xây dựng quy trình phát hiện đột biến cyp2c19 và ứng dụng trên một số mẫu ung thư và viêm dạ dày

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN CYP2C19
VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU UNG THƯ
VÀ VIÊM DẠ DÀY

Mã số: 219/2016/ HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Tuấn Anh

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2018


BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN CYP2C19
VÀ ỨNG DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU UNG THƯ
VÀ VIÊM DẠ DÀY

Mã số: 219/2016/ HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài
(Ký, họ tên)

ThS. Nguyễn Tuấn Anh

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2018


Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp
Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Tuấn Anh(1), PGS TS Vũ Quang Huy.(1,2)
Cs Ngô Anh Duy(3) ,Lê Ngọc Minh Trân(1), Trần Thái(1), Phạm Hồng Thụy, Lâm Quốc
Cường(1), Bùi Quang Sang (1), Lê Hoàng Anh (1), Nguyễn Văn Hoàng Sơn (1), Trần Hà
Tiểu Linh (1).
(1) Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại Học Y Dược TP. HCM
(2) Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng Kỹ thuật Y học- Đại Học Y Dược TP. HCM
(3) Khoa Y Dược – Trường Đại học Trà Vinh

MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 4
1.1. Vài nét về bệnh viêm dạ dày mạn ........................................................ 4
1.2. Đại cương về đột biến gene .................................................................. 7
1.2.1. Khái niệm cơ bản về đột biến gene ................................................ 7
1.2.2. Các loại đột biến ............................................................................. 8
1.2.3. Nguyên nhân đột biến .................................................................. 11
1.3. Phương pháp phát hiện đột biến gene ................................................ 15
1.3.1. Kỹ thuật PCR – RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction
Fragment Length Polymorphisms).................................................................. 15
1.3.2. Kỹ thuật real - time PCR ............................................................. 17
1.3.3. Phương pháp xác định trình tự nucleotide (Sequencing) ............ 19
1.4. Tổng quan về CYP2C19 ..................................................................... 21
1.4.1. Sơ lược hệ CYP450 ...................................................................... 21

1.4.2. Đại cương CYP2C19.................................................................... 25


1.4.3. Một số allen liên quan đến chuyển hóa thuốc của gene CYP2C19
có ý nghĩa lâm sàng ......................................................................................... 26
1.4.4. Các nghiên cứu về gene mã hóa enzyme CYP2C19 trên người
Việt Nam………………………………………………………………….…28
1.4.5. Mối liên quan giữa đa hình CYP2C19 với đáp ứng điều trị của
PPIs ở bệnh nhân viêm dạ dày ......................................................................... 28
1.4.6. Một số kỹ thuật khác giúp xác định đột biến CYP2C19.............. 29
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 30
2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ......................................................... 30
2.2. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 30
2.3. Cỡ mẫu ............................................................................................... 30
2.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 30
2.4.1. Vật liệu sinh học ........................................................................... 30
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................... 31
2.4.3. Hóa chất sử dụng .......................................................................... 31
2.5. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 31
2.6. Kỹ thuật .............................................................................................. 32
2.6.1. Giai đoạn 1: Tối ưu hóa phản ứng real – time PCR .................... 32
2.6.2. Giai đoạn 2: Thử nghiệm trên mẫu lâm sàng .............................. 34
2.7. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................... 36
2.8. Xử lý và phân tích số liệu .................................................................. 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 37
3.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình real - time PCR phát hiện đột biến
CYP2C19*2 .................................................................................................... 37
3.1.1. Kết quả giải trình tự của mẫu chứng ........................................... 37
3.1.2. Khảo sát khả năng nhân bản của hệ mồi và mẫu dò ................... 38
3.1.3. Tối ưu nhiệt độ lai ....................................................................... 40

3.1.4. Tối ưu nồng độ mồi ..................................................................... 42


3.1.5. Tối ưu nồng độ mẫu dò ............................................................... 43
3.1.6. Tối ưu nồng độ Mg...................................................................... 44
3.1.7. Tối ưu nồng độ enzyme ............................................................... 45
3.1.8. Khảo sát nồng độ ADN khuôn .................................................... 47
3.2. Áp dụng quy trình tối ưu real - time PCR để chạy mẫu lâm sàng..... 49
3.2.1. Tỉ lệ đột biến CYP2C19*2 có hoặc khơng nhiễm H. pylori ....... 50
3.2.2. Tỉ lệ đột biến CYP2C19*2 theo tuổi ........................................... 51
3.2.3. Tỉ lệ đột biến CYP2C19*2 theo giới........................................... 53
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 55
4.1.

Về tối ưu hóa quy trình real - time PCR phát hiện đột biến

CYP2C19*2 ................................................................................................. 55
4.2. Về tỉ lệ đột biến CYP2C19*2 ............................................................ 59
KẾT LUẬN .................................................................................................... 63
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... I
PHỤ LỤC..………………………………………………………………….…….VI


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A: Adenine
ADN: Acid Deoxyribonucleic
C: Cytosine
CYP450: Cytochrome P450
FDA: Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm

Hoa Kỳ)
G: Guanine
HIV/AIDS: Human immunodeficiency virus infection / acquired
immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải)
H. pylori: Helicobacter pylori
PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gene)
PCR – RFLP: Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length
Polymorphisms
PPIs: Proton - pump inhibitor (Thuốc ức chế bơm proton)
T: Thymine
VDDM: Viêm dạ dày mạn


DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Mơ tả các loại đột biến điểm [3] ....................................................... 9
Hình 1.2. Gene EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [3] .................... 10
Hình 1.3. PCR - RFLP chẩn đốn đột biến 360C>G trên gene mã hóa enzyme
deoxycytidin kinase [20] ................................................................................. 16
Hình 1.4. Tỉ lệ chuyển hóa thuốc do các CYP [19] ........................................ 24
Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của CYP [1] ............................................................ 24
Hình 3.1. Kết quả giải trình tự mẫu HP484 .................................................... 37
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự mẫu HP487 .................................................... 38
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự mẫu HP491 .................................................... 38
Hình 3.4. Kết quả real - time PCR của mẫu HP451 ....................................... 46
Hình 3.5. Kết quả real - time PCR của mẫu HP168 ....................................... 46
Hình 3.6. Kết quả real - time PCR của mẫu HP99 ......................................... 47

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả phản ứng real - time PCR cho khảo sát khả năng nhân bản
của hệ mồi và mẫu dò...................................................................................... 39
Bảng 3.2. Kết quả phản ứng real - time PCR tối ưu nhiệt độ lai ................... 41
Bảng 3.3. Kết quả phản ứng real - time PCR tối ưu nồng độ mồi .................. 42
Bảng 3.4. Kết quả phản ứng real - time PCR tối ưu nồng độ hai mẫu dò ...... 43
Bảng 3.5. Kết quả phản ứng real - time PCR tối ưu nồng độ Mg .................. 44
Bảng 3.6. Kết quả phản ứng real - time PCR tối ưu nồng độ enzyme ............ 45
Bảng 3.7. Kết quả phản ứng real - time PCR khảo sát nồng độ ADN khuôn 48
Bảng 3.8. Tỉ lệ kiểu gene CYP2C19*2 ........................................................... 49
Bảng 3.9. Tỉ lệ kiểu gene CYP2C19*2 theo nhiễm hay không nhiễm H. pylori
......................................................................................................................... 50
Bảng 3.10. Tỉ lệ kiểu gene CYP2C19*2 theo nhóm tuổi ............................... 51
Bảng 3.11. Tỉ lệ kiểu gene CYP2C19*2 theo giới.......................................... 53


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hệ thống CYP450 là một hệ thống enzyme quan trọng đối với con
người, xúc tác chuyển hóa các chất nội sinh như steroid, cholesterol, acid mật
… cũng như các chất ngoại sinh bao gồm các chất độc, phụ gia thực phẩm,
dung môi công nghiệp và các chất ô nhiễm và đặc biệt là chuyển hóa thuốc.
Bên cạnh phân giải, chúng cịn xúc tác hoạt hóa tiền chất gây ung thư
procarcinogens thành chất gây ung thư.
Trong đó, CYP2C19 là một trong những enzyme quan trọng nhất của hệ
CYP450. Enzyme này chuyển hóa của một số hydantoins và barbiturate trong
cơ thể, cũng như các thuốc có cấu trúc liên quan như omeprazole và
lansoprazole trong các bệnh về tiêu hóa.

Có thể chia bệnh nhân thành hai nhóm, chuyển hóa kém và chuyển hóa
tốt, tùy thuộc vào khả năng thủy phân S - mephenytoin trong cơ thể. Kiểu
hình chuyển hóa kém là đồng hợp lặn. Kiểu hình chuyển hóa tốt có thể hoặc
là đồng hợp tử trội hoặc là dị hợp kiểu gene. Ít nhất hai đột biến di truyền
(CYP2C19*2 và CYP2C19*3) của gene CYP2C19 chịu trách nhiệm cho các
kiểu hình chuyển hóa kém.
CYP2C19*2 là một đột biến điểm tại base G681 của exon 5 trong gene
CYP2C19, tạo ra một cầu nối sai, làm thay đổi khung đọc của mRNA bắt đầu
với acid amine 215 và tạo ra một bộ ba kết thúc sớm, kết quả là một protein
ngắn, khơng có chức năng. Các allen đột biến của người phương Đông chiếm
75% thấp hơn của người phương Tây chiếm 85%.
Phân tích kiểu hình cho thấy mối liên hệ giữa hoạt động của enzyme
CYP và nguy cơ phát triển một số dạng ung thư. Sự khác biệt kiểu gene/ kiểu
hình phản ánh sơ lược sự khác biệt trong khả năng trao đổi chất của bệnh
nhân ung thư. CYP2C19*2 đồng hợp tử có khuynh hướng hoạt hóa chất gây


2

đột biến và chất gây ung thư cao hơn. Sự khác biệt đó cịn có thể ảnh hưởng
đến hiệu quả và độc tính của thuốc. Bệnh nhân mang CYP2C19*2 đồng hợp
tử có thể có tác dụng phụ khơng mong muốn sau khi dùng diazepam, chẳng
hạn như gây ngủ kéo dài và bất tỉnh.
Hiệu quả điều trị của thuốc ức chế tiết acid dạ dày (thuốc kháng thụ thể
H2 và thuốc ức chế bơm proton) trong việc chữa lành bệnh viêm loét dạ dày tá tràng và trào ngược dạ dày - thực quản (GERD) phụ thuộc vào hiệu lực của
ức chế tiết acid. Các PPIs gây ức chế mạnh và lâu dài trong tiết acid dạ dày,
được coi là điều trị hiệu quả nhất các bệnh liên quan đến acid. Việc nhiễm H.
pylori sẽ gây ảnh hưởng đến tác dụng ức chế tiết acid của PPIs và được coi là
một trong những yếu tố gây ra sự khác biệt về hiệu lực của thuốc đối với đa
hình di truyền của từng cá nhân.

Phát hiện đột biến CYP2C19*2 có thể cung cấp thông tin cần thiết cho
việc lựa chọn phác đồ, liều lượng thuốc bị chuyển hóa do enzyme CYP2C19,
như các thuốc nhóm PPIs, an thần, sốt rét, chống ung thư và thuốc chống kết
tập tiểu cầu (clopidogrel) phù hợp. Vì vậy quy trình phát hiện đột biến
CYP2C19*2 có thể được ứng dụng để giúp tăng hiệu quả điều trị cho bệnh
nhân, đồng thời bệnh nhân được chỉ định những phác đồ phù hợp với bản chất
di truyền của mình hướng tới điều trị y học cá thể (personal medicine).
Ngày nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử, các quy trình phát
hiện đột biến có thể được hồn thiện và giúp ích cho lâm sàng. Quy trình xác
định đột biến CYP2C19*2 sẽ hỗ trợ hữu hiệu cho các quyết định sử dụng
nhiều loại thuốc khác nhau, trong đó đặc biệt với PPIs để điều trị các bệnh
viêm loét dạ dày - tá tràng. Để làm được điều đó, mỗi phịng thí nghiệm cần
phải tối ưu hóa được quy trình, ổn định các điều kiện thí nghiệm trước khi áp
dụng quy trình một cách thường quy. Với mong muốn đưa ra được quy trình
phát hiện đột biến CYP2C19*2, chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát
hiện một số đột biến CYP2C19 ở bệnh nhân viêm dạ dày”


3

với 2 mục tiêu sau:
1. Tối ưu hóa quy trình phản ứng real - time PCR phát hiện đột biến
CYP2C19*2
2.

Xác định tỉ lệ đột biến CYP2C19*2 ở bệnh nhân viêm dạ dày.


4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vài nét về bệnh viêm dạ dày mạn

Nhiễm H. pylori gây ra viêm niêm mạc dạ dày mạn tính, và bằng các lộ
trình bệnh sinh khác nhau có thể đưa đến loét tá tràng, loét dạ dày, u mô
lympho ở niêm mạc dạ dày - u MALT (mucosal - associated lymphoid tissue)
hoặc ung thư dạ dày.
VDDM có thể và thường hay kết hợp với các thương tổn khác như dị sản
ruột hoặc loạn sản của niêm mạc dạ dày. Nhiều tác giả coi dị sản ruột và loạn
sản là những thương tổn tiền ung thư, định nghĩa đó là những bất thường về
mơ học mà tại đó ung thư xuất hiện nhiều hơn so với các chỗ khác có mơ học
bình thường, đặc biệt khi có sự kết hợp với các yếu tố nguy cơ cao chẳng hạn
như viêm teo niêm mạc dạ dày mạn, loét dạ dày, thiếu máu ác tính - Biermer,
sau mổ cắt dạ dày…
Diễn tiến của VDDM có thể đưa đến tiến triển viêm teo niêm mạc dạ dày
với việc giảm một số các khe tuyến, mà hậu quả là việc xuất hiện dị sản ruột
trên bề mặt các tế bào biểu mô.
Như vậy, viêm dạ dày do nhiễm H. pylori có thể là ngun nhân chính
gây nên một lộ trình viêm teo niêm mạc - dị sản ruột - loạn sản - ung thư dạ
dày. Trên cơ sở đó, Tổ chức Y tế Thế giới đã xếp H. pylori là nguyên nhân
hàng đầu trong bệnh sinh ung thư dạ dày - carcinoma [5].
Phân loại viêm dạ dày theo hệ thống Sydney:
Phân loại viêm dạ dày theo hệ thống Sydney bao gồm 3 thành phần
chính: định khu, hình thái và ngun nhân. Trong đó định khu được xem là
trung tâm của việc phân loại và có liên quan đến nguyên nhân hoặc hình thái
[5].
Định khu: định khu viêm dạ dày gồm 3 vị trí: hang vị, thân vị và tồn bộ
dạ dày.

Hình thái: cho đến nay việc định nghĩa niêm mạc bình thường vẫn là chủ


5

đề bàn luận của các nhà bệnh học. Theo phân loại viêm dạ dày của hệ thống
Sydney, niêm mạc bình thường khi có một số ít lympho bào và tương bào rải
rác trong lớp cận niêm của niêm mạc dạ dày.
Về hình thái có 3 dạng tổn thương chính: (1) Viêm dạ dày cấp; (2)
VDDM; và (3) Những dạng đặc biệt của viêm dạ dày.
Viêm dạ dày cấp:
Viêm dạ dày cấp được đặc trưng do sự hiện diện của bạch cầu đa nhân
hay bạch cầu trung tính trong lớp cận niêm và có thể kết hợp với những
thương tổn như phù nề, xuất huyết, trợt.
Về nguyên tắc, viêm dạ dày cấp thường thoáng qua và hiếm khi được
chẩn đoán bằng mơ bệnh học. Nếu đồng thời có sự gia tăng những tế bào
viêm mạn thì trong trường hợp này được coi là VDDM hoạt động.
VDDM:
VDDM được biểu hiện bằng sự thấm nhập của lympho bào trong lớp cận
niêm, có thể lan rộng hay không liên tục và mức độ nông sâu khác nhau tùy
thuộc vào độ dày của lớp này. Hệ thống Sydney khơng có thuật ngữ viêm
nơng dạ dày hay là viêm kẽ dạ dày như các tác giả khác.
Trong VDDM có kèm theo các biểu hiện và thương tổn như sau:
VDDM hoạt động:
VDDM hoạt động khi kết hợp với sự hiện diện của bạch cầu đa nhân
trung tính trong lớp cận niêm và giữa các tuyến niêm mạc. Đặc biệt trong
viêm dạ dày do nhiễm H. pylori, sự đánh giá này có ý nghĩa đặc biệt trong
việc kiểm chứng hiệu quả điều trị tiệt trừ H. pylori.
Hiện tượng teo: hiện tượng teo liên quan đến việc mất đi hay là sự phá hủy
những tuyến đặc biệt của niêm mạc dạ dày nhưng khơng làm giảm độ dày của

nó. Viêm teo niêm mạc dạ dày có liên quan đến việc mất chức năng của dạ
dày và là nguy cơ đưa đến loét dạ dày - tá tràng.
Hiện tượng dị sản: Hiện tượng dị sản liên quan đến một tiến trình theo trình


6

tự dị sản ruột - loạn sản - ung thư dạ dày. Nhìn chung, dị sản ruột thường kết
hợp với viêm teo niêm mạc dạ dày. VDDM với dị sản ruột ở thân vị là biểu
hiện của bệnh Biermer. Dị sản ruột có sự kết hợp với viêm teo niêm mạc
trong 50 % trường hợp.
H. pylori:
Sự hiện diện của vi khuẩn này là một sự kiện quan trọng trong phân loại
viêm dạ dày theo hệ thống Sydney. Trên quan điểm phân loại theo hình thái,
hệ thống Sydney nhấn mạnh đến việc sử dụng thuật ngữ “ H. pylori và những
tổn thương do nó gây ra”.
Đánh giá mức độ trầm trọng:
Mức độ trầm trọng tùy thuộc vào tình trạng viêm cấp hoặc mạn, mức độ
viêm teo, dị sản ruột và sự hiện diện của H. pylori. Có 3 mức độ: nhẹ (yếu),
vừa (trung bình), và nặng (trầm trọng) [5].
Những dạng đặc biệt của viêm dạ dày:
Gồm hai nhóm dưới đây:
Viêm dạ dày khơng đặc hiệu: đó là những tổn thương mơ học được mô tả
trong báo cáo của các nhà bệnh học nhưng không đặc trưng cho bệnh. Tuy
nhiên, việc kết hợp các dữ kiện này có thể giúp ích cho chẩn đốn. Viêm dạ
dày khơng đặc hiệu có nhiều hình thái thương tổn khác nhau như thối hóa
biểu mơ, phù nề, trợt, xơ hóa nhưng khơng phân mức độ.
Viêm dạ dày đặc hiệu: là những loại đặc biệt của viêm dạ dày như viêm dạ
dày dạng u hạt, viêm dạ dày do tăng bạch cầu ái toan [5].
Nguyên nhân:

Hệ thống Sydney đưa ra 3 nguyên nhân sau:
- Viêm dạ dày do nhiễm H. pylori.
- VDDM phản ứng là thuật ngữ thay thế cho viêm dạ dày trào ngược,
cũng như viêm dạ dày do dùng thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs).
- Không rõ nguyên nhân, không thường gặp và mới đây được biết với tên


7

gọi viêm dạ dày lympho bào [5].
1.2.

Đại cương về đột biến gene

1.2.1. Khái niệm cơ bản về đột biến gene
Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột. Một
đột biến gene là một sự thay đổi trong trình tự nucleotide trên gene, dẫn đến
kết quả là tạo ra một protein đột biến với trình tự acid amine thay đổi hay tác
động đến quá trình điều khiển sự tổng hợp của các sản phẩm gene. Nếu
protein đột biến có chức năng khác với dạng tự nhiên thì sẽ tạo ra một sự thay
đổi tương ứng ở những đặc tính có thể quan sát được và tạo ra thể đột biến.
Sự khác biệt có thể do hoạt tính hay tính ổn định của enzyme. Một số đột biến
có thể tồn tại trong quần thể bên cạnh các dạng tự nhiên làm thành một thể đa
hình [3].
Đột biến xảy ra ở các tế bào không sinh sản được gọi là đột biến sinh
dưỡng và tạo ra các thay đổi có tính cục bộ, khơng di truyền được như các u
sắc tố ngoài da người tạo ra nốt ruồi. Những đột biến sinh dưỡng có thể là
nguyên nhân gây ra ung thư và có thể là nguyên nhân của sự lão hóa [3].
Đột biến xảy ra trong giao tử được gọi là đột biến dòng mầm và được
truyền cho đời sau. Khi nghiên cứu các đột biến giao tử và đo tỉ lệ đột biến ở

sinh vật đa bào nói chung và người nói riêng cần xét đến tính lưỡng bội. Hầu
hết các đột biến gene là đột biến lặn và sẽ không được phát hiện nếu hợp tử
khơng có hai bản của allen đột biến. Do đó việc phát hiện và đo tần số đột
biến phải dựa vào quan sát các đột biến trội đang xảy ra trên nhiễm sắc thể
thường, các đột biến lặn và trội trên nhiễm sắc thể X. Trong tự nhiên, dù trong
điều kiện nào tất cả các gene đều có đột biến được gọi là đột biến tự nhiên hay
đột biến tự phát. Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. Các gene khác
nhau của cùng một sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau nhưng tần số
đột biến tự nhiên đối với mỗi gene là ổn định [3].
Tần số đột biến được đánh giá căn cứ trên một lần sao chép, một lần phân


8

bào hay trên một giao tử và trên một tế bào trong một thế hệ. Tuy tần số đột
biến của từng gene rất thấp nhưng tổng các đột biến của nhiều gene lại là một
số đáng kể, có ý nghĩa quan trọng trong tiến hóa. Các kết quả nghiên cứu in
vivo và in vitro trên tế bào người khoảng 10-6/gene/thế hệ. Ước tính các thay
đổi xảy ra trong mỗi thế hệ dựa vào tỉ lệ đột biến ở người như sau: 10-6 đột
biến/gene*5.104 gene/bộ gene đơn bội bằng 5.10-2 đột biến/giao tử (1/20).
Mỗi hợp tử có (1/20). 2=1/10 cơ hội xảy ra đột biến gene. Con số này có vẻ
rất cao nhưng cần nhớ rằng hầu hết các đột biến là lặn và như vậy sẽ không
được biểu hiện trong điều kiện dị hợp tử. Sự thay đổi các base có thể xảy ra
trong vùng khơng mã hóa của phân tử ADN và các acid amine bị thay đổi
cũng có thể không phải lúc nào cũng làm thay đổi đặc tính protein. Do vậy,
thay đổi trình tự nucleotide có thể khơng biểu hiện thành sự khác biệt tính
trạng và do đó khơng phải là đối tượng của chọn lọc các đột biến lặn tích tụ
trong bộ gene [3].
Hầu hết các đột biến là bất lợi và do đó các cơ chế đặc hiệu thường được
dùng để giảm thiểu các biến đổi trong chuỗi ADN hoặc phục hồi trình tự gốc

bằng cách sửa chữa đột biến [3].
1.2.2. Các loại đột biến
a. Đột biến điểm
Là kết quả của sự thay đổi một base trong chuỗi ADN do tác nhân gây
đột biến hoặc sai sót trong sao chép ADN.
Thay thế cặp nucleotide
Phổ biến nhất là chuyển vị, pyrimidin được thay thế bằng pyrimidin khác
hay purin bằng purin khác (A⇌G, C⇌ T). Sự chuyển vị, bắt cặp sai có thể
gây ra do các acid nitrơ hoặc các đồng đẳng base như 5 - bromo - 2 deoxyuridin (BrdU). Các đột biến điểm ít phổ biến hơn là đảo chuyển,
pyrimidin được thay thế bằng purin hay purin bằng pyrimidin (C/T ⇌ A/G).
Đột biến điểm có khuynh hướng đặc trưng là hồi biến, nghĩa là chuyển lại


9

dạng nguyên thủy. Điều này xảy ra vì lần đột biến tiếp theo tại cùng một điểm
có một phần ba cơ hội quay lại chuỗi ban đầu. Có ba loại đột biến điểm tùy
theo codon mang đột biến mã hóa:
 Đột biến đồng nghĩa: mã hóa cho cùng acid amine, khơng ảnh hưởng
đến protein cuối. Ví dụ, codon GCA hoặc GCG trong mARN đều mã hóa cho
arginine (loại này thường đúng với đột biến chuyển vị ở trí thứ 3 - base “linh
hoạt” của codon).
 Đột biến sai nghĩa: Mã hóa cho các acid amine khác, có thể làm protein
khơng có chức năng. Ví dụ, trong chuỗi protein β - globulin gây bệnh thiếu
máu hồng cầu hình liềm, GAG mã hóa cho glutamat, nếu thay bằng GUG sẽ
mã hóa cho valin. Đột biến sai nghĩa có thể gây hậu quả rất nghiêm trọng như
thiếu máu tế bào hình liềm, hoặc nhẹ như hemoglobin C (acid amine vị trí 6
của β - globulin bị thay thế bằng acid amine khác) hoặc khơng có kiểu hình.
 Đột biến vơ nghĩa: Mã hóa cho codon kết thúc, có thể làm cụt protein.
Tác động của các đột biến vô nghĩa tùy thuộc protein bị cụt bao nhiêu và mức

độ cần cho hoạt động của protein [3].

Hình 1.1. Mơ tả các loại đột biến điểm [3]
((A) Đồng nghĩa (silent); (B, C)Sai nghĩa (missense); (D) Vô nghĩa (nonesense))

Đột biến thay thế base có thể xảy ra trong promoter hoặc các vùng điều
hòa 5’ của gene hoặc trong intron và có thể ảnh hưởng tới sự phiên mã, dịch


10

mã hoặc mức độ xoắn của ADN. Nhiều thể β - thalassemia là hậu quả của các
đột biến không cấu trúc này ảnh hưởng mức biểu hiện các gene globin. Mức
độ ảnh hưởng tùy thuộc nucleotide bị thay thế và vị trí của nó trong ADN.
Đột biến lệch khung
Các đột biến này do chèn hoặc mất một hoặc nhiều nucleotide trong
vùng mã hóa của gene. Đột biến loại này thay đổi tất cả các acid amine phía
sau đột biến và rất dễ tạo sản phẩm khơng chức năng vì khác hẳn với các
protein thường. Ngoài ra, các khung đọc sai thường chứa các codon kết thúc,
sẽ làm quá trình tổng hợp protein dừng sớm [3].
b. Đột biến đa điểm
Các đột biến đa điểm là những thay đổi tác động đến hơn một base, thay
đổi từ hai đến hàng ngàn base, nhưng thường nhất là chỉ vài base. Hậu quả
thường là xóa bỏ một phần của trình tự mã hóa. Đột biến đa điểm khơng có
tính hồi biến, nghĩa là đột biến được ổn định.

.

Sự mất đoạn lớn sẽ làm thay đổi hồn tồn protein tạo ra, thậm chí mất
đoạn ngắn cũng gây hậu quả nghiêm trọng nếu nó làm thay đổi khung đọc,

nghĩa là nếu số lượng base bị xóa khơng chia hết cho 3.

Hình 1.2. Gene EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [3]
Sự chèn đa điểm có thể xảy ra do gene nhảy hoặc lỗi khi sao chép của các
yếu tố lặp lại (ví dụ các lặp lại AT). Hầu hết khi gene bị chèn sẽ bị lệch khung
hoặc thay đổi kết nối trong mARN, cả hai trường hợp này đều làm thay đổi
sản phẩm của gene. Gene nhảy dài tới vài ngàn base (kb) và vì vậy, nó làm
ngưng quá trình sao mã và dịch mã của bất kì gene nào chúng xen vào. Gene


11

nhảy có hai loại, retrotransposon và transposon. Các transposon có thể di
chuyển trực tiếp từ vị trí này sang vị trí khác của bộ gene, retrotransposon
trước hết được phiên mã thành ARN và sau đó lại thành ADN bởi enzyme
phiên mã ngược và chèn lại vào bộ gene. Transposon rất có ích cho các nhà
nghiên cứu được sử dụng làm công cụ để biến đổi ADN trong cơ thể sống
nhằm gây đột biến nhân tạo (là một trong các phương pháp chọn giống thực
vật hiện đại và có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng q ở cây
trồng. Ngoài ra đối với con người, đột biến gene gây hại cho cơ thể cho nên
cần phát hiện, để hạn chế nguyên nhân và sự tràn lan của gene đột biến) [3].
1.2.3. Nguyên nhân đột biến
Có hai nguyên nhân gây đột biến là đột biến tự nhiên (xảy ra một cách tự
phát) và đột biến cảm ứng (gây ra bởi các tác nhân đột biến) [3].
a. Đột biến tự nhiên
Xảy ra trong tự nhiên một cách ngẫu nhiên với tần số nhất định và không
xác định được nguồn gốc. Bất kì một tiến trình nào dẫn đến sự gắn sai base
trong quá trình sao chép ADN sẽ tạo ra một đột biến điểm. Tấn suất sai sót tự
nhiên vào khoảng 10-10 base. Tỉ lệ thấp này đạt được nhờ khả năng sửa lỗi của
các ADN polymerase chủ yếu. Các enzyme này kéo dài ADN theo hướng 5’

→ 3’ nhưng có hoạt tính exonuclear 3’ → 5’. Nếu lỗi nằm giữa base được
chèn cuối cùng với sợi khuôn được phát hiện, enzyme loại bỏ base sai và thay
thế base đúng vào. Chuỗi mã của một protein trung bình 300 acid amine là
khoảng 1000 base chiều dài. Tỉ lệ đột biến tự phát là một trong 107 bản mã
sao của gene sẽ có một đột biến điểm, nghĩa là 10-7 tế bào sẽ có đột biến về
gene đó [3].
Đột biến tự nhiên ở mức phân tử gồm có hỗn biến, khử amine, chuyển vị,
đảo chuyển, đột biến lệch khung, oxy hóa phá hủy.
 Hỗn biến: 4 loại base trong ADN có thể tồn tại ở dạng hỗn biến,
tức là có khả năng tồn tại hoán chuyển giữa hai dạng (Keto ⇌ Enol và Amino


12

⇌ Imino). Base pyrimidin bình thường có dạng keto (C = O), nhưng đơi khi
chúng cũng có dạng enol (C – OH). Ở dạng enol, thymin có thể bắt cặp với
guanin và enol cytosine có khả năng bắt cặp với adenin, tương tự base purin
bình thường tồn tại dưới dạng amino (NH2) nhưng cũng có dạng hỗn biến
imino (=NH) hiếm gặp, có thể dẫn đến sự bắt cặp nhầm. Nếu trong khi ADN
sao chép, G ở dạng enol, polymerase sẽ thêm T vào thay vì bình thường là C
vì quy luật bắt cặp bị thay đổi (không phải do lỗi của polymerase). Kết quả là
sự chuyển vị G - C thành A - T; sự hỗn biến chỉ gây các đột biến chuyển vị.
 Khử amine: Các phản ứng khử amine thông thường là phản ứng
thủy phân cytosine thành uracil, q trình này phóng thích ammonia và khử
amine 5 - methylcytosine thành thymin và ammonia. Trong ADN, sự khử
amine cytosine tự phát được chỉnh lại bằng cách loại bỏ uracil và thay thế
bằng cytosine, còn sự khử amine 5 - methylcytosine khơng được chỉnh vì cơ
chế sửa chữa khơng nhận thymin là lỗi. Trong ADN bộ gene cytosine tại các
trình tự CG (CpG) thường bị methyl hóa, nó là “điểm nóng” cho đột biến.
Mới đây người ta tìm thấy gene liên quan đến loạn sản sụn có những điểm

nóng như vậy.
 Đột biến lệch khung thường là lỗi của polymerase khi sao chép
các đoạn lặp lại của một nucleotide. Mỗi polymerase có độ chính xác khác
nhau. Yếu tố chính ảnh hưởng đến độ chính xác của polymerase là có hoạt
tính exonuclease đọc sửa 3’ - 5’, làm loại bỏ các base bắt cặp khơng đúng
chèn vào bởi polymerase.
 Oxy hóa phá hủy do các gốc oxy tự do. Các gốc oxy tự do tăng
trong tế bào do chuyển hóa oxy hóa (và cũng được tạo từ các tác nhân vật lý
như tia phóng xạ). Sản phẩm oxy hóa quan trọng là 8 - hydroxy guanin bắt
cặp sai với A, tạo đảo chuyển G - C thành T - A [3].


13

b. Đột biến cảm ứng
Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là
tác nhân gây đột biến. Các tác nhân này có thể làm thay đổi trình tự ADN.
Các tác nhân gây đột biến cảm ứng được chia thành các tác nhân hóa học và
các tác nhân vật lý [3].
Tác nhân hóa học gây đột biến:
Có thể được chia ra làm 4 nhóm:
 Nhóm base đồng đẳng
- Bromouracil (BU) là hợp chất nhân tạo dùng rộng rãi trong nghiên cứu.
Giống với thymin (có nguyên tử Br thay cho nhóm methyl) sẽ gắn vào ADN
và bắt cặp với adenin giống như thymin, có nhiều khả năng hỗn biến thành
dạng enol (BU∗) và có khả năng bắt cặp với guanin. Như vậy, BU có thể xâm
nhập và bắt cặp bổ sung với adenin và thay cho thymin tạo A - BU và ở vòng
sao chép tiếp theo BU hỗn biến thành BU∗ và bắt cặp với guanin tạo BU∗ - G,
do đó A - T được thay thế thành G - C. Trong khi đó BU∗ lại có thể xâm nhập
sai khi gắn thay chỗ cho cytosine tạo G - BU∗, sau đó BU∗ lại hỗn biến thành

BU và bắt cặp với adenin tạo A - BU và ở vòng sao chép tiếp theo adenine bắt
cặp với thymin thành A - T.
- Aminopurin là đồng đẳng của adenin, có thể bắt cặp với thymin hoặc với
cytosine, gây chuyển vị A - T thành G - C hoặc G - C thành A - T. Các đồng
đẳng base gây chuyển vị như gây hỗn biến tự phát.
 Các chất hóa học thay đổi cấu trúc và đặc tính bắt cặp của các base,
gồm: Các chất khử amine và các chất alkyl hóa.
- Các chất khử amine. Ví dụ điển hình: các acid nitrơ tạo bởi sự phân giải
các nitrit (chất bảo quản) trong thực phẩm làm cytosine thành uracil,
methylcytosine thành thymin, và adenin thành hypoxanthin khử amine,
hypoxanthin trong ADN bắt cặp với C gây chuyển vị. Methylcytosine có mặt
trong các gene của vi sinh vật bậc cao có thể ảnh hưởng đến hoạt tính phiên


14

mã. Các base như xanthin, hypoxanthin và uracil có thể khởi động cơ chế sửa
chữa. Thymin, dẫn xuất từ methylcytosine nội sinh và nhiều sự chuyển vị có
thể xảy ra theo cách này. Các gốc 5 - methylcytosine, sau đó trở thành “điểm
nóng” của sự đột biến. Hydroxylamin (NH2OH) chỉ khử amine của cytosine,
do đó tác động rất giới hạn:
Cytosine NH2OH 4 - N - Hydroxycytosine, bắt cặp với adenin
- Chất alkyl hóa. Ví dụ điển hình: Nitrosoguanin (NTG), methyl methan
sulfonat (MMS), ethyl methan sulfonat (EMS) là các tác nhân hóa học gây đột
biến phản ứng với các base và thêm nhóm ethyl hoặc methyl gọi là các tác
nhân alkyl hóa. Tùy yếu tố bị tác động, chúng có thể gây đột biến ít nhất bằng
3 cách:
 Thêm nhóm methyl hay ethyl vào guanin tạo base đồng đẳng của
adenin dẫn tới sự bắt cặp bổ sung sai.
 Mất purin do guanin đã bị alkyl hóa tạo lỗ hổng trên ADN, khi sao

chép có thể làm đứt mạch.
 Liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các phân tử ADN khác nhau
làm mất nucleotide.
 Nhóm chèn vào ADN (tác nhân làm lệch khung). Nhóm này gồm các
chất proflavin, cam Acridin, ethidiumbromide dùng trong phịng thí nghiệm
làm chất nhuộm. Tất cả đều là các phân tử đa vòng phẳng tương tác với các
base của ADN và chèn vào giữa chúng. Sự chèn này làm “dãn” sợi đôi ADN
và ADN polymerase bị “đánh lừa” chèn base vào đối diện nhiều hơn bình
thường, làm lệch khung ADN tạo thành.
 Các tác nhân thay đổi cấu trúc ADN
Các tác nhân này có thể là:
- Các phân tử lớn (kềnh càng) gắn vào base trong ADN và làm chúng trở
thành khơng mã hóa. Ví dụ: N - acetoxy - 2 - acetylaminofluorene( NAAAF).
- Các tác nhân gây liên kết chéo trong và giữa các sợi. Ví dụ các psoralen


15

có trong một số rau và dùng trong điều trị một số bệnh về da.
- Các chất hóa học gây đứt ADN ví dụ như các peroxid.
- Các hydrocarbon đa vịng. Ví dụ các benzypyrene có trong xăng.
Tác nhân vật lý gây đột biến
Các bức xạ có bước sóng khác nhau như là tia X, tia gamma, hạt phóng xạ
α, β gây ra đột biến khác nhau. Nhưng ảnh hưởng của chúng lên ADN qua các
gốc tự do và tác động trực tiếp:
 Đứt một hoặc cả hai sợi.
 Phá hủy các base.
 Liên kết chéo trong ADN [3].
1.3.

Phương pháp phát hiện đột biến gene

1.3.1.

Kỹ thuật PCR – RFLP (Polymerase Chain Reaction –

Restriction Fragment Length Polymorphisms)
RFLP có tên đầy đủ là “Restriction Fragment Length Polymorphism” là kỹ
thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn. Nó được kết hợp cùng kỹ thuật PCR
để tạo nên kỹ thuật PCR - RFLP.
1.3.1.1. Nguyên tắc
Nhằm khắc phục hiện tượng tạo ra quá nhiều băng ADN khi phân cắt bộ
gene bằng enzyme cắt giới hạn và sự khó khăn khi thiết kế mẫu dị phù hợp
trong việc phân tích đa hình di truyền trong kỹ thuật RFLP, người ta đã kết
hợp kỹ thuật PCR và RFLP để tạo ra kỹ thuật PCR - RFLP. Trong phương
pháp này một đoạn ADN sẽ được khuếch đại chọn lọc bằng kỹ thuật PCR
trước. Sau đó đoạn ADN này sẽ được cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp. Sự
khác nhau của các băng ADN sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium
bromide sẽ cho ta biết vị trí các đột biến. Cụ thể nó gồm 3 bước cơ bản:
- Tiến hành PCR với cặp mồi thích hợp để phân lập đoạn ADN cần phân
tích sự đa hình di truyền.
- Tiến hành phân cắt đoạn ADN này với một enzyme thích hợp.


16

- Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng ADN và đưa ra kết
luận [20].
Để có thể hiểu rõ hơn nguyên tắc của phương pháp này, chúng tơi xin
trình bày một ví dụ về việc áp dụng phương pháp PCR - RFLP phát hiện đột

biến gene mã hóa enzyme deoxycytidin kinase. Tại vị trí đột biến 360 trên
gene khi C được thay bằng G sẽ làm trên băng điện di xuất hiện 2 băng điện
490kb và 93kb thay vì 3 băng 214kb, 276kb và 93kb như bình thường.

Hình 1.3. PCR - RFLP chẩn đốn đột biến 360C>G trên gene mã hóa
enzyme deoxycytidin kinase [20]
1.3.1.2.

Ưu điểm

- Khơng đắt tiền.
- Dễ thiết kế thí nghiệm.
- Có thể áp dụng để phát hiện đa hình đơn nucleotide.
- Khơng u cầu dụng cụ đắt tiền.


17

1.3.1.3.

Nhược điểm

- Yêu cầu phải biết rõ trình tự đoạn ADN và vị trí enzyme cắt giới hạn.
- Mất nhiều thời gian.
- Không áp dụng được cho mẫu lớn [33].
1.3.2. Kỹ thuật real - time PCR
1.3.2.1.

Nguyên tắc

Real - time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN được hiển
thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real time. Và do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm PCR khơng cần thiết
phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để xác định có sản
phẩm khuếch đại đích hay khơng vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch
đại cũng được hiển thị ngay sau khi hồn tất phản ứng khuếch đại. Như vậy
có thể nói real - time PCR là kỹ thuật nhân bản ADN đích trong ống nghiệm
thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong
các ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để
người làm thí nghiệm có thể thấy được. Thiết bị quan trọng của kỹ thuật này
là máy real - time PCR. Thiết bị này cũng giống các máy PCR thông thường
nhưng được trang bị thêm một bộ phận được gọi là thiết bị đọc tín hiệu. Kết
cấu của thiết bị này gồm hai bộ phận chính: (1) nguồn sáng phát ra tia sáng
kích thích có bước sóng xác định lên các ống phản ứng, (2) camera hay cảm
biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng
sau khi các ống này được kích thích bằng ánh sáng do nguồn sáng phía trên.
Để có được tín hiệu huỳnh quang người ta có thể có nhiều cách thiết kế:
- Chất phát huỳnh quang là một loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi
ADN. Chất hay dùng là SYBR I. Tuy nhiên chất này có tín hiệu huỳnh quang
phát ra khơng cao và có thể ức chế q trình PCR [17].
- Sử dụng mẫu dò là những đoạn nucleotide sợi đơn có trình tự có thể bắt
cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên ADN đích (trong PCR thì đó chính