêu âm 30 phút và tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu là 20
ml/1 g.
Ngồi ra, có một số cơng trình nghiên cứu khác [6, 40, 41] đã sử dụng EtOH,

EtOH/H2O hoặc MeOH/H2O làm dung mơi chiết trong q trình xử lý mẫu R.
officinalis. Nhận xét thấy, sử dụng EtOH làm dung môi chiết có nhiều ưu điểm hơn
MeOH, đặc biệt EtOH ít gây độc hại và thân thiện với môi trường hơn, vì vậy có thể
áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm, phịng thí nghiệm và trong cơng nghiệp.
Nhƣ vậy: Với mục tiêu góp phần tìm hiểu về lồi R. officinalis trên thị
trường Việt Nam chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân
tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng
phương pháp HPLC‖. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân lập một
số hoạt chất trong loài R. officinalis và xây dựng phương pháp định lượng các hoạt
chất đó bằng phương pháp HPLC.

15


CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu cây Hương thảo (R. officinalis L.) sử dụng trong nghiên cứu được
thu hái t các khu vực khác nhau của Việt Nam bao gồm: Hà Nội, Hưng Yên, Đà
Lạt được trình bày ở bảng 2.1. Sau đó phơi và sấy ở 50 cho đến khô. Mỗi mẫu
được lấy khoảng 150g nghiền thành bột mịn, đủ dùng cho việc nghiên cứu.
Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu

STT

Tên mẫu

Kí
hiệu

Nơi thu hái

mẫu
1

R. officinalis Hà Đông

A

Vạn Phúc - Hà Đông - Hà Nội

2

R. officinalis Thanh Trì

B

Kim Giang - Thanh Trì - Hà Nội

3

R. officinalis Long Biên

C

Cổ Linh - Long Biên - Hà Nội

4

R. officinalis Hưng Yên

D

Văn Giang – Hưng Yên

5

R. officinalis Đà Lạt

E

Đà Lạt

2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Chất chuẩn
2.2.1.1. Chất đối chiếu 7α-Methoxyrosmanol
Chất đối chiếu 7α-Methoxyrosmanol (viết tắt RO1) là sản phẩm phân lập
được t dược liệu R. officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính
theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C21H28O5, KLPT: 360,44 ĐvC
Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO1 (nồng độ 20 mg/ml): cân chính xác
105,26 mg chất đối chiếu RO1, chuyển vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 3 ml
MeOH, siêu âm cho tan hết. Bổ sung đến vạch mức bằng MeOH, lắc đều, thu được
dung dịch RO1 có nồng độ chính xác 20 mg/ml. T dung dịch chuẩn này, tiến hành
pha loãng bằng MeOH theo các tỷ lệ khác nhau để thu được các dung dịch RO1
chuẩn có nồng độ nhỏ hơn dùng cho nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích.

16


2.2.1.2. Chất đối chiếu 7β-methoxyrosmanol
Chất đối chiếu 7β-methoxyrosmanol (viết tắt RO9) là sản phẩm phân lập

được t dược liệu R. officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính
theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C21H28O5, KLPT: 360,44 ĐvC
Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO9: tương tự dung dịch chất đối chiếu
RO1.
2.2.1.3. Chất đối chiếu demethyl salvicanol
Chất đối chiếu Demethyl salvicanol (viết tắt RO3) là sản phẩm phân lập
được t dược liệu R. officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính
theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C20H30O3, KLPT: 318,45 ĐvC
Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO3: tương tự dung dịch chất đối chiếu
RO1.
2.2.1.4. Chất đối chiếu 7α-ethoxyrosmanol
Chất đối chiếu 7α-Ethoxyrosmanol (viết tắt RO10) là sản phẩm phân lập
được t dược liệu R. officinalis độ tinh khiết đạt 95,0% (kiểm tra bằng HPLC, tính
theo phần trăm diện tích pic); CTPT: C22H30O5, KLPT: 374,47 ĐvC
Cách pha dung dịch chất đối chiếu RO10: tương tự dung dịch chất đối chiếu
RO1.
2.2.2. Các hoá chất khác
- Các hố chất sử dụng trong q trình chiết tách và xử lý mẫu như: ethanol
(EtOH 96%), n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), axetone (A), dichloromethane (D),
acid sulfuric…) dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích (P.A), Trung Quốc. Dung
mơi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi
dùng.
- Nước cất hai lần.
- Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
- Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 Pm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
- Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715).
- Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP-18 F254s (Merck).

17