khảo sát giá trị của xét nghiệm tìm và định danh vi khuẩn ở mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán theo dõi nhiễm khuẩn huyết bằng kỹ thuật realtime pcr đa mồi (multiplex real time pcr mrt pcr)

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM TÌM VÀ
ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở MẪU MÁU CỦA
BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN THEO DÕI
NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR ĐA MỒI
(MULTIPLEX REAL TIME PCR: MRT-PCR)
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. BS Lê Xuân Trường

Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 5/ Năm 2018


BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM TÌM VÀ
ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở MẪU MÁU CỦA
BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN THEO DÕI
NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG KỸ THUẬT

REALTIME PCR ĐA MỒI
(MULTIPLEX REAL TIME PCR: MRT-PCR)
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 5/ Năm 2018


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Họ và tên, học hàm học vị

Chức danh trong
q trình thực

Đơn vị cơng tác

hiện nhiệm vụ
1 PGS. TS. Lê Xuân Trường

Chủ nhiệm đề tài

Đại học Y Dược TP HCM

2 ThS Nguyễn Thị Hằng

Thành viên chính

Bệnh viện Pháp –Việt


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN Y VĂN .................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

1.2.

Tổng quan .................................................................................................. 2

1.2.1. Nhiễm khuẩn huyết ..................................................................................... 2
1.2.2. Tổng quan về PCR ...................................................................................... 7
1.2.3. Các nghiên cứu liên quan .......................................................................... 10
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15
2.1.

Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 15

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 15

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................... 15
2.2.2. Phương pháp chọn mẫu: ............................................................................ 15
2.2.3. Cỡ mẫu nghiên cứu ................................................................................... 15
2.2.4. Cách tiến hành ........................................................................................... 16
2.2.5. Xử lý kết quả ............................................................................................. 21

2.3.

Đạo đức nghiên cứu ................................................................................. 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN .......................................................... 22
3.1.

Kết quả ..................................................................................................... 22

3.1.1. Đặc tính mẫu ............................................................................................. 22
3.1.2. Tác nhân gây NKH .................................................................................... 24
3.1.3. Tỷ lệ dương tính và tương hợp kết quả của cấy máu và MRT-PCR ......... 25
3.2.

Bàn luận ................................................................................................... 27

3.2.1. Đặc tính mẫu .............................................................................................. 27
3.2.2. Tác nhân gây NKH .................................................................................... 27


3.2.3. So sánh kết quả giữa cấy máu và kỹ thuật PCR ........................................ 28
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN và KIẾN NGHỊ ...................................................... 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG – HÌNH

Bảng 1. Đặc tính mẫu theo tần số và tỷ lệ % .................................................. 22
Bảng 2. Tần số và tỉ lệ bệnh nhân phân bố theo bệnh nền (n=91) ................. 23
Bảng 3. Tần số và tỉ lệ các biểu hiện đáp ứng viêm hệ thống của các nhóm cấy

máu ................................................................................................................. 23
Bảng 4. Tần suất và tỷ lệ % các loại vi khuẩn định danh bằng cấy máu và PCR
................................................................................................................. 24
Bảng 5. Kết quả cấy máu và PCR/ống máu ................................................... 25
Bảng 6. Kết quả cấy máu và PCR/chai cấy .................................................... 25
Bảng 7. Thời gian trả kết quả ......................................................................... 26
Bảng 8. So sánh tỷ lệ dương tính của cấy máu và PCR ................................. 26
Bảng 9. So sánh tỉ lệ dương tính của cấy máu và PCR với các nghiên cứu khác
................................................................................................................. 29
Hình 1. Mối liên quan giữa SIRS, NKH và nhiễm khuẩn ................................ 4
Hình 2. Sơ đồ thực hiện PCR.Thực hiện với 2 loại mẫu nghiệm: ................. 19


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1. Thơng tin chung
- Tên đề tài: Khảo sát giá trị của xét nghiệm tìm và định danh vi khuẩn ở

mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán theo dõi nhiễm khuẩn huyết bằng
kỹ thuật Realtime PCR đa mồi (Multiplex Real Time PCR: MRT-PCR.
- Mã số:
- Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. BS Lê Xuân Trường
Điện thoại: 01269872057

Email:

- Đơn vị quản lý về chuyên môn: bộ mơn Hóa Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược
TP.HCM.
- Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2015 đến tháng 01/2018.

2. Mục tiêu
Khảo sát giá trị của xét nghiệm định danh vi khuẩn trong máu bằng kỹ thuật Multiplex
real-time Polymerase chain reaction (MRT-PCR) ở bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn
huyết bằng cách so sánh với kỹ thuật cấy máu.
3. Nội dung chính
Nhiễm khuẩn huyết là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, gây ra do vi khuẩn lưu hành
trong máu gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, có tỷ lệ tử vong cao. Với các triệu
chứng lâm sàng không đặc hiệu của nhiễm khuẩn huyết, và sự cần thiết phải điều trị
nhanh chóng và thích hợp, các xét nghiệm, đặc biệt là xét nghiệm vi sinh là rất quan
trọng. Vai trò quan trọng then chốt trong việc chẩn đoán là xác định được tác nhân gây
bệnh. Cho đến bây giờ, "tiêu chuẩn vàng" của chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết vẫn là cấy
máu. Tuy nhiên, thời gian dài chờ đợi kết quả là một bất lợi của phương pháp này.
Công nghệ PCR có thể giúp chẩn đốn nhiễm khuẩn huyết hiệu quả, chính xác và kịp
thời nhưng chưa được sử dụng rộng rãi. Hiện nay, thế giới đã có nhiều cơng trình
nghiên cứu về vai trò của kỹ thuật xét nghiệm PCR trong chẩn đoán nhiễm khuẩn
huyết. Đa số các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát hiện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR cao


hơn so với cấy máu. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mong muốn đánh giá các
ưu và hạn chế của vấn đề trên, hy vọng có thể ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân
tử trong xét nghiêm định danh vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết để có được tỷ
lệ phát hiện vi khuẩn cao và kết quả sớm hơn.
4. Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...):
- Về đào tạo: 01 Thạc sĩ chuyên ngành Hóa Sinh.
- Cơng bố trên tạp chí trong nước: Tạp chí Y học TP.HCM, xuất bản năm 2017.
5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại
Nghiên cứu cho thấy MRT-PCR là một phương tiện kỹ thuật tốt, giúp phát hiện vi sinh
vật gây nhiễm khuẩn huyết sớm với tỷ lệ phát hiện tương đương cấy máu, có thể giúp
chẩn đoán sớm nhiễm khuẩn huyết, giúp bác sĩ điều trị có thể tiên lượng cũng theo dõi
điều trị cho bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết được tốt hơn, nhằm hạn chế biến chứng và

nguy cơ tử vong cho đối tượng này.


1

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN Y VĂN
1.1.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, gây ra do vi khuẩn lưu
hành trong máu gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, có thể gây suy đa tạng, gây
sốc nhiễm khuẩn với tỉ lệ tử vong rất cao, trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng
của NKH, gây tử vong trên 200.000 người mỗi năm trên thế giới [13]. NKH do vi
khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: da,
mô mềm, cơ, xương khớp, hơ hấp, tiêu hóa, tiết niệu… Khoảng trong một phần ba đến
một nửa số trường hợp không tìm thấy nguồn xâm nhập của tác nhân gây bệnh [29].
Nhiễm khuẩn và NKH là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các đơn vị điều trị tích
cực (Intensive Care Unit – ICU) ngoài tim mạch, chiếm 40% đến 60% nguyên nhân tử
vong [40].
Với các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu của nhiễm khuẩn huyết, và sự cần thiết
phải điều trị nhanh chóng và thích hợp, các xét nghiệm, đặc biệt là xét nghiệm vi sinh là
rất quan trọng. Vai trò quan trọng then chốt trong việc chẩn đoán là xác định được tác
nhân gây bệnh. Cho đến bây giờ, "tiêu chuẩn vàng" của chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết
vẫn là cấy máu. Tuy nhiên, thời gian dài chờ đợi kết quả là một bất lợi của phương
pháp này.
Công nghệ PCR có thể phát hiện deoxyribonucleic acid (DNA) của vi khuẩn trong máu
nhanh chóng [13][14][21][32]. Việc phát hiện các nucleic acid của vi sinh vật giúp cho
chẩn đoán hiệu quả, chính xác và kịp thời NKH. Mặt khác, về mặt lý thuyết, kỹ thuật
PCR cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [23]. Chẩn đoán PCR xác nhận sự vắng mặt hay

sự hiện diện của tác nhân gây bệnh, cùng với việc xác định chính xác tác nhân và cung
cấp thông tin cho các bác sĩ lâm sàng sau vài giờ [14][21][23][32]. Điều này giúp hạn
chế việc sử dụng kháng sinh phổ rộng và sự phát triển của các sinh vật đa kháng thuốc.
Độ nhạy của phương pháp PCR là cao hơn nhiều so với độ nhạy của phương pháp nuôi
cấy, và hơn nữa, việc dùng trước kháng sinh không ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm
[20]. Hiện nay, thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về vai trò của kỹ thuật xét


2
nghiệm PCR trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Đa số các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ
phát hiện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR cao hơn [17][26][27][42]. Chúng tôi thực hiện
nghiên cứu này với mong muốn đánh giá các ưu và hạn chế của vấn đề trên, hy vọng có
thể ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiêm định danh vi khuẩn ở
bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết để có được tỷ lệ phát hiện vi khuẩn cao và kết quả sớm
hơn.
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát giá trị của xét nghiệm định danh vi khuẩn trong máu bằng kỹ thuật Multiplex
real-time polymerase chain reaction (MRT-PCR) ở bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn
huyết bằng cách so sánh với kỹ thuật cấy máu.

1.2.

TỔNG QUAN

1.2.1. Nhiễm khuẩn huyết
NKH là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các đơn vị hồi sức cấp cứu không phải tim
mạch. NKH được chẩn đoán từ 11% đến 25% tất cả bệnh nhân điều trị tại Khoa Hồi sức
tích cực. Mức độ nghiêm trọng của bệnh thể hiện ở nguy cơ tử vong cao: tử vong do
NKH là 30%, do NKH nặng là 50%, và NKH có sốc nhiễm khuẩn tới 80% [19]. Tổng số
các trường hợp NKH trên tồn thế giới khơng rõ vì có ít số liệu từ các nước đang phát

triển [19]. Tại Hoa Kỳ, 2% bệnh nhân nhập viện có nhiễm khuẩn huyết nặng, và 10%
bệnh nhân nhập viện vào ICU là bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết nặng. Có hơn 750.000
trường hợp được báo cáo tại Hoa Kỳ mỗi năm [10]. Nhiễm khuẩn huyết nặng xảy ra như
là kết quả của cả nhiễm khuẩn ở cộng đồng và nhiễm khuẩn bệnh viện. Viêm phổi, nhiễm
khuẩn từ ổ bụng, và nhiễm khuẩn đường tiết niệu là nguyên nhân phổ biến nhất của NKH
[25]. Tại Việt Nam, thống kê của Bộ Y Tế năm 1990, cho thấy tần suất mắc NKH là
15/100.000 dân [2].
Các yếu tố nguy cơ bao gồm tuổi già hay trẻ nhỏ, suy giảm miễn dịch hay trên một
cơ địa có bệnh trước như ung thư, đái tháo đường, chấn thương nặng hoặc bị bỏng [35].
1.2.1.1.

Định nghĩa

Năm 1991, một hội nghị đồng thuận giữa Hiệp Hội Lồng ngực Hoa Kỳ - American
College of Chest Physicians (ACCP) và Hội Y học Săn sóc tích cực - Society of Critical


3
Care Medicine (SCCM) được tổ chức tại Mỹ. Dựa trên kết quả của hội nghị này, năm
1992, ACCP và SCCM công bố các định nghĩa về NKH và các hội chứng liên quan [12]
(hình 1). Định nghĩa này được trình bày như sau:

- Nhiễm khuẩn huyết (Sepsis): Là hội chứng đáp ứng viêm toàn thân (SIRS) đối với
một nhiễm khuẩn.

- Nhiễm khuẩn huyết nặng (Severe sepsis): Nhiễm khuẩn huyết nặng được xác định
là NKH với rối loạn chức năng nội tạng hoặc giảm tưới máu mô (biểu hiện như tụt
huyết áp, tăng lactate, hoặc giảm lượng nước tiểu, hoặc biến đổi tình trạng tâm
thần kinh cấp tính).

- Sốc nhiễm khuẩn huyết (Septic shock): NKH nặng có hạ huyết áp khơng đáp ứng
với liệu trình bù dịch thỏa đáng.

- Hội chứng đáp ứng viêm toàn thân (Systemic Inflammatory Response SyndromeSIRS): Là đáp ứng viêm của cơ thể đối với các tác nhân cấp tính khác nhau, đặc
trưng bởi sự hiện diện của hai hay nhiều hơn các triệu chứng lâm sàng sau:
+ Nhiệt độ tăng > 38°C hoặc < 36°C.
+ Tần số tim > 90 lần/phút (> +2SD so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em).
+ Tần số thở > 20 lần/phút (> +2SD so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em)
hoặc PaCO2 < 32 mmHg (tự thở).
+ Bạch cầu máu ngoại biên >12.000/mm3 hoặc <4.000/mm3, hoặc có >10% bạch
cầu non (bạch cầu dạng đũa)


4

Hình 1. Mối liên quan giữa SIRS, NKH và nhiễm khuẩn [18].
1.2.1.2.

Chẩn đốn nhiễm khuẩn huyết

Dựa vào có ít nhất hai tiêu chuẩn hệ thống hội chứng đáp ứng viêm toàn thân (SIRS) do
liên quan tới nhiễm khuẩn.
Cấy máu dương tính là “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đốn NKH. Cấy máu được khuyến cáo
tốt nhất là trước các kháng sinh được bắt đầu. Tuy nhiên, xác nhận vi khuẩn có mặt trong
máu thường ít hơn 30% bằng phương pháp cấy máu [41]. Có thể xác định sớm sự hiện
diện của vi khuẩn trong máu bằng phương pháp PCR [13][14][23] [37].
1.2.1.3.

Triệu chứng

Ngoài các triệu chứng liên quan đến các nguyên nhân gây NKH, NKH thường kết hợp
với sốt hoặc nhiệt độ cơ thể thấp, thở nhanh, nhịp tim tăng, rối loạn tri giác [24]. Sốt là
biểu hiện lâm sàng thường gặp trên bệnh nhân NKH, có thể kèm rét run. Đây là triệu
chứng khá phổ biến và cũng là một trong các triệu chứng quan trọng mà bệnh nhân đi
khám. Sốt khởi phát đột ngột thường do một tình trạng nhiễm khuẩn nặng. Ở trẻ sơ sinh
thường gặp giảm thân nhiệt [33].


5

Nhịp thở: thở nhanh là một biểu hiện sớm của NKH, có thể có trước khi sốt và rét
run. Do tác động của nội độc tố và các hóa chất trung gian lên trung tâm hô hấp ở hành
tủy gây thở nhanh. Nhưng khi suy hô hấp nặng, nồng độ oxy máu giảm, nồng độ CO2
trong máu tăng quá cao sẽ có tác động ngược gây ức chế trung tâm hơ hấp làm thở chậm
lại, thậm chí có những cơn ngưng thở [39].
Nhịp tim nhanh là biểu hiện thường gặp trong giai đoạn sớm của NKH. Huyết áp
có thể tăng nhẹ. Nhưng khi nhiễm khuẩn tiến triển nặng thì cung lượng tim giảm, mạch
nhẹ có thể chậm lại, huyết áp giảm [36]. Sự sụt giảm huyết áp trong NKH có thể dẫn đến
sốc.
Thay đổi tri giác biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau do tình trạng thiếu oxy, tăng
CO2 cũng như bất thường tưới máu não: li bì, kích thích, ngủ gà, lơ mơ hoặc hơn mê.
Các biểu hiện về da: thời gian phục hồi màu da chậm <3 giây. Da nổi bông là
những dấu hiệu nặng trong NKH. Mặt khác khi NKH có đơng máu nội mạch lan tỏa
(DIC: Disseminated Intravascular Coagulation), có thể gây hoại tử mơ đầu ngón tay,
ngón chân, tai.
Ổ nhiễm khuẩn: ngồi biểu hiện tồn thân, bệnh nhân có thể có dấu hiệu tại các cơ
quan, gợi ý ổ nhiễm khuẩn nguyên phát hay thứ phát. Các tổn thương da có thể gặp dưới
dạng đỏ da lan tỏa, mụn mủ, bóng nước, viêm mơ tế bào. Đó là những dấu hiệu gợi ý
đường vào, tác nhân gây bệnh giúp người thầy thuốc chẩn đoán nguyên nhân.
Nhiễm khuẩn hệ tiết niệu-sinh dục: là ổ nhiễm khuẩn nguyên phát hay gặp của

NKH ở nữ giới. Triệu chứng gồm đau hố chậu hay đau vùng hông, tiểu rát, tiểu buốt, tiểu
khó, tiểu nhiều lần…NKH diễn tiến nhanh, nếu khơng được chẩn đốn và điều trị kịp
thời, bệnh diễn tiến thành NKH nặng, sốc NKH, suy đa cơ quan và tử vong [35]. Các suy
chức năng chức năng cơ quan có thể xảy ra [9]:
-

Phổi: hội chứng suy hơ hấp cấp

-

Não: các triệu chứng bao gồm kích động, lú lẫn, hơn mê. Ngun nhân có thể bao
gồm thiếu máu, xuất huyết, hình thành các cục máu đơng trong mạch máu nhỏ, vi
áp-xe, hoại tử đa ổ chất trắng não.


6

-

Gan: rối loạn chức năng tổng hợp protein biểu hiện sâu sắc như rối loạn đơng máu
do khơng có khả năng tổng hợp các yếu tố đông máu, và rối loạn chuyển hóa
bilirubin, làm nồng độ bilirubin tự do huyết thanh tăng.

-

Thận: lượng nước tiểu giảm hoặc khơng có nước tiểu, bất thường điện giải nước
tiểu.

-

Tim: suy tim tâm thu và tâm trương, có thể do các tín hiệu hóa học làm giảm chức
năng tế bào cơ tim, tổn thương tế bào.

1.2.1.4.

Biểu hiện cận lâm sàng

Công thức máu: số lượng bạch cầu là xét nghiệm liên quan đến tình trạng nhiễm khuẩn
và kết hợp để xác định NKH. Khi bạch cầu >12.000/mm3, hoặc bạch cầu đũa >10% là
dấu hiệu viêm và nhiễm khuẩn. Bệnh nhân sốt có giảm bạch cầu đa nhân trung tính có
nguy cơ NKH, vì vậy khi bạch cầu <4000/mm3, cần đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn.
Tiểu cầu phản ứng trong giai đoạn cấp, có thể tăng hoặc giảm. Tiểu cầu giảm trong NKH
có DIC.
Cấy máu: là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán. Cấy máu cũng cung cấp kháng sinh đồ
cho điều trị. Cấy máu cần được thực hiện trước khi dùng kháng sinh, tốt nhất khi bệnh
nhân đang lạnh run trước khi sốt hay khi đang sốt. Cấy ít nhất 2 lần ở 2 vị trí khác nhau.
Cấy bệnh phẩm khác như mủ da, mủ ổ áp-xe, dịch khớp, dịch màng phổi, dịch màng
bụng, đàm, dịch hút phế quản, nước tiểu, dịch não tủy… khi nghi ngờ nhiễm khuẩn ở
những nơi này. Các xét nghiệm này hỗ trợ cho chẩn đoán đường vào của vi khuẩn và điều
trị.
Xét nghiệm đánh giá chuyển hóa: kali máu tăng có thể là triệu chứng của suy thận
hay ly giải cơ trong NKH [4][43]. Nồng độ bicarbonate tăng hay giảm là biểu hiện rối
loạn chuyển hóa.
Đánh giá chức năng gan, thận:
o

Creatinin trong máu tăng do suy thận, là yếu tố giúp chẩn đốn NKH nặng,
có suy cơ quan và tiên lượng nặng [43].

o

Transaminase, bilibrubin: dùng để đánh giá chức năng gan. Suy chức năng
gan là hậu quả của hủy tế bào gan, có thể gặp trong NKH nặng.


7
Khí máu động mạch: kiềm hơ hấp xảy ra trong giai đoạn sớm và toan chuyển hóa
ở giai đoạn trễ. Khi NKH nặng, tưới máu mơ giảm, sẽ có toan chuyển hóa nặng. Giảm
oxy, tăng CO2 máu là biểu hiện của hội chứng suy hô hấp cấp, gặp trong NKH nặng [43].
Hiện nay có nhiều chất chỉ điểm sinh học trong chẩn đoán nhiễm khuẩn đã được
nghiên cứu và ứng dụng, trong đó các chất chỉ điểm sinh học được quan tâm nhiều như
procalcitonin (PCT), C-reactive protein, cytokine (interleukin: IL-6, IL-8, IL-10, TNF),
nội độc tố [5][30]. Một số cytokine đã được nghiên cứu nhiều và đã có những ứng dụng
bước đầu.
Định lượng C-reactive protein đã được sử dụng nhiều năm qua để chẩn đốn các
bệnh lý viêm nhiễm cấp tính, trong đó có NKH. Khi có viêm, C-reactive protein được
gan tổng hợp do kích thích của các cytokine khi cơ thể bị nhiễm khuẩn [4].
Định lượng PCT: PCT được sản xuất bởi tế bào C của tuyến giáp và là một tiền
chất của calcitonin. Khi cơ thể bị nhiễm khuẩn, PCT có thể được sản xuất ra từ bạch cầu
đơn nhân và gan. Ở những nhiễm khuẩn nặng có hội chứng đáp ứng viêm toàn thân, PCT
tăng cao và sớm hơn so với các xét nghiệm khác [6], [9]. Do đó mức độ tăng của PCT được
sử dụng để phân biệt NKH với các SIRS không do các nguyên nhân không nhiễm khuẩn
[41].
- Sinh học phân tử: phát hiện và định danh vi khuẩn trong máu ở những bệnh nhân
được chẩn đốn NKH. Có thể dùng kỹ thuật Multiplex Real Time PCR hay phương pháp
16S rDNA cho kết quả sớm khoảng sau 6 giờ [16].
1.2.2. TỔNG QUAN VỀ PCR
Kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề suất ra vào năm 1985, đây là phương pháp để nhân bản
nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao, chỉ cần một khối lượng ban đầu rất hạn
chế. Ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào năm 1993 cho thành tựu này. Ý kiến của

Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo
qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. Và nó đã được sử dụng theo
nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với DNA dễ dàng và hiệu
quả hơn. DNA polymerase có trong sinh vật sống, nó thực hiện chức năng nhân đôi DNA
khi tế bào phân chia.


8
Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực
hiện trong ống nghiệm. Sợi DNA đơi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng 96°C. Tuy
nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy, vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi
giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis khơng có hiệu quả
cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý
suốt trong q trình PCR. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng
DNA polymerase lấy từ vi khuẩn sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C.
DNA polymerase từ sinh vật này có thể ổn định ở nhiệt độ cao, và khi dùng trong PCR
nó khơng bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Do đó, khơng cần
phải thêm DNA polymerase vào mỗi chu kỳ. Quá trình sao chép DNA đơn giản và tự
động hơn.
Một trong những DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ vi
khuẩn ưa nhiệt và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực
nghiệm PCR. Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép
DNA, dẫn đến sai trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các
polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai và có thể làm
giảm một cách đáng kể các sai sót xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự
kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của
DNA.- 23 Real Time PCR
Real Time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm, thành
hàng tỉ bản sao, được hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Do đặc
điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để

phát hiện sản phẩm nhân bản (như điện di sản phẩm PCR trên thạch hoặc lai với các đoạn
dò đặc hiệu trên màng, giếng,...).
Real Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’
polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong
phản ứng Real Time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao


9
gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...)
hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...)
Tác nhân liên kết với mạch đơi DNA
Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đơi do q trình nhân
bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green, EvaGreen sẽ liên kết
với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn so với
trạng thái tự do trong dung dịch. Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho
mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp. Độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt
chẽ thơng qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc - phân tích
đường cong nóng chảy.
Các tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, HEX,
TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau:
-

Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dị có vị trí bắt cặp gần nhau trên
mạch khuôn và một hoặc hai mồi. Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong
phản ứng PCR. Mẫu dị phía đầu có mang nhóm huỳnh quang ở đầu 3’, và mẫu dị
phía đi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’. Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một
trình tự DNA, nhóm huỳnh quang “cho” và nhóm “nhận” trên 2 mẫu dò sẽ gây ra
hiệu ứng chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET: Fluorescence
Resonance Energy Transfer) (hình 1.4). Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có
sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành

trong quá trình PCR.

-

Mẫu dị thủy giải (Hydrolysis probe): thơng dụng nhất là TaqMan probe, còn gọi
là kỹ thuật 5’ nuclease. Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh
quang, và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang. Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát
huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dị ở trạng thái ngun vẹn. Trong q
trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời
nhóm “phát” khỏi mẫu dị, khiến nó khơng cịn chịu tác động của nhóm “dập”.
Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi
nhận.


10

-

Mẫu dị dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển hình như “Đèn hiệu phân tử”
“Molecular beacon”: bao gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm
giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược. Các nhóm “phát” và “dập” được gắn vào hai
đầu mút của mẫu dò. Do đó, sự phát huỳnh quang khơng xảy ra khi mẫu dị ở dạng
tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung dịch. Khi mẫu dị bắt cặp với trình tự đích,
nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa. Lúc đó, tín hiệu huỳnh
quang được phát ra và ghi nhận.
Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm

lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín hiệu huỳnh quang phát
ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt Real Time PCR thu nhận và xử lý. Khi cường
độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng

thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá
trị chu kỳ ngưỡng – CT: Cycle Threshold) để so sánh với một đường cong chuẩn đã biết
để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn
được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước
nồng độ.
Multiplex Real Time PCR
Multiplex Real Time - PCR (MRT-PCR) là một cải tiến của kỹ thuật Real Time PCR mà
trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng
nhiều cặp mồi trong một phản ứng. Nhiệt độ gắn của các mồi phải khá tương đồng (khác
biệt dưới 10°C) để đảm bảo được tính cân đối trong q trình khuếch đại các sản phẩm
khác nhau, tránh hiện tượng không thể phát hiện được một sản phẩm khuếch đại nào đó.
Do vậy, thiết kế mồi cho tất cả các cặp mồi được tối ưu hóa để tất cả các cặp mồi có thể
làm việc việc ở cùng một nhiệt độ trong chu kỳ của PCR [15].
MRT-PCR đã giúp phát hiện nhiều tác nhân lây nhiễm khác nhau trong cùng một
giếng phản ứng.
1.2.3. Các nghiên cứu liên quan
Ngoài nước


11
Đã có nhiều báo cáo nghiên cứu về các đánh giá lâm sàng của MRT-PCR trong chẩn
đoán NKH với các quần thể bệnh nhân khác nhau. Các kết quả thực hiện kỹ thuật được
mô tả ban đầu là của Lehmann và cộng sự [22]. Sau đó, các thử nghiệm đã được đánh giá
chủ yếu ở những bệnh nhân ICU người lớn trong các nghiên cứu đa trung tâm [11][42].
Trong những nghiên cứu trên bệnh nhân nghi ngờ NKH, NKH nặng và sốc nhiễm khuẩn,
tỉ lệ dương tính cho MRT-PCR là cao hơn so với cấy máu đáng kể. Tỉ lệ dương tính cho
MRT-PCR dao động từ 25% đến 35%, trong khi đó của cấy máu dao động giữa 13% và
21% [25].
Mancini N và cộng sự [28] nghiên cứu 103 mẫu với MRT-PCR thực hiện với
LightCycler SeptiFast, Roche Molecular Systems và cấy máu bởi máy- 28 - BacT/Alert

(BioMerieux). Có 21 trường hợp (20,4%) cấy máu dương tính và 34 trường hợp (33%)
PCR dương tính. Trong 14 ca khơng tương hợp, cấy máu âm tính và PCR dương tính, có
12 ca kết quả trước đó tương hợp khi mẫu được lấy trước khi dùng kháng sinh, và 2 ca
PCR dương tính với loại mầm bệnh khó mọc khi ni cấy (Aspergillus fumigatus).
Tsalik EL và cộng sự nghiên cứu mẫu máu của 306 bệnh nhân khoa cấp cứu được
chẩn đoán NKH từ tháng 7/2003 đến tháng 2/2009 ở Veterans Affairs Medical Center và
Duke University Medical Center (USA) [38]. Phát hiện và định danh tác nhân NKH bằng
2 phương pháp cấy máu và MRT-PCR. Cấy máu sử dụng hệ thống cấy máu tự động
BacT/Alert (BioMerieux) và BD Bactec (Becton Dickinson). DNA được chiết xuất bằng
cách sử dụng bộ SeptiFast, MRT-PCR sử dụng LightCycler SeptiFast (Roche). Tỉ lệ cấy
máu dương là 66/306 = 21.6%. Tỉ lệ PCR dương là 53/306 = 17.3%. Nghiên cứu kết luận
Real Time PCR có tiềm năng thay thế cho phương pháp cấy máu thông thường.
Schaub N và cộng sự [34] nghiên cứu 110 bệnh nhân người lớn từ 6/2007 đến
01/2009 ở khoa cấp cứu bệnh viện đại học Basel (Switzerland) được chẩn đoán nghi ngờ
NKH. Cấy máu thực hiện với máy BacT/Alert (BioMerieux) và MRT-PCR thực hiện với
LightCycler SeptiFast (Roche Diagnostics). Kết quả có 78 bệnh nhân (71%) âm tính với
cả 2 kỹ thuật PCR và cấy máu (PCR‒/BC‒), 16 bệnh nhân (15%) dương tính với cả 2 kỹ
thuật (PCR+/BC+), bệnh nhân (10%) âm tính với PCR và dương tính với cấy máu
(PCR‒/BC+), 5 bệnh nhân (5%) dương tính với PCR và âm tính với cấy máu


12
(PCR+/BC‒). Cấy máu dương là 24.5% và PCR dương là 19,1%. Các vi khuẩn định danh
được bao gồm: E. coli, Klebsiella pneumoniae/oxytoca, P. aeruginosa, S. aureus, Str.
Pneumoniae, Str. pyogenes. Kết luận: MRT-PCR có giá trị chẩn đốn nhanh NKH và tìm
ra tác nhân gây bệnh có thể so sánh với cấy máu.
Westh H [42] và cộng sự (2009) nghiên cứu 558 cặp mẫu từ 359 bệnh nhân đa
trung tâm. Tỉ lệ dương tính là 17% đối với cấy máu và 26% cho MRT-PCR (SeptiFast).
96 vi sinh vật được phân lập với cấy máu, và 186 vi sinh vật đã được xác định với MRTPCR. Với MRT-PCR, 186 vi sinh vật đã được xác định, 12 trong số đó được xem là
nhiễm. Trong số 174 vi sinh vật có liên quan về mặt lâm sàng xác định với MRT-PCR,

50 (29%) đã được phát hiện bởi cấy máu. Hơn một nửa trong số các vi sinh vật được xác
định với MRT-PCR nhưng khơng được phát hiện bởi cấy máu cũng được tìm thấy trong
các mẫu bệnh phẩm khác lấy từ bệnh nhân. Kết luận: việc sử dụng MRT-PCR có lợi thế
đáng kể trong việc phát hiện tác nhân gây NKH.
Guido M và cộng sự [17] (2012) nghiên cứu 166 mẫu máu từ bệnh nhân bệnh máu
ác tính có sốt giảm bạch cầu, được theo dõi nhiễm khuẩn huyết. 13,9% dương tính với
cấy máu, và 22,9% dương tính với MRT-PCR. Kết luận: MRT-PCR cải thiện phát hiện
nhiễm khuẩn huyết ở bệnh nhân giảm bạch cầu có sốt. Nghiên cứu sâu hơn để đánh giá
những lợi thế và lợi ích lâm sàng của xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán nhiễm
khuẩn huyết.
Bloos F và cộng sự [11] (2012) nghiên cứu từ 50 giường ICU của một bệnh viện
trường đại học. Trong 245 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết, 311 mẫu cấy máu
đồng thời làm MRT-PCR đã thu được kết quả như sau: có 45 (14,5%) cấy máu dương
tính và 94 (30,1%) PCR dương tính. Thời gian trung bình để dương là 24,2 giờ (18,0;
27,5) cho PCR và 68 giờ (52,2; 88,5) cho cấy máu (p<0,01). Các kết quả của nghiên cứu
này ủng hộ giả thuyết rằng PCR cho kết quả nhanh hơn, có tỉ lệ dương tính cao hơn, và
giúp điều chỉnh kháng sinh sớm hơn.
Leonella Pasqualini và cộng sự [31] nghiên cứu 391 bệnh nhân được chẩn đoán
nghi ngờ NKH ở khoa nội của bệnh viện Đại học Perugia, Italy, từ tháng 3/2010 đến


13

tháng 8/2011, với cấy máu và MRT-PCR (SeptiFast) . Tìm thấy tác nhân gây bệnh trong
22% trường hợp. Tỉ lệ dương tính là 15,3% đối với cấy máu và 15,6% cho MRT-PCR.
Lodes U và cộng sự [26] (2012) nghiên cứu 148 mẫu từ 104 bệnh nhân ICU được
chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. 39,9% (n = 59) dương tính với MRT-PCR (Septifast) và
20,3% (n = 30) dương tính với cấy máu. Trong 11,4% MRT-PCR phát hiện nhiều vi sinh
vật. Trong 25 trường hợp (16,9%, n = 148), việc xác định nhanh chóng của các mầm
bệnh liên quan bằng MRT-PCR giúp điều chỉnh kịp thời điều trị. Nghiên cứu kết luận

MRT-PCR cải thiện phát hiện tác nhân gây bệnh ở bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm
khuẩn huyết, và giúp điều trị thành công.
Idelevich E và cộng sự [18] (2013) quan sát thấy rằng thời gian trung bình từ khi
lấy mẫu máu đến khi trả kết quả MRT-PCR (SeptiFast) là 19 h, trong khi thời gian từ khi
lấy mẫu máu đến khi báo kết quả nhuộm của Gram từ cấy máu dương tính là 32 h, và đến
khi có định danh và khánh sinh đồ mất trung bình 58 h.
Tomasz Gosiewski và cộng sự [16] (Poland) công bố tháng 6/2014 rằng: kết quả
nghiên cứu trên 102 mẫu máu từ các bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ NKH,
thì có 18.6% dương tính với cấy máu với máy cấy máu BacT/Alert (BioMerieux), và
69,6% dương tính khi sử dụng kỹ thuật MRT-PCR. Kết quả cho thấy một sự khác biệt có
ý nghĩa.


14

Nghiên cứu trong nước
Chúng tơi chỉ tìm thấy một nghiên cứu trong nước được công bố. Nghiên cứu tại viện Nhi
Trung ương 2012 của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự [6]. Nghiên cứu ở 30 trẻ
em điều trị tại khoa hồi sức cấp cứu, Bệnh viện Nhi trung ương với chẩn đoán NKH, xác
định bằng phương pháp cấy máu và MRT-PCR, trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến
tháng 6 năm 2012. Kết quả: với kỹ thuật MRT-PCR phát hiện dương tính 43,3%, trong
khi đó với phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3%. Trường hợp cấy
máu dương tính thì cũng dương tính bằng kỹ thuật MRT-PCR. Kết luận: áp dụng qui
trình, ứng dụng kỹ thuật Real Time PCR trong chẩn đoán NKH cho thấy độ nhạy và độ
đặc hiệu cao, bên cạnh đó rút ngắn được thời gian chẩn đoán so với phương pháp cấy
máu truyền thống.


15

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tất cả bệnh nhân người lớn từ 18 tuổi trở lên được chẩn đoán NKH và được chỉ định cấy
máu tại khoa cấp cứu và khoa hồi sức tích cực, bệnh viện FV, TP Hồ Chí Minh.
Tiêu chí chọn vào
- Tuổi ≥ 18.
- Bệnh nhân vào khoa cấp cứu, được chẩn đoán NKH, và được chỉ định cấy máu.
- Bệnh nhân nhập viện tại khoa hồi sức tích cực, được chẩn đoán NKH và được chỉ
định cấy máu.
-

Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.

Tiêu chí loại ra
- Có chỉ định cấy máu nhưng chẩn đốn NKH là chẩn đốn gián biệt, khơng phải
chẩn đốn đầu tiên.
- Có chỉ định cấy máu do nghi ngờ NKH nhưng không đủ tiêu chuẩn SIRS.
- Mẫu lấy không đúng qui cách.
- Các mẫu nghi ngờ bị nhiễm hay bị rò rĩ trong quá trình bảo quản và vận chuyển
mẫu.
- Các trường hợp khơng có đủ dữ liệu cần thu thập

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang, mô tả.
2.2.2. Phương pháp chọn mẫu: Chọn toàn bộ. Tất cả bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn chọn
bệnh sẽ được đưa vào nghiên cứu.
2.2.3. Cỡ mẫu nghiên cứu
Theo nghiên cứu Gosiewski T và các cộng sự đã được thực hiện tại Poland [16], với tỉ
lệ dương tính của xét nghiệm định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MRT-PCR là 69,6%, tỉ
lệ cấy máu dương tính là 18,6%. Áp dụng cơng thức để tính cỡ mẫu:

16

N = (Z1-α/2)

2

P1(1-P1) + P2(1-P2)
d2

Trong đó:

α là xác suất sai lầm loại một. α = 10%
d là độ chính xác mong muốn tìm thấy sự khác biệt giữa 2 tỉ lệ.
1- α/2 = 0.950
d = 0,12
P1 = 0,696
Z(1-α/2) = Z(0.950) = 1,645
P2 = 0,186

Tính được cỡ mẫu tối thiểu để khảo sát là n = 69.
2.2.4. Cách tiến hành
Mẫu nghiên cứu được lấy tại khoa cấp cứu và khoa hồi sức tích cực bệnh viện FV thành
phố Hồ Chí Minh, từ 5/2015 đến tháng 3/2016. Cấy máu và định danh vi sinh vật từ mẫu
cấy máu được thực hiện tại khoa xét nghiệm bệnh viện FV. MR-PCR được thực hiện tại
khoa xét nghiệm Công ty Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh.
Cách thu thập số liệu
Một mẫu nghiên cứu được thu thập cùng một thời điểm bao gồm:
-

Mẫu cấy máu 1: theo qui trình cấy máu của bệnh viện FV. Mẫu được lấy vào chai
cấy máu của hãng BD (Becton Dickinson). Bao gồm chai cấy máu hiếu khí và chai
cấy máu kỵ khí. Mỗi chai cấy máu được lấy vào 5-8 ml máu tĩnh mạch.

-

Mẫu 2: 1 ml máu tĩnh mạch vào ống nghiệm vô trùng chống đông bằng EDTA
(Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid) của hãng BD, và mẫu 3 5ml máu tĩnh mạch
được lấy vào chai cấy máu của công ty Nam Khoa. Mẫu bệnh phẩm được thu nhận
tại thời điểm lấy mẫu cấy máu theo chỉ định cấy máu của bác sĩ điều trị.

Mẫu (1) được thực hiện cấy máu và định danh vi sinh vật tại bệnh viện FV.
Mẫu (2) được bảo quản ở -700C.


17

Mẫu (3) sau khi ủ ở tủ ấm 370C/ qua đêm (từ 12 đến 24 giờ), được chiết 1ml vào týp vơ
trùng và bảo quản ở -700C. Sau đó mẫu (2) và (3) được chuyển đến công ty Nam Khoa và
thực hiện MRT-PCR tại đây.
Phương pháp cấy máu
Được thực hiện bởi khoa xét nghiệm bệnh viện FV. Ghi nhận thời điểm nhận mẫu cấy
máu. Mẫu cấy máu được cho ngay vào máy cấy máu. Máy cấy máu được dùng là máy tự
động BACTEC 9050 của BD, với chai môi trường cấy máu chuẩn BACTEC
STANDARD MEDIA bao gồm chai cấy hiếu khí và chai cấy kỵ khí.
Trong mơi trường cấy, khi có sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu, chúng sẽ
thực hiện q trình trao đổi chất, thải khí carbon dioxide (CO2) vào môi trường. Lượng
CO2 này phản ứng với một chất nhuộm được gắn trong bộ phận cảm biến ở mỗi đáy chai.
Phản ứng này điều chỉnh lượng ánh sáng được hấp thu bởi một bộ phát quang trong bộ

phận cảm biến. Phía sau các chai cấy là một hàng ánh sáng phát quang diodes (LEDs) có
chức năng chiếu sáng và hoạt hóa mức phát quang của bộ phận cảm biến trong chai cấy.
Phần cảm nhận ánh sáng đo mức phát quang tương ứng với hàm lượng CO2 vi sinh vật
thải ra mơi trường. Sau đó, hàm lượng CO2 này được máy phiên dịch cho ra kết quả và so
sánh với bảng thơng số mẫu dương tính đã được cài trước.
Cứ 10 phút máy sẽ kiểm tra một lần. Mẫu dương tính được báo hiệu ngay bằng
chng và đèn báo nằm phía trước máy, và vị trí mẫu dương tính được hiển thị trên màn
hình LCD. Mẫu dương tính sẽ được lấy ra khỏi máy, tiến hành cấy chuyển phân lập và
định danh vi sinh vật. Mẫu cấy máu sẽ được kết luận cấy không mọc nếu sau 5 ngày từ
khi đưa chai cấy máu vào máy không cho phát hiện dương tính.
Định danh vi sinh vật từ mẫu cấy máu
Các mẫu dương tính được lấy ra khỏi máy sẽ được định danh theo qui trình như sau:
-

Nhuộm Gram từ chai cấy máu để xác định vi khuẩn hay nấm, Gram dương hay
Gram âm, cầu khuẩn hay trực khuẩn. Ghi nhận thời điểm có kết quả nhuộm Gram
và báo kết quả cho lâm sàng.