Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciensb

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiêṇ lên men và phương pháp tách chiế t chấ t
kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens
Mã số đề tài: QG.13.12
Chủ nhiệm đề tài: TS. Trịnh Thành Trung

Hà Nội, 2016
Hà Nội, ........…


PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu điề u kiêṇ lên men và phương pháp tách chiế t chấ t kháng sinh diêṭ
nấ m gây bênh
̣ thực vâ ̣t từ vi khuẩ n Bacillus amyloliquefaciens
1.2. Mã số: QG.13.12
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Chức danh, học vị, họ và tên

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Viện Vi sinh vật và

Chủ nhiệm đề tài
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
2 Ths. Trịnh Thị Vân Anh
Thư ký
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
3 KS. Hà Thị Hằng
Thành viên
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
4 CN. Nguyễn Thị Anh Đào
Thành viên
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
5 KS. Nguyễn Mạnh Hùng
Thành viên
Công nghệ Sinh học
1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ Sinh học
1.5. Thời gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng: 24 tháng từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 05 năm 2015
1.5.2. Gia hạn (nếu có): 12 tháng đến tháng 05 năm 2016
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 09 năm 2016
1

TS. Trịnh Thành Trung

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý
kiến của Cơ quan quản lý)

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 160 triệu đồng.
PHẦN II. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên
tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:
1. Đặt vấn đề
Sử dụng phân bón vơ cơ và các loại thuốc hóa học phịng trừ sâu bệnh trong sản xuất nơng nghiệp
đang gây ra những tác động tiêu cực đến độ mầu mỡ của đất, hủy hoại môi trường sống và làm ảnh
hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh và bền
vững là vấn đề tất yếu của mọi quốc gia và phân bón hữu cơ sinh học đang là giải pháp ưu thế được
nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới (Bhardwaj et al.,
2014). Phân bón hữu cơ sinh học khơng chỉ cung cấp các loại chất dinh dưỡng nhằm duy trì và ổn
định độ phì nhiêu cho đất mà cịn cung cấp các loại vi sinh vật có lợi cho sự phát triển của cây
trồng. Các vi sinh vật thường bổ sung vào phân bón hữu cơ sinh học bao gồm Rhizobium (vi khuẩn
cố định nitơ sống cộng sinh), Azospirillum (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), Bacillus (vi khuẩn
phân giải phosphate khó tan và sản sinh các chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas và
Trichoderma (vi khuẩn và nấm sợi sản sinh các chất phòng trừ bệnh cây) (Fravel, 2005).
Chi Bacillus là một nhóm các lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng
rãi trong các hệ sinh thái. Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, một dạng nghỉ của tế bào để giúp vi
khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi trường như khô hạn và thiếu
dinh dưỡng. Theo hệ thống phân loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ
1


dưới lồi (Parte, 2014). Trong số đó, Bacillus velezensis (hay còn gọi là B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum, B. methylotrophicus và B. oryzicola) là một trong tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis (Rooney et al., 2011; Dunlap et al., 2015). Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều
đặc tính q có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây
bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả
năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh
(Chowdhury et al., 2015; Shao et al., 2015; Li et al., 2015). Do sở hữu các đặc tính quý, nhiều

chủng vi khuẩn B. velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đấu
tranh sinh học hoặc bổ sung vào các loại phân bón hữu cơ sinh học. Một số chủng như B. velezensis
FZB42 cũng đã được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng
trừ bệnh cây (Chowdhury et al., 2015). Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B.
velezensis trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do
vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra (Chen et al., 2014; Huang et al., 2014; Wu et al., 2015; Kang
et al., 2015). Sản lượng bông thu hoạch cũng tăng lên 30% khi bổ sung chủng B. velezensis FZB42
vào phân bón (Yao et al., 2006)
Nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm làm
phân hữu cơ sinh học, trong nghiên cứu này, chúng tôi trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho
cây trồng từ các chủng vi khuẩn B. velezensis có trong bộ sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập tại các
vùng Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Cơn Đảo. Ngồi ra, chủng vi khuẩn B. velezensis
SP1901 phân lập được từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng Liên cũng được sử dụng.
Bacillus velezensis là một trong số tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sublilis (Rooney
et al., 2009). Đây là loài vi khuẩn an tồn, sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho cây trồng như khả
năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh
trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây
chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh (Chowdhury et al., 2015; Shao et al.,
2015; Li et al., 2015). Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B. velezensis được nhiều nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên
cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B.
velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để
phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng.
B. velezensis sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi
khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore
và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias et al., 2009; Huang et al., 2014). Lipopeptide cấu tạo từ
chuỗi peptide liên kết với acid béo, được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally
synthesized peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases
(NRPS). Giải mã hệ gene của các chủng B. velezensis cho thấy hơn 9% hệ genome của vi khuẩn
mang các gene tham gia sinh tổng hợp lipopeptide (Chowdhury et al., 2015). Dựa vào cấu trúc phân

tử và đặc tính sinh học, lipopeptide sản sinh từ Bacillus và Paenibacillus được chia thành 3 nhóm
chính là lipopeptide mạch vịng mang điện tích dương, lipopeptide mạch vịng khơng mang điện
tích dương và lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương (Cochrance, Vederas, 2014). Surfactin,
iturin và fengycin là các lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương thường được tìm thấy
trong dịch ni cấy của các loài B. subtilis (Stein, 2005; Ongena, Jacques, 2008). Bên cạnh đó,
nhiều chủng B. velezensis cịn có khả năng sản sinh đồng thời các polyketide là difficidin,
bacillaene và macrolactin (Arguelles-Arias et al., 2009; Yuan et al., 2012).
Trong quá trình tìm kiếm các chủng vi khuẩn có khả năng ứng dụng trong đấu tranh sinh
học để phòng trừ các bệnh hại cây, chúng tôi đã phân lập được chủng B. velezensis CP 1604 trong
đất nông nghiệp gần vườn Quốc gia Cúc Phương có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh
cây là Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum và
vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzae (Trung et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng
2


tôi tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
sinh ra từ chủng CP 1604.
2. Mục tiêu
- Tuyển chọn được một chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sinh chất kháng nấm mạnh
nhất.
- Nghiên cứu điều kiện lên trên qui mô 5 lít.
- Tách chiết và thu hồi chất kháng nấm.
- Tinh sạch và xác định bản chất sinh lý hóa của chất kháng nấm.
- Đánh giá độ an toàn của chất kháng nấm.
3. Phương pháp nghiên cứu
Chủng vi khuẩn nghiên cứu
Từ bộ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử phân lập tại 4 vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch
Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo, chúng tôi tiến hành so sánh tính tương đồng cao nhất của đoạn gen
16S rRNA so với các chủng chuẩn của các loài trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e ( Dựa trên số liệu so sánh, chúng tơi lựa chọn các chủng có trình tự gen 16S rRNA
tương đồng cao nhất với các loài B. velezensis, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, B.

methylotrophicus và B. oryzicola. Từ ống lưu giữ lạnh sâu ở -70oC, các chủng vi khuẩn lựa chọn
được ria hoạt hóa trên mơi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) tại 30oC. Sau
24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ dùng cho các thí nghiệm mơ tả dưới đây.
Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Từ các tế bào đã hoạt hóa, các chủng vi khuẩn được cấy trải đều trên mặt thạch TSBA
(Becton, Dickinson and Company, Pháp) và được ủ ở 30oC.. Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn
được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó, khoanh thạch được đục bằng ống nhựa
vơ trùng (Ø = 6 mm) và được đặt lên môi trường PDA (g/L: khoai tây 200 g, dextrose 20 g và thạch
15 g) đã cấy sẵn các loài nấm kiểm định gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum, Sclerotium
hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici hoặc đặt lên môi trường NA đã cấy vi
khuẩn kiểm định gây bệnh bạc lá lúa là Xanthomonas oryzae. Ngồi ra, phổ hoạt tính kháng nấm
cũng được kiểm tra trên các chủng nấm kiểm định là Aspergillus oryzae, A. niger và
Saccharomyces cerevisiae. Bộ giống các chủng vi sinh vật kiểm định này đang được lưu giữ tại Bảo
tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào
Từ các tế bào đã hoạt hóa, chủng vi khuẩn được cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml
môi trường TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể. Sau 48 giờ nuôi cấy lắc 160 v/p
ở 30oC, dịch nuôi được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn. Khả năng
sinh enzyme ngoại bào được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó, dịch nuôi cấy
vi khuẩn được nhỏ vào các giếng (Ø = 6 mm) đã đục lỗ trong đĩa thạch chứa 0,1% một trong các
loại cơ chất là tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein và tributyrin. Sau 24 giờ ủ đĩa thạch chứa cơ
chất ở 37oC, hoạt tính amylase và CMCase được xác định dựa trên vòng trong phân giải cơ chất
tinh bột tan và CMC xung quanh khoanh thạch khi nhuộm với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase
và chitinase được quan sát khi nhuộm cơ chất xylan và chitin với dung dịch đỏ cơng gơ; hoạt tính
protease và lipase được quan sát trực tiếp trên cơ chất casein và tributyrin.
Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan
Chủng vi khuẩn đã hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch
thể PVK (g/L: glucose 10, Ca3(PO4)2 5, KCl 0,2, (NH4)2SO4 0,5, NaCl 0,2, MgSO4. 7H2O 0,1,
MnSO4. H2O 0,002 và FeSO4. 7H2O 0,002). Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ở 30oC, dịch nuôi vi khuẩn
được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào. Hàm lượng phosphate vô cơ giải phóng từ

3


Ca3(PO4)2 vào môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp xanh molybden dựa trên
đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH2PO4 (Holman et al., 1943).
Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
Chủng vi khuẩn đã hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml mơi trường dịch
thể NA có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) tới nồng độ cuối là 5 mM. Sau 48 giờ nuôi lắc 160
v/p ở 30oC, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ở 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào. Khả năng
sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (IAA) được xác định dựa trên phản ứng tạo
mầu với thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995). Hàm lượng IAA sinh ra được xác
định dựa trên đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức).
Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen
Từ các khuẩn lạc thuần khiết, ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp của Gabor et
al. (2003). Mức độ tinh sạch của ADN được kiểm tra dựa trên chỉ số bước sóng A260/A280 (xấp xỉ
1,8). Sau đó, 50 ng ADN của từng chủng vi khuẩn được đưa vào ống PCR có thể tích phản ứng cuối
cùng là 25 µl chứa sẵn DreamTaqTM PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Mỹ). Phản ứng
PCR được thực hiện với mồi ERIC và GTG5 theo chu trình nhiệt do Freitas et al. (2008) đã mơ tả.
Sản phẩm PCR được điện di trong 2 giờ tại 65 V trên gel agarose 2% có bổ sung chất nhuộm ADN
RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc). Hình ảnh điện di được chụp trên hệ thống soi gel
(BioRad, Mỹ). Mơ hình băng ADN (hay kiểu gen) tạo ra từ mỗi chủng vi khuẩn được phân tích và
được mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0. Tính tương đồng về kiểu gen được tính tốn theo hệ số
Dice. Mối quan hệ về kiểu gen của các chủng được thể hiện theo sơ đồ cây sử dụng thuật toán
UPGMA. Tất cả các bước phân tích tính tương đồng kiểu gen được thực hiện trên phần mềm
NTSYSpc 2.1.
Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA
polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase
(purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và
16S rRNA được thực hiện với các cặp mồi theo mơ tả của Rooney et al. (2009). Trình tự của 6 gen

được gửi lên ngân hàng gen với các số hiệu lần lượt là KU904810, KU904811, KU904812
KU904813, KU904814 và KU904810. Trình tự đa gen của chủng vi khuẩn nghiên cứu có chiều dài
5.547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gyrA, đoạn 964 bp của gen rpoB, đoạn 875
bp của gen purH, đoạn 777 bp của gen polC, đoạn 835 bp của gen groEL và đoạn 1,168 bp của gen
16S rRNA. Trình tự đa gen của các loài quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của Kobo et al. (2011)
được tải về từ ngân hàng gen NCBI ( Cây phát sinh chủng loại được
xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000
lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05.
Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn
Từ dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào, chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tách chiết
bằng 4 phương pháp là (i) sử dụng dung môi hữu cơ, (ii) hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, (iii)
đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết bằng ethanol và (iv) tủa ở pH thấp. Các phương pháp tách
chiết được lặp lại 2 đến 3 lần theo quy trình như sau:
i.

Phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ: dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào được lần lượt
đưa vào các dung mơi có độ phân cực khác nhau là benzen, 1-butanol, chloroform, ethyl
acetate, hexan, 2-pentanol và tuluene theo tỷ lệ 1 : 1. Sau khi đảo trộn mẫu trong 10 phút,
hỗn hợp dung dịch được ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 20 phút nhằm tách rõ 2 lớp
dịch ni cấy và dung mơi. Phần dung mơi phía trên được thu lại và cô quay ở nhiệt độ
60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hồn ngun với nước cất và được thử hoạt tính
kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
4


ii.

Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amberlite-XAD7 được đưa vào dịch
nuôi cấy theo tỷ lệ 1 : 5 (khối lượng/thể tích). Hỗn hợp này được khuấy nhẹ qua đêm trên
máy khuấy từ ở nhiệt độ 4oC. Sau đó, hạt amberlite được thu lại và rửa liên tiếp 3 lần với

nước cất, 1 lần với ethanol 30%. Hạt amberlite được khuấy nhẹ với ethanol 75% trong 4 giờ
(He et al., 2007). Chất kháng sinh thô thôi ra trong ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt
độ 60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hồn ngun với nước cất và được thử hoạt tính
kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iii. Phương pháp đông khô: tiến hành đông khô hồn tồn dịch ni cấy. Sau đó, đưa một lượng
thể tích ethanol 100% tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đơng khơ và lắc ở 160
vịng/phút trong 2 giờ nhằm chiết rút chất kháng sinh thô. Phần ethanol được thu lại và cô
quay ở nhiệt độ 60oC. Sau đó, cặn kháng sinh thơ được hồn ngun với nước cất và được
thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iv.
Phương pháp tủa ở pH thấp: dịch nuôi cấy được chỉnh về pH 3,0 sử dụng HCl 6N và được ủ
qua đêm ở 4oC. Sau đó, dịch ni cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần
cặn tủa được thu lại và hoàn nguyên với nước cất. Hoạt tính kháng sinh thơ trong cặn tủa
được thử với nấm và vi khuẩn kiểm định.
Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
Chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC sử dụng cột
Zorbax Eclipse XDB - C18 (4,6 ì 250 mm, 5 àl, Agilent Technologies, USA). Phương pháp tinh
sạch HPLC được thực hiện theo mơ tả của He et al. 2007. Theo đó, pha động sử dụng methanol và
nước chứa 0,05% trifluoroacetic acid. Sau khi cân bằng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 µl dịch
kháng sinh tách chiết theo 2 bước bằng dung môi 1 - butanol và hạt amberlite-XAD7 được tải lên
cột. Dung mơi hệ động được thay đổi tuyến tính theo nồng độ methanol từ 20% lên 40% trong 10
phút, từ 40% lên 60% trong 5 phút và từ 60% lên 70% trong 10 phút. Tốc độ dòng của cả quá trình
sắc ký là 0,5 ml/phút. Sắc ký đồ được ghi nhận tại bước sóng 220 nm. Sau khi bị thơi ra khỏi cột,
các phân đoạn sắc ký (0,5 ml/phân đoạn) được thu nhận, cô quay loại bỏ dung môi và thử hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn. Sau đó, các phân đoạn có hoạt tính được trộn lại với nhau và được tinh
sạch lại một lần nữa theo chu trình sắc ký mơ tả như trên. Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn được gửi sang Trung tâm các Phương pháp Phổ Ứng dụng - Viện Hóa Học - Viện
Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ để xác định phổ khối.
Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Khả năng bền nhiệt độ, bền pH và bền với các enzyme thủy phân của chất kháng nấm và

chất kháng khuẩn được thử nghiệm như sau:
i.
ii.

iii.

Khả năng bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các nhiệt độ 60oC, 80oC và
100oC. Sau thời gian xử lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút, hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả ở trên.
Khả năng bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các pH từ 3,0 đến 7,0 trong
đệm citrate-phosphate và pH 8,0 đến 9,0 trong đệm Tris-HCl. Sau 24 giờ ủ ở 4oC, hoạt tính
kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tả
ở trên.
Khả năng bền với các enzyme thủy phân: 5 enzyme là trypsin, α-chymotrypsin, amylase,
lipase và proteinase K được pha trong đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối
cùng là 1 mg/ml. Sau đó, dịch tách chiết chất kháng sinh được lần lượt trộn đều với các
dung dịch enzyme theo tỷ lệ 1 : 1 và được ủ ở 37oC. Sau 2 giờ xử lý, hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mơ tả ở trên.

Thử nghiệm tính an tồn của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn sản sinh từ chủng B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum CP 1604 bước đầu được thử nghiệm trên khả năng nảy mầm của hạt thóc, hạt lạc
và hạt ngô; và thử nghiệm khả năng sinh trưởng của các loại cây lúa, cây lạc và cây ngơ. Qua đó,
5


chất kháng nấm tách thơ được pha lỗng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng nước cất và các
loại hạt kể trên được ngâm trong 3 giờ trong dung dịch pha lỗng này. Sau đó, hạt được đưa lên lớp
bông ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ở 25oC. Độ ẩm của bông được kiểm tra hàng ngày
và kích thước (cm) hạt nẩy mầm được đo lại sau 4 đến 6 ngày ủ mầm. Đối chứng là các hạt ngâm

trong nước cất trước khi ủ mầm.
Nhằm đánh giá tính an tồn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn lên sự sinh trưởng của
cây non, mầm hạt cây tại các mẫu đối chứng được trồng ra đất. Sau 5 - 7 ngày khi cây đã phát triển
ổn định, chất kháng nấm tách thơ được pha lỗng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được phun
đều lên bề mặt các lá. Đối chứng là nước cất phun đều lên bề mặt lá. Màu sắc lá được quan sát hàng
ngày. Sau 5 ngày thử nghiệm, kích thước lá 1 và 2 được ghi lại và so sánh.
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu
B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau
Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành
thu thập 79 mẫu đất tại 4 vườn Quốc gia và các vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận là Cúc
Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo. 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử đã
được phân lập bằng phương pháp xử lý nhiệt [45]. Dựa trên các đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích
thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuẩn lạc, 252 (17,5%) chủng đã được giải trình tự gen
16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp). So sánh trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chủng có chỉ số
tương đồng gen 16S rRNA cao nhất với chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 là
99,93%. Gen 16S rRNA của 14 chủng này đều tương đồng nhau và chỉ sai khác 1 nucleotide ở vị trí
583 (G thay bằng A) so với chủng chuẩn FZB42. Khơng có chủng nào có trình tự gen 16S rRNA
tương đồng cao nhất với các loài B. methylotrophicus và B. oryzicola.
Trong số 14 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, 3 chủng phân lập được ở Cúc
Phương, 3 chủng phân lập được ở Bạch Mã, 5 chủng phân lập được ở Chư Yang Sin và 3 chủng
phân lập được ở Côn Đảo. 12 (86%) chủng được phân lập trong đất canh tác nông nghiệp; chỉ có 2
chủng là BM 1912 và CĐH 1701 phân lập trong đất rừng. Ngoài ra, B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng Hoàng Liên cũng được nghiên cứu. Thơng tin chi tiết
về 15 chủng được trình bày trong bảng 1.
Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn
Cùng với chủng SP 1901, 14 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum trong nghiên cứu
này đều sinh chất kháng nấm gây bệnh cây là F. oxysporum, S. hydrophilum, R. solani và P. capsici
với kích thước vịng kháng nấm trung bình đối với từng loại nấm lần lượt là 4,2 mm, 10,6 mm, 7,7
mm và 7,4 mm. Các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum thử nghiệm đều sinh hoạt tính
kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa X. oryzae với kích thước vịng kháng trung bình là 20,8 mm.

Ngồi ra, hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn cũng thể hiện rất rõ ràng khi thử nghiệm với
2 loại nấm sợi và 1 loại nấm men thường gặp là A. oryzae, A. niger và S. cerevisiae (Bảng 2). Điều
đó chứng tỏ ràng các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập trong môi trường tự
nhiên của Việt Nam sinh chất có phổ hoạt tính rộng kháng nấm và kháng khuẩn.
Bảng. Thông tin cơ bản của 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum.
STT

Tên chủng

1
2
3
4
5
6
7

CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM 0621
BM 0824
BM 1912
CYS 0101

Loại
đất
NN
NN
NN

NN
NN
R
NN

Tọa độ
20.39730 N
20.40270 N
20.36010 N
16.09630 N
16.27200 N
15.99740 N
12.65070 N

105.58793 E
105.53779 E
105.67194 E
108.08954 E
108.00317 E
107.99320 E
108.09832 E

Độ tương
đồng (%)
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93

99,93

Số hiệu đoạn 16S
rDNA tham chiếu
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560

6


8
9
10
11
12
13
14
15

CYS 0208
CYS 0816
CYS 0901
CYS 0911
CĐH 0101
CĐH 0102

CĐH 1701
SP 1901

NN
NN
NN
NN
NN
NN
R
R

12.61560 N
12.49300 N
12.52710 N
12.52710 N
8.68555 N
8.68555 N
8.68916 N
22.28469 N

108.12942 E
108.28791 E
108.35777 E
108.35777 E
106.59250 E
106.59250 E
106.58861 E
103.89341 E

99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93

CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560

NN: nơng nghiệp; R: rừng

Phân tích hệ genome của B. amyloliquefaciens subsp. plantarum cho thấy hơn 9% hệ
genome của vi khuẩn chứa các gen mã hóa các chất kháng nấm và kháng khuẩn (Chowdhury et al.,
2015). Đa số các chất này có bản chất là peptide tổng hợp không qua ribosome như bacylicin,
lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và
macrolactin). Giống như các chủng đã công bố, 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum
phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam đều có khả sản sinh chất kháng nấm và vi
khuẩn gây bệnh cây.
Trong số các loài vi khuẩn ứng dụng làm chế phẩm phòng trừ các loại bệnh hại cây trồng,
Bacillus được chú trọng nghiên cứu vì vi khuẩn có khả năng tạo nội bào tử để có thể tồn tại lâu
trong chế phẩm ở điều kiện bảo quản thường. Nhiều chủng B. amyloliquefaciens subsp.

amyloliquefaciens hoặc B. amyloliquefaciens đã được công bố về khả năng đối kháng với các loại
vi sinh vật gây bệnh cây trồng in vitro như chủng L-H15 đối kháng nấm F. oxysporum [22]; chủng
S76-3 đối kháng nấm F. graminearum [20]; chủng GR53 đối kháng nấm R. solani [32]; chủng
CNU114001 đối kháng với 12 loại nấm gây bệnh cây là Alternaria panax, Botrytis cinerea,
Colletotrichum acutatum, C. orbiculare, Corynespora cassicola, F. oxysporum, Penicillium
digitatum, P. capsici, R. solani, Stemphliyum lycopersici, Pyricularia grisea và Sclerotinia
sclerotiorum [30]. Nhiều chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum có khả năng phịng trừ và
giảm thiểu bệnh cho cây trồng khi thử nghiệm trong nhà kính như dịch nuôi cấy và dịch tế bào của
chủng NJZJSB3 đã bảo vệ lá cây cải dầu chống lại hoàn toàn sự xâm nhiễm của nấm Sclerotinia
sclerotiorum [48]; lạc xử lý với chủng BZ6-1 đã giảm được tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do R.
solanacearum từ 84,5% xuống 12,1% [47]. Hơn nữa, khi bổ sung vi khuẩn B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum vào phân hữu cơ làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh của cây trồng như chủng S20
làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum trên cây cà tím từ 56% xuống
cịn 22% [7]; chủng HR62 làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum trên
cây cà chua xuống 65% [27]. Chính vì vậy, nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá khả năng thúc đẩy
sự sinh trưởng, phát triển và tạo năng suất cho cây trồng là việc làm cần thiết nhằm tìm kiếm các
chủng B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens hữu ích sử dụng trong sản xuất chế phẩm
phân bón hữu cơ sinh học phù hợp với các điều kiện đất canh tác nơng tại Việt Nam.
Bảng 2. Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn

S. hydrophilum

R. solani

P. capsici

X. oryzae

A. oryzae

A. niger

S. cerevisiae

CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM 0621

F. oxysporum

Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn (D - d, mm)
Kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh cây
Kháng nấm khác

7
5
3
5

13
11
9
11

12
11
8
10

9
9
8
6

23
20
21
19

7
4
3
5

7
6
5
5

9
2
3
2

7


BM 0824
BM 1912

CYS 0101
CYS 0208
CYS 0816
CYS 0901
CYS 0911
CĐH 0101
CĐH 0102
CĐH 1701
SP 1901

5
5
6
5
2
5
4
2
4
4
2

13
12
12
11
12
10
11
8

8
11
7

9
7
7
5
4
9
10
7
6
6
5

9
11
9
9
6
6
8
6
5
6
5

21
21

18
23
23
22
20
23
18
17
23

4
5
6
7
7
3
5
2
2
2
3

6
6
10
6
5
9
6
4

4
4
2

3
4
2
3
5
5
4
7
9
9
2

Enzyme ngoại bào
Thử nghiệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy cả 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum đều sinh các enzyme ngoại bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và
chitinase. Kích thước vịng phân giải trên từng loại cơ chất là tương đương nhau và được thể hiện
chi tiết trong bảng 3.
Bảng 3. Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào
Tên chủng
CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM 0621
BM 0824
BM 1912
CYS 0101

CYS 0208
CYS 0816
CYS 0901
CYS 0911
CĐH 0101
CĐH 0102
CĐH 1701
SP 1901

Lipase
11
11
10
11
9
10
9
9
8
9
10
8
7
7
6

Hoạt tính enzyme ngoại bào (D - d, mm)
Protease
CMCase
Amylase

Chitinase
23
20
17
23
23
20
17
23
23
17
16
24
25
18
16
23
23
19
16
21
23
15
16
23
23
17
17
22
23

19
16
21
23
19
16
21
23
18
16
21
23
20
18
23
23
20
15
22
22
19
15
22
21
20
16
22
19
16
18

22

Xylanase
20
17
17
20
17
20
16
17
20
17
17
20
18
18
19

Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
15 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum đều có khả năng phân giải phosphate khó
tan Ca3(PO4)2. Mức độ giải phóng phosphate vơ cơ vào trong môi trường nuôi cấy giao động từ
19,64 - 74,21 µg/ml. Bên cạnh đó, một số chủng cũng có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng
thực vật IAA khá rõ ràng như chủng CDH 0101 (3,28 µg/ml) và SP 1901 (1,98 µg/ml); một số
chủng sinh hàm lượng IAA rất thấp như CP 1604 và CYS 0101 (Bảng 4).
Bảng 4. Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
Tên chủng
CP 1604
CP 1801
CP 1205

BM 0621
BM 0824
BM 1912

Lượng phosphate hịa tan (µg/ml;
GTTB ± KBT)
49,67 ± 0,61
53,12 ± 1,96
53,25 ± 2,19
54,45 ± 5,13
63,24 ± 0,53
61,21 ± 2,99

Lượng IAA sinh ra
GTTB ± KBT)
0,69 ± 0,09
1,41 ± 0,05
1,40 ± 0,04
1,18 ± 0,07
1,07 ± 0,08
1,44 ± 0,04

(µg/ml;

8


CYS 0101
CYS 0208
CYS 0816

CYS 0901
CYS 0911
CDH 0101
CDH 0102
CDH 1701
SP 1901

19,64 ± 2,43
65,84 ± 1,85
64,79 ± 1,12
63,03 ± 1,34
74,21 ± 0,74
66,82 ± 1,91
61,13 ± 1,37
67,32 ± 0,73
60,85 ± 2,62

0,64 ± 0,12
1,38 ± 0,04
1,30 ± 0,11
1,55 ± 0,08
1,33 ± 0,11
3,28 ± 0,09
0,88 ± 0,06
0,89 ± 0,03
1,98 ± 0,10

Từ kết quả trên cho thấy, bên cạnh khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kháng vi
khuẩn gây bệnh hại cây, các B. amyloliquefaciens subsp. plantarum chủng này đều có khả năng
phân giải phosphate khó tan và một số chủng như CĐH 0101 và SP 10901 có khả năng sinh chất

kích thích sinh trưởng IAA khá rõ ràng trong môi trường nuôi cấy (Bảng 3.4). Các đặc tính có lợi
cho cây trồng như này cũng đã được công bố trên một số chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum [28, 35]. Ngoài ra, tất cả các chủng B. velezensis đều sinh các enzyme thủy phân ngoại
bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase. Đây là những đặc tính quan trọng
nhằm thúc đẩy q trình phân hủy các chất hữu cơ và là cơ sở để lựa chọn các chủng vi khuẩn này
ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ủ phân compost hoặc bổ sung chủng với phân bón hữu cơ nhằm
thúc đẩy sự phát triển của cây trồng.
Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum
Phân tích dấu vân tay rep-PCR

Hình 1. Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử
dụng mồi ERIC của các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh
thái khác nhau của Việt Nam.
Nhằm phân tích tính đa dạng về mặt di truyền của các chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam, kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR
sử dụng 2 loại mồi ERIC và GTG5 đã được thực hiện. Đối với mồi ERIC, phản ứng PCR đã tạo ra
11 loại băng ADN nằm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp. Số lượng băng ADN tạo ra cho
từng chủng giao động từ 6 đến 8. Phương pháp phân tích tính tương đồng đã xác định được 8 loại
kiểu gen với 3 nhóm chủng có cùng mơ hình băng ADN là chủng CP 1604, CP 1801 và SP 1901;
chủng BM 0621 và CYS 0208; và chủng BM 0824, CYS 0101, CDH 0101, CDH 0102 và CDH
9


1701. Năm chủng còn lại gồm CYS 0816, CYS 0901, BM 1912, CYS 0911 và CP1205 sở hữu
riêng một loại kiểu gen khác nhau (Hình 1). Tương tự, đối với mồi GTG5, phản ứng PCR đã tạo ra
15 loại băng ADN nằm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp. Số lượng băng ADN tạo ra cho
từng chủng giao động từ 5 đến 8. Phương pháp phân tích tính tương đồng đã xác định được 13 loại
kiểu gen. Trong đó, chủng CDH 0101 và CDH 0102 được xếp vào cùng 1 nhóm (Hình 2).
Phân tích trình tự đa gen
Để kiểm chứng lại khả năng phân tách của 2 loại mồi ERIC và GTG5 trong kỹ thuật dấu vân tay rep

- PCR, trình tự đa gen của chủng CP 1604 được phân tích và so sánh với chủng SP 1901. Trình tự
ADN 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA của hai chủng này sai
khác nhau 83 nucleotide với số lượng sai khác lần lượt cho từng gen là 25, 8, 20, 17, 12 và 1
nucleotide. Trên cây phát sinh chủng loại, chủng SP 1901 và CP 1604 nằm tách biệt ở 2 nhóm B.
velezensis khác nhau (Hình 3). Điều đó chứng tỏ một phần là kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử
dụng mồi GTG5 cho kết quả phân tách tốt hơn và chính xác hơn so với mồi ERIC khi phân tích đa
dạng di truyền trên lồi B. amyloliquefaciens subsp. plantarum.

Hình 2. Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử
dụng mồi GTG5 của các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh
thái khác nhau của Việt Nam.
B. amyloliquefaciens subsp. plantarum là một trong số 8 lồi vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis [40]. Đây là loài được đề xuất đặt tên đầu tiên vào năm 2005 với tên gọi B. velezensis sau
khi phát hiện về khả năng sinh các chất hoạt động bề mặt và lipopeptide kháng khuẩn [41]. Năm
2010, Madhaiyan và cộng sự đã mơ tả lồi B. methylotrophicus phân lập từ đất vùng rễ lúa ở Hàn
Quốc. Bên cạnh khả năng sử dụng methanol, triethylamine và ethanol như nguồn carbon, loài vi
khuẩn này cịn có khả năng sinh các chất như IAA và ACC deaminase kích thích cây trồng phát
triển [35]. Năm 2011, Boriss và cộng sự đã phát hiện ra một nhóm chủng vi khuẩn gần gũi với
chủng B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng sinh trong rễ Arabidopsis trong khi
đó nhóm chủng vi khuẩn gần gũi với chủng B. amyloliquefaciens DSM 7 khơng có khả năng này.
Dựa trên kết quả lai DNA, B. amyloliquefaciens được tách ra thành 2 loài phụ là B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum và B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens [4]. Gần đây,
Chung và cộng sự đã mô tả một loài B. oryzicola sống nội cộng sinh trong rễ lúa có khả năng kích
thích thực vật phát triển, sinh chất kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh cây và có khả năng tăng cường
hệ miễn dịch của thực vật [10]. Do sở hữu nhiều đặc tính có lợi quan trọng cho cây trồng, các loài
10


vi khuẩn kể trên đã nhận được nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu; hơn 30 chủng phân lập từ
các vùng sinh thái khác nhau đã được giải trình tự tồn bộ genome để tìm hiểu về mối tương tác

giữa vi khuẩn và vật chủ sống nội cộng sinh [13]. Song song với đó, hệ thống phân loại của các loài
vi khuẩn kể trên cũng được kiểm chứng lại. So sánh in silico toàn bộ hệ genome cho thấy cả bốn
lồi vi khuẩn kể trên đều có hệ số tương đồng ADN - ADN lớn hơn 84% (khác với chỉ số lai ADN ADN thực nghiệm trước đây). Chính vì vậy, B. methylotrophicus, B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens và B. oryzicola được chỉ định lại về tên loài được đặt ban đầu là B. velezensis
[13].
100 Bacillus velezensis NRRL B-23189
Bacillus velezensis NRRL B-23190

0.02

Bacillus velezensis NRRL BD-621
83

Bacillus velezensis FZB42
Bacillus velezensis Mito-5-13

100
99

Bacillus velezensis Mito-7-4
Bacillus velezensis Tikusei-14-1
SP 1901

100 78
100

Bacillus velezensis Hitachioomiya-8-2
Bacillus velezensis NRRL BD-557
CP 1604
Bacillus velezensis NRRL BD-545

100

93100 Bacillus velezensis NRRL B-41580
Bacillus velezensis NRRL B-4257
100 Bacillus velezensis NRRL BD-569
100 Bacillus velezensis NRRL BD-568

100

Bacillus amyloliquefaciens NRRL BD-601
100
100

Bacillus amyloliquefaciens DSM 7
Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14393
Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213

100

Bacillus mojavensis NRRL B-14698

100

Bacillus vallismortis NRRL B-14890

93

Bacillus subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744

100
94

Bacillus tequilensis NRRL B-41771
Bacillus subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052

100

Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049
Bacillus licheniformis DSM 13

100

Bacillus sonorensis NRRL B-23154
Bacillus pumilus NRRL NRS-272
Bacillus cereus ATCC 14579

Hình 3. Mối quan hệ giữa chủng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng loại và các lồi vi
khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis xây dựng dựa trên đoạn ADN 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA,
rpoB, purH, polC, groEL và 16S rRNA.
11


Tổ hợp kết quả của kỹ thuật rep - PCR sử dụng 2 loại mồi ERIC và GTG5 cho thấy có 14
loại kiểu gen trong số 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum nghiên cứu. Chỉ có duy nhất
2 chủng CĐH 0101 và CĐH 0102 phân lập từ 1 mẫu đất có kiểu gen tương đồng nhau. Kết quả rep
- PCR được kiểm chuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự đa gen khi 2 chủng SP 1901 và CĐH 1604 phân
tách rõ ràng trên cây phát sinh chủng loại. Điều đó chứng tỏ có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền
của các chủng B. velezensis phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.
Tối ưu điều kiện lên men

Với 6 môi trường nhân giống đuợc sử dụng trong nghiên cứu (TSB, 1/5 TSB, NA, 1/5 NA,
LB, 1/5 LB), chủng CP1604 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường TSB với giá trị OD600nm sau 24
giờ nuôi lắc đạt 2,2; đồng thời đây cũng là môi trường cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt
nhất (D-d lần lượt là 30 mm và 9 mm), trong khi đó với môi trường 1/5 TSB chủng vi khuẩn này
sinh trưởng kém hơn rõ rệt (OD600nm = 1,4; hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm D-d tương ứng là
20 mm và 5 mm). Tương tự, trên môi trường LB và NA, chủng vi khuẩn sinh trưởng và sinh chất
kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn đáng kể so với môi trường tương ứng 1/5 LB và 1/5 NA; tuy
nhiên tất cả các chỉ số trên đều nhỏ hơn trên môi trường TSB. Do vậy chúng tôi chọn môi trường
TSB cho những nghiên cứu về sau.
Nhiệt độ được xem là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng cũng như
khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học của vi sinh vật. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa
chọn dải nhiệt độ từ 20ºC đến 40ºC để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng và
hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chủng CP1604. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 35ºC
thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng CP1604 với giá trị OD 600nm=2.5; tuy nhiên hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm lại thể hiện tốt nhất ở nhiệt độ 30ºC, giá trị D-d tương ứng là 29 mm và
9 mm. Với mục đích tối ưu điều kiện lên men thu chất kháng khuẩn và kháng nấm, nhiệt độ 30ºC
được lựa chọn để cho nghiên cứu tiếp theo.
Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng nhất định đến sinh trưởng cũng như hoạt tính
sinh học của chủng vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, chủng CP1604 sinh trưởng tốt nhất
(OD600nm=2,8) khi được ni khuấy ở tốc độ 150 vịng/phút, đây cũng là điều kiện thích hợp cho
khả năng sinh chất kháng khuẩn và kháng nấm (D-d tương ứng 34 mm và 12 mm).
Tốc độ thơng khí là một yếu tố ảnh hưởng then chốt đến sinh trưởng của vi sinh vật hiếu khí
nói chung và nhóm vi khuẩn Bacillus nói riêng. Với bốn tỉ lệ thơng khí 50, 75, 100 và 125% được
nghiên cứu, kết quả thí nghiệm cho thấy chủng CP1604 sinh trưởng tốt nhất ở tỉ lệ thông khí 75%
(OD600nm=3.0), tỉ lệ thơng khí này cũng thích hợp nhất với khả năng sinh chất có hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm của chủng vi khuẩn nghiên cứu (D-d tương ứng là 37 mm và 15 mm).
Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và khả năng sinh chất kháng
khuẩn và kháng nấm, tại thời điểm sau 48 giờ lên men, chủng vi khuẩn nghiên cứu đạt giá trị
OD600nm cực đại (2.9); tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn lại cao nhất sau 36 giờ ni (D-d=34 mm),
hoạt tính kháng nấm cao nhất ở cả giờ nuôi 36 và 48 (D-d=14 mm).

Như vậy, trong nghiên cứu này, điều kiện lên men thích hợp cho chủng CP1604 là môi trường TSB,
nhiệt độ 30ºC, tốc độ khuấy 150 vịng/phút, tốc độ thơng khí là 75%, thời gian lên men 36 giờ.

12


(a)

(b)

(c)

(d)

(e)
Hình 4. Ảnh hưởng của mơi trường (a), nhiệt độ (b), tốc độ khuấy (c), tốc độ thơng khí (d) và thời
gian nuôi cấy (e) đến sinh khối và khả năng sinh chất kháng nấm của chủng vi kha\uẩn CP1604
Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604
So sánh hiệu quả tách chiết chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Trong số các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn
chủng CP 1604 cho các nghiên cứu tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh. Nhằm tìm hiểu điều
kiện ni cấy phù hợp cho chủng CP 1604 sinh chất kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm
các môi trường nuôi cấy TSB, 1/5 TSB, NB, 1/5 NB, LB, 1/5 LB ở các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau
13


và thời gian nuôi cấy khác nhau. Kết quả là, chủng CP 1604 sinh chất kháng nấm và kháng khuẩn
mạnh nhất khi nuôi cấy trên môi trường TSB ở nhiệt độ 30oC sau thời gian 36 giờ.
Từ dịch nuôi cấy chủng CP 1601, chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được tách

chiết bằng 4 phương pháp khác nhau. Đối với phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ, chất
có hoạt tính được chiết rút mạnh nhất trong dung môi 1 - butanol và 2 - pentanol. Hoạt tính kháng
nấm khơng xuất hiện khi dịch ni cấy được tách chiết bằng chloroform và hexan nhưng hoạt tính
kháng khuẩn vẫn duy trì khá cao khi tách chiết bằng chloroform. Điều đó chứng tỏ có sự khác nhau
về tính tan trong các dung môi khác nhau nên dịch nuôi cấy chủng CP 1604 có thể chứa 2 chất
kháng nấm và kháng khuẩn riêng biệt nhau.
Hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn thu được khá cao khi tách chiết bằng phương pháp
hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 và tách chiết với ethanol từ cặn đông khô. Cặn tủa trong pH thấp
của dịch ni cấy cũng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn nhưng hoạt tính kháng thấp hơn so
với các phương pháp còn lại (Bảng 5).
Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
Từ kết quả thu được ở trên, chất kháng sinh thô chuẩn bị cho tinh sạch được tách chiết liên
tiếp bằng 2 phương pháp nhằm loại bỏ các tạp chất không mong muốn. Đầu tiên, dịch nuôi cấy
chủng CP 1604 được tách chiết với dung môi hữu cơ 1 - butanol. Sau đó, dịch kháng sinh được tiếp
tục tách chiết bằng phương pháp hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 và được thôi ra ở nồng độ
ethanol 75%. Kết quả kiểm tra bằng máy HPLC cho thấy đường sắc ký đồ sau khi tách chiết 2 lần
có nhiều đỉnh rõ ràng hơn so với dịch chiết 1 lần bằng 1 - butanol. Chất kháng sinh thô này sau đó
được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn ở
các phân đoạn thu được cho thấy có 2 chất rõ ràng: chất có hoạt tính kháng nấm được thơi ra ở thời
gian 5,328 phút và chất có hoạt tính kháng khuẩn được thơi ra ở thời gian 15,313 phút (Hình 4).
Điều đó chứng tỏ chủng CP 1604 đã sản sinh ra 2 loại chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn
khác nhau.
Bảng 5. Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của dịch chiết thơ
Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
STT

1

Phương pháp tách chiết

Dung
môi
hữu
cơ

Fusarium
oxysporum

Xanthomonas
oryzae

Benzen

6

22

1 - butanol

9

26

Chloroform

0

26

Ethyl

acetate

4

26

Hexan

0

8

2pentanol

6

34

Tuluene

4

16

2

Amberlite - XAD7

10

32

3

Đông khô

10

30

4

Tủa ở pH thấp

8

24
14


5.382

15.313

DAD1 B, Sig=210,40 Ref=360,100 (TRUNG\TR126.D)
mAU
60
50
40
30

20
10
0
-10
0

5

10

15

min

Hình 4. Sắc ký đồ HPLC của chất kháng nấm (5,328 phút) và chất kháng khuẩn (15,313 phút) tinh
sạch từ dịch nuôi cấy chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604.
Xác định các tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Phổ khối của chất có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn được phân tích (Hình 5). Trên
bản phổ ion dương, khối lượng phân tử của chất kháng nấm được xác định là 1042 Da (M + H+ =
1043). Trên bản phổ ion âm, khối lượng phân tử của chất kháng khuẩn được xác định là 402 Da (M
– H+ = 401).
Khi xử lý ở giải nhiệt độ từ 60oC đến 100oC trong 2 giờ, chất kháng nấm vẫn duy trì hoạt
tính kháng F. oxysporum nhưng hoạt tính kháng vi khuẩn X. oryzae của chất kháng khuẩn giảm rõ
rệt, đặc biệt khi bị xử lý ở 100oC (Bảng 3.6). Cả 2 chất kháng nấm và kháng khuẩn đều giảm hoạt
tính khi ở trong dung dịch đệm có pH axít trong khi đó hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn vẫn duy trì
tốt ở dung dịch đệm có pH bazơ (Bảng 7). Hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn của 2 chất cũng
không bị ảnh hưởng bởi các enzyme thủy phân trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase và
proteinase K (Bảng 8).

A)

B)

Hình 5. Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm (A) và phân đoạn chất có hoạt
tính kháng khuẩn (B).
Bảng 3.6. Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm và kháng khuẩn
Nhiệt độ xử
lý

Thời gian
xử lý
(phút)

Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
Fusarium

Xanthomonas
15


60oC

80oC

100oC

oxysporum

oryzae

30

8

25

60

8

25

90

8

25

120

8

25

30

8

24

60

8

20

90

8

20

120

8

20

30

8

20

60

8

15

90

8

10

120

8

7

8

25

Đối chứng

Bảng 7. Khả năng bền pH của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
Giá trị pH xử lý

Fusarium
oxysporum

Xanthomonas
oryzae

pH 3,0

3

20

pH 4,0

5

24

pH 5,0

6

25

pH 6,0

7

25

pH 7,0

8

25

pH 8,0

8

25

pH 9,0

8

25

Đối chứng

8

25

Bảng 8. Khả năng bền với các enzyme thủy phân
Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
Enzyme

Fusarium
oxysporum

Xanthomonas
oryzae

Amylase

8

25

Chymotrypsin

8

25
16


Lipase

8

25

Protease

8

25

Trypsin

8

25

Đối chứng

8

25

B. amyloliquefaciens subsp. plantarum (hay còn gọi là B. velezensis, B. methylotrophicus
hoặc B. oryzicola) là một loài vi khuẩn sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho cây trồng, đặc biệt là
khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây [13]. Do đó, nhiều chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau đã được ứng dụng
trong đấu tranh sinh học để phịng trừ bệnh cây. Nhiều chất có hoạt tính sinh học từ lồi B.
velezensis đã được nghiên cứu nhằm làm rõ bản chất cấu trúc hóa học cũng như cơ chế tấn công của
chất kháng sinh đến các vị trí đích của vi sinh vật gây bệnh. Từ bộ sưu tầm chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam, chủng
CP 1604 chứng minh có khả năng sinh chất kháng nấm và kháng khuẩn mạnh kháng lại các loại
nấm hại cây là F. oxysporum, S. hydrophilum, R. solani, P. capsici và vi khuẩn gây bệnh bạc lá X.
oryzae. Chất hoạt tính này đều có thể tách chiết với hiệu quả tương đương bằng các phương pháp
hấp phụ trong hạt amberlite-XAD7, chiết trong ethanol từ dịch đông khô, tủa ở pH thấp hoặc chiết
bằng các dung môi hữu cơ là 1 - butanol và 2 - pentanol. Kết quả tinh sạch bằng HPLC cho thấy
chất kháng nấm và chất kháng khuẩn là hai chất khác nhau được thôi ra ở hai thời điểm khác nhau.
Phân tích khối phổ cho thấy, bên cạnh các mảnh phổ khối được quan sát thấy trên bản phổ ion
dương, mảnh có khối lượng phân tử giống iturin A (M + H+ = 1043) được tìm thấy trong phân đoạn
chất có hoạt tính kháng nấm. Tương tự mảnh có khối lượng phân tử giống macrolactin A (M – H+ =
401) được phát hiện thấy trên bản phổ ion âm của phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn. Điều đó
chứng tỏ chủng CP 1604 sản sinh đồng thời 2 chất kháng nấm và kháng khuẩn trong dịch nuôi cấy
và sự hiệp đồng của 2 chất này giúp cho dịch ni cấy của chủng CP 1604 có hoạt tính kháng nấm
và vi khuẩn phổ rộng.
A)

B)

Hình 6. Hoạt tính của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác

nhau. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) khi xử lý ở nhiệt độ 60oC trong 90 phút (1) và 120
phút (2), khi xử lý ở nhiệt độ 80oC trong 90 phút (3) và 120 phút (4), khi xử lý ở nhiệt độ 100oC
trong 90 phút (5) và 120 phút (6). Hoạt tính kháng khuẩn X. oryzae (B) khi xử lý ở nhiệt độ 100oC
trong 30 phút (1), 60 phút (2), 90 phút (3) và 120 phút (4). ĐC là đối chứng.
17


Lipopeptide là các chất kháng sinh chính sản sinh từ vi khuẩn Bacillus và các chi có quan hệ
gần gũi như Paenibacillus và Brevibacillus. Chất kháng sinh này được cấu tạo từ 2 thành phần
chính là chuỗi peptide mạch thẳng hoặc vòng liên kết với phần mạch acid béo tại vị trí đầu N của
peptide. Trong số các lipopeptide đã cơng bố, iturin là được xếp vào nhóm khơng mang điện tích
dương, có 7 amino acid khép vịng bởi một liên kết amide giữa đầu N của phân tử β - amino acid
béo và đầu C của amino acid cuối [11]. Iturin thường được tách chiết từ các loài vi khuẩn thuộc
nhóm B. subtilis, trong đó có B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [37]. Dựa trên sự khác nhau về
thành phần cấu tạo chuỗi amino acid và cấu trúc của phân tử acid béo, lớp iturin được chia ra làm
nhiều loại với các tên gọi khác nhau là iturin, mixirin, subtulene, mycosubtilin, mojavensin và
bacillomycin. Kháng sinh lớp iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh nhưng khơng có hoạt tính kháng
khuẩn. Iturin tấn công vào thành phần sterol trong màng tế bào nấm, làm tăng tính thấm của ion
kali, phá vỡ màng tế bào, làm thoát hoặc bất hoạt các thành phần trong tế bào tế bào nấm, dẫn đến
tiêu diệt tế bào nấm [11, 20]. Theo các công bố trước đây, iturin A có phổ hoạt tính kháng nấm
rộng, kháng lại các loại nấm như Fusarium, Rhizoctonia, Penicillium, Aspergillus và Pyricularia
[19, 42]. Iturin A sản sinh từ chủng CP 1604 cũng có phổ hoạt tính khang nấm mạnh kháng lại F.
oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger và Saccharomyces cerevisiae.
Bên cạnh lipopeptide, polyketide cũng là một trong những chất trao đổi chính thường được
tìm thấy trong dịch ni cấy của vi khuẩn Bacillus. Polyketide thường có hoạt tính kháng khuẩn,
kháng virus và kháng tế bào ung thư [43]. Phân tích ADN của chủng B. amyloliquefaciens subsp.
plantarum FZB42 cho thấy hệ genome có 3 nhóm gene là pks1, pks2 và pks3 quy định tổng hợp các
polyketide lần lượt là bacillaene, macrolactin và difficidin [6, 43]. Macrolactin là một lactone dạng
vòng có 24 phân tử carbon liên kết với 1 hydrocarbon tại vị trí carbon số 7. Đây là chất được phát

hiện lần đầu tiên vào năm 1989 trong dịch nuôi cấy của một loài vi khuẩn biển và đến nay có
khoảng gần 20 loại macrolactin đã được cơng bố [5, 21]. Trong số đó, macrolatin A có hoạt tính
kháng vi khuẩn mạnh nhất, đặc biệt là khả năng đối kháng với một số loại vi khuẩn kháng thuốc
kháng sinh như Staphylococcus aureus kháng methicillin và Enterococcus kháng vancomycin [31,
39]. Macrolactin A đã được phát hiện trong dịch nuôi cấy của một số chủng B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum như chủng GA1 [1] và ESB-2 [24]. Macrolactin A sản sinh từ các chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum như HR62 và NJN-6 đã được chứng minh có hoạt tính kháng
lại các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum [27, 49]. Macrolactin A sản sinh từ
chủng CP 1604 cũng chứng minh có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá X. oryzae. Hơn nữa,
dịch ni cấy của chủng CP 1604 cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc S. aureus và E.
faecalis.
Lipopeptide từ vi khuẩn Bacillus là các chất trao đổi bậc 2 được sản sinh theo con đường
sinh tổng peptide không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhờ sự có mặt của
nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS). Chất kháng sinh này chứa hỗn hợp
các amino acid dạng D và dạng L, giúp cho chất kháng sinh bền với các enzyme thủy phân [11].
Điều đó hồn tồn đúng với chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra từ chủng B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604. Cả hai chất đều bền với một loạt các protease như
trypsin, α-chymotrypsin, và proteinase K. Ngoài ra, hai chất này vẫn duy trì hoạt tính khi xử lý ở
pH bazơ. Iturin A bền nhiệt độ hơn so với macrolactin A.
Thử nghiệm tính an tồn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Bước đầu thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn, chúng tôi tiến
hành đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của các chất này tới sự sinh trưởng và phát triển của một số loại cây
trồng. Qua đó, chất kháng nấm và kháng khuẩn thô được tách chiết bằng 1 - butanol kết hợp với hạt
amberlite - XAD7 từ dịch nuôi cấy của chủng CP 1604 được pha tới nồng độ ức chế tối thiểu nấm
F. oxysporum và được đưa vào thử nghiệm.
18


Thử nghiệm nẩy mầm hạt
Các loại hạt lúa, lạc và ngô sau khi ngâm trong dịch kháng sinh thô trong 3 giờ được ủ trong

trong lớp bông ẩm. Sau 4 ngày và 6 ngày, độ dài của các mầm hạt được đo lại. Kết quả cho thấy, độ
dài trung bình của các mầm hạt khi xử lý dịch kháng sinh thơ vẫn phát triển bình thường như ở mẫu
đối chứng (giá trị P đều > 0,05 ở từng phép so sánh). Sau 4 ngày, độ dài mầm của các hạt lúa, lạc và
ngô khi xử lý lần lượt là 1,4 cm, 3,9 cm và 6,6 cm; sau 6 ngày, kích thước của các hạt đó tăng lên
lần lượt là 2,8 cm, 5,6 cm và 11,9 cm (Bảng 3.9). Điều đó chứng tỏ chất kháng nấm và kháng khuẩn
sản sinh từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604 không ảnh hưởng tới sự nẩy
mầm của hạt.
Bảng 9. Khả năng nẩy mầm của hạt khi xử lý với chất kháng sinh
Tốc độ nảy mầm của hạt (GTTB ± KBT, cm)
Sau 4 ngày

Sau 6 ngày

Đối chứng

Thí nghiệm

Giá trị P

Đối chứng

Thí nghiệm

Hạt thóc

1,5 ± 0,2

1,4 ± 0,3

Hạt lạc

3,7 ± 0.3

Hạt ngô

6,7 ± 0,6

Giá trị P

0,19

2,9 ± 0,4

2,8 ± 0,7

1,00

3,9 ± 0,2

0,09

5,8 ± 0,6

5,6 ± 0,9

0,64

6,6 ± 0,5

0,84

12,1 ± 1,0

11,9 ± 1,3

0,84

GTTB = Giá trị trung bình; KBT = Khoảng biến thiên

Thử nghiệm khả năng sinh trưởng của cây
Hạt nẩy mầm được gieo vào trong đất tới khi cây phát triển ổn định (khoảng 5 - 7 ngày). Sau
đó, dịch kháng sinh thơ được phun trực tiếp lên các vị trí của bề mặt lá. Quan sát hàng ngày cho
thấy mầu sắc và trạng thái lá khơng có hay xuất hiện những thay đổi khác biệt so với cây đối chứng.
Sau 5 ngày, kích thước lá được đo lại và so sánh. Kết qủa cho thấy khơng có sự khác biệt về kích
thước giữa nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm (giá trị P đều > 0,05 ở từng phép so sánh, Bảng
3.10). Điều đó chứng tỏ chất kháng nấm và kháng khuẩn sản sinh từ chủng B. amyloliquefaciens
subsp. plantarum CP 1604 không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của các loại cây thử nghiệm.
Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng của cây non khi xử lý với chất kháng sinh
Tốc độ sinh trưởng của cây non (GTTB ± KBT, cm)
Đối chứng

Thí nghiệm

Giá trị P

Lá 1

Lá 2

Lá 1

Lá 2

Lá 1

Lá 2

Cây lúa

15,1 ± 0,3

9,1 ± 0,3

14,8 ± 0,2

9,0 ± 0,3

0,59

0,80

Cây lạc

19,0 ± 0,3

12,7 ± 0,3

19,8 ± 0,2

13,1 ± 0,1

0,06

0,28

Cây ngô

17,3 ± 0,5

14,7 ± 0,4

17,3 ± 0,3

15,2 ± 0,3

1,00

0,15

GTTB = Giá trị trung bình; KBT = Khoảng biến thiên

Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong phịng trừ sâu bệnh hại cây không những gây ô nhiễm
môi trường mà còn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Do đó, việc tìm kiếm các
chất mới có thời gian bán hủy nhanh, tiêu diệt đặc hiệu vi sinh vật đích và có nguồn gốc từ vi sinh
vật vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm [12]. Vì vậy, nghiên cứu tiếp theo để thử nghiệm tính
an tồn và hiệu quả phịng trừ bệnh hại cây là việc làm cần thiết nhằm tìm kiếm khả năng ứng dụng
19


của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn từ chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604

trong phát triển nông nghiệp xanh và bền vững.
5. Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận
Đề tài đã thu được các kết quả như sau:
- Hoạt hóa và nghiên cứu trên 15 chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập từ
các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam có sự đa dạng cao về mặt di truyền.
- Các chủng này đều có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng nấm và vi khuẩn gây hại cây
trồng. Ngoài ra, các chủng này cịn có khả năng phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích
thích sinh trưởng thực vật IAA và sản sinh hàng loạt các enzyme thủy phân như lipase,
protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase.
- Chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum CP 1604 sản sinh chất kháng nấm và chất
kháng khuẩn. Dựa trên phân tích khối phổ, chất kháng nấm được xác định là iturin A có
trọng lượng phân tử là 1042 Da và chất kháng khuẩn là macrolactin A có trọng lượng phân
tử là 402 Da.
- Chất kháng nấm bền nhiệt nhưng chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính khi bị xử lý ở 100oC.
Cả hai chất này đều giảm hoạt tính ở pH axít nhưng duy trì hoạt tính ở pH bazơ. Hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn khơng thay đổi khi xử lý với các enzyme thủy phân là trypsin,
α-chymotrypsin, amylase, lipase và proteinase K.
- Bước đầu thử nghiệm tính an tồn cho thấy chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sản sinh từ
chủng CP 1604 không ảnh hưởng đến sự nẩy mầm và sinh trưởng của các loại hạt thóc, hạt
lạc và hạt ngơ.
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Tiếng Việt:
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum là một lồi thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis. Do sở
hữu nhiều đặc tính q có lợi cho cây trồng, loài vi khuẩn này đang nhận được nhiều quan tâm
nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây và tăng năng xuất cây trồng. 15 B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum phân lập được ở các vùng Hoàng Liên, Cúc Phương, Bạch Mã,
Chư Yang Sin và Côn Đảo đã được phát hiện có hoạt tính kháng các loại nấm hại cây là Fusarium
oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici và vi khuẩn gây
bệnh bạc lá Xanthomonas oryzae. Hơn nữa, các chủng này cịn có khả năng phân giải phosphate
khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA và sản sinh nhiều enzyme thủy phân như

lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase. Phân tích đa dạng di truyền dựa trên kỹ
thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng 2 mồi ERIC và GTG5 cho thấy mồi GTG5 phân tách tốt hơn
mồi ERIC với số lượng kiểu gen tạo ra tương ứng là 13 và 8. Tổ hợp mơ hình băng ADN của 2 loại
mồi tạo ra 14 loại kiểu gen. Kết quả đa dạng di truyền đó được kiểm chứng bằng kỹ thuật giải trình
tự đa gen của 2 chủng CP 1604 và SP 1901 với sự phân tách rõ ràng trên cây phân loại. Từ dịch
nuôi cấy của chủng CP 1604, chất có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum và kháng khuẩn
Xanthomonas oryzae đều có thể tách chiết được bằng phương pháp hấp phụ trong hạt amberliteXAD7, chiết trong ethanol từ dịch đông khô, tủa ở pH thấp hoặc chiết bằng các dung môi hữu cơ là
1 - butanol và 2 - pentanol. Kết quả tinh sạch bằng HPLC cho thấy chất kháng nấm được thôi ra ở
thời gian 5,328 phút và chất kháng khuẩn được thôi ra ở thời gian 15,313 phút. Bằng phương pháp
phân tích khối phổ, chất kháng nấm được xác định là iturin A có trọng lượng phân tử là 1042 Da và
chất kháng khuẩn là macrolactin A có trọng lượng phân tử là 402 Da. Chất kháng nấm bền nhiệt
nhưng chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính rõ rệt khi bị xử lý ở 100 oC trong thời gian 2 giờ. Cả hai
chất này đều giảm hoạt tính ở pH axít nhưng duy trì hoạt tính ở pH bazơ. Hoạt tính kháng nấm và
kháng khuẩn không thay đổi khi xử lý với các enzyme thủy phân là trypsin, α-chymotrypsin,
amylase, lipase và proteinase K. Với khả năng sinh các loại enzyme thủy phân và sinh các chất có
lợi cho cây trồng, các chủng CP 1604 có tiềm năng ứng dụng để tạo chế phẩm làm phân bón hữu cơ
sinh học.
20


Tiếng Anh:
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum is a species belonging to the bacterial group of B.
subtilis. Due to various beneficial traits to plants, the bacterium has been received considerable
attention for application in disease control and crop productivity. In this study, 15 B.
amyloliquefaciens subsp. plantarum strains isolated from various regions of Hoang Lien, Cuc
Phuong, Bach Ma, Chu Yang Sin and Con Dao were demonstrated antagonistic activity against
phythopathogenic fungi of Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani and
Phytophthora capsici and rice blight bacterium Xanthomonas oryzae. Those strains were capable of
solubilizing Ca3(PO4)2 and producing plant growth hormone of IAA. Moreover, those strains
produced a series of hydrolytic enzymes such as lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase and

chitinase. Analysis of genetic diversity based on rep - PCR fingerprinting technique showed that
primer ERIC had greater discrimination than primer GTG5. Number of DNA banding patterns
generated by primer ERIC and GTG5 were 8 and 13, respectively. Combination of DNA banding
patterns of both primers showed 14 different genotypes in 15 B. velezensis strains. Using multilocus
sequencing technique, genetic diversity was confirmed by a clear discrimination of strain CP 1604
and SP 1901 in two different clusters on phylogenetic tree. From liquid culture of CP 1604,
substances with activity against Fusarium oxysporum and Xanthomonas oryzae were extracted by
means of adsorption with amberlite-XAD7, extraction from lyophilized powder using ethanol,
precipitation at low pH and extraction with organic solvents of 1 - butanol and 2 - pentanol. The
substances were subsequently purified by HPLC. Antifungal substance was eluted at 5.328 min
while antibacterial substance was observed at 15.313 min. Mass spectrometry analysis showed that
antifungal substance was iturin A with molecular weight of 1042 Da and antibacterial substance
was macrolactin A with molecular weight of 402 Da. The antifungal substance was stable at high
temperature but antibacterial activity was significantly reduced when treated at 100° C for 2 hours.
Both substances reduced activity at low pH but the activities maintained at high pH. The activities
against fungal and bacterium were not affected when treated with hydrolytic enzymes such as
trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase and proteinase K. Due to the possession of many
beneficial traits to plants and production of hydrolytic enzymes, the CP 1604 strains in this study
have potential application on preparation of bio-fertilizer.
PHẦN III. SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cứu
TT

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm

Đăng ký

Đạt được

1

Chủng B. amyloliquefaciens
sinh chất kháng nấm hại cây

01 chủng

15 chủng

2

Chế phẩm diệt nấm hại cây
trồng

2 lít, MIC = 500

Đạt

3.2. Hình thức, cấp độ công bố kết quả
Ghi địa chỉ
và cảm ơn
sự tài trợ
Sản phẩm
TT
của
ĐHQGHN
đúng quy
định
1 Cơng trình cơng bớ trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus

Tình trạng
(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp
đơn/ đã được chấp nhận đơn
hợp lệ/ đã được cấp giấy xác
nhận SHTT/ xác nhận sử
dụng sản phẩm)

Đánh giá
chung
(Đạt,
không
đạt)

21


1.1
1.2
2
2.1
2.2
3
3.1
3.1
4
4.1
4.2
5

Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

Đăng ký sở hữu trí tuệ
Bài báo quốc tế khơng thuộc hệ thống ISI/Scopus
Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành
quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

Đạt

5.1
5.2
6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng của đơn vị sử dụng
6.1
6.2
7 Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở
ứng dụng KH&CN
7.1
7.2

Ghi chú:
- Cột sản phẩm khoa học công nghệ: Liệt kê các thông tin các sản phẩm KHCN theo thứ tự
công trình, mã cơng trình đăng tạp chí/sách chun khảo (DOI), loại tạp chí ISI/Scopus>
- Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp nhận nếu
có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn tài trợ của ĐHQGHN theo đúng quy định.
- Bản phô tô toàn văn các ấn phẩm này phải đưa vào phụ lục các minh chứng của báo cáo.
Riêng sách chuyên khảo cần có bản phơ tơ bìa, trang đầu và trang cuối có ghi thơng tin mã số xuất
bản.
3.3. Kết quả đào tạo
TT

Họ và tên

Thời gian và kinh phí Cơng trình công bố liên quan
(Sản phẩm KHCN, luận án, luận Đã bảo vệ
tham gia đề tài
(số tháng/số tiền)
văn)

Nghiên cứu sinh
1
Học viên cao học
1 Nguyễn Phương Liên
Luận án thạc sỹ
Đã bảo vệ
Ghi chú:
- Gửi kèm bản photo trang bìa luận án/ luận văn/ khóa luận và bằng hoặc giấy chứng nhận
nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận văn;
- Cột cơng trình cơng bố ghi như mục III.1.
22


PHẦN IV. TỔNG HỢP KẾT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI
TT
Sản phẩm
Số lượng Số lượng đã
đăng ký hồn thành
1 Bài báo cơng bớ trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống
ISI/Scopus
2 Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất
bản
3 Đăng ký sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quốc tế khơng thuộc hệ thống ISI/Scopus
5 Số lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN,
02
02
tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa
học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt
hàng của đơn vị sử dụng
7 Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định
chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN
8 Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS
9 Đào tạo thạc sĩ
01
01

23


PHẦN V. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ
TT
A
1
2
3
4
5
6
7
8
B

1
2

Nội dung chi
Chi phí trực tiếp
Th khốn chun mơn
Ngun, nhiên vật liệu, cây con..
Thiết bị, dụng cụ
Cơng tác phí
Dịch vụ th ngồi
Hội nghị, Hội thảo, kiểm tra tiến độ, nghiệm
thu
In ấn, Văn phòng phẩm
Chi phí khác
Chi phí gián tiếp
Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tổng số

Kinh phí
được duyệt
(triệu đồng)

Kinh phí
thực hiện
(triệu đồng)

75
58

75
58

12

12

4,6
8

4,6
8

2,4

2,4

160

160

Ghi chú

PHẦN V. KIẾN NGHỊ (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài; về quản lý, tổ chức thực
hiện ở các cấp)
- Cần nghiên cứu triển khai ứng dụng các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plantarum trong sản
xuất các loại phân bón hữu cơ sinh học có khả năng phịng chống các bệnh cây.
- Cần đánh giá hiệu quả tiêu diệt bệnh của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn trên cây nhiễm
bệnh.
PHẦN VI. PHỤ LỤC (minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

Hà Nội, ngày 06 tháng 10 năm 2016
Đơn vị chủ trì đề tài
(Thủ trưởng đơn vị ký tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)

24