Nghiên cứu biểu hiện protein e2 của virus dịch tả lợn cổ điển (classical swine fever) bằng hệ thống baculovirus

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

XENGPHAVONE KHONMANY

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN E2 CỦA VI RÚT
DỊCH TẢ LỢN CỔ ĐIỂN (CLASSICAL SWINE FEVER)
BẰNG HỆ THỐNG BACULOVIRUS

Chuyên ngành :

Thú y

Mã số

8640101

Người hướng dẫn khoa học

TS. Bùi Thị Tố Nga
TS. Đặng Vũ Hoàng

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP -2019


LỜI CAM ĐOAN
Luận văn này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin
vô hoạt chứa tiểu phần E2 trên hệ thống Baculovirus phòng bệnh dịch tả lợn” thuộc
chương trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp và thủy sản của Bộ Nông Nghiệp và Phát
triển nông thôn do TS. Trần Thị Thanh Hà làm chủ trì.
Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận
văn này, tơi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung

thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các luận văn, luận án nào và đã
được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận văn này. Đề tài có quyền sử dụng kết
quả của luận văn này để phục vụ cho đề tài.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Xengphavone Khonmany

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, cán bộ công nhan viên sự giúp đỡ,
động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn
sâu sắc TS. Bùi Thị Tố Nga và TS. Đặng Vũ Hồng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều
công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, , Bộ mơn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia
(Việt Nam), đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn
thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ mơn Hóa sinh Miễn dịch đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Xengphavone Khonmany

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................................... i
Lời cảm ơn .... ................................................................................................................... ii
Mục lục ........ .................................................................................................................. iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi
Danh mục bảng .............................................................................................................. viii
Danh mục hình ................................................................................................................. ix
Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x
Thesis abstract................................................................................................................ xiii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài.............................................................................................. 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 2

1.4.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 2

1.5.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Hiểu biết về vi rút dịch tả lợn (DTL) .................................................................. 3

2.1.1.

Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới ........................................................................ 3

2.1.2.

Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam .................................................................. 4

2.1.3.

Cấu trúc của vi rút DTL ...................................................................................... 5

2.1.4.

Sức đề kháng của vi rút DTL.............................................................................. 7

2.2.

Bệnh dịch tả lợn .................................................................................................. 7

2.2.1.

Nguyên nhân gây bệnh DTL .............................................................................. 7

2.2.2.

Loài mắc ............................................................................................................. 7

2.2.3.

Phương thức truyền lây....................................................................................... 8

2.2.4.

Lứa tuổi mắc bệnh .............................................................................................. 8

2.2.5.

Chất chứa của và độc lực của vi rút .................................................................... 9

2.2.6.

Triệu chứng ......................................................................................................... 9

2.2.7.

Bệnh tích ........................................................................................................... 11

2.2.8.

Phương pháp chẩn đốn bệnh DTL .................................................................. 12

2.2.9.

Phòng chống bệnh DTL .................................................................................... 17

iii


2.3.

Vắc xin phòng dịch tả lợn ................................................................................. 19

2.3.1.

Vắc xin sản xuất trong nước và đang lưu hành tại Viêt Nam ........................... 19

2.3.2.

Vắc xin được phép nhập khẩu và đang lưu hành tại Viêt Nam ........................ 20

2.4.

Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus trong sản xuất protein tái tổ
hợp của vi rút .................................................................................................... 21

Phần 3. Đối tượng, nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .................. 23

3.1.

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 23

3.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 23

3.3.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 23

3.4.

Nguyên liệu nghiên cứu .................................................................................... 23

3.4.1.

Các loại tế bào .................................................................................................. 23

3.4.2.

Môi trường cho nuôi cấy tế bào ........................................................................ 23

3.4.3.

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR .......................... 24

3.4.4.

Hóa chất dùng trong điện di ............................................................................. 24

3.4.5.

Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống
Baculovirus ....................................................................................................... 24

3.4.6.

Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng trong phản ứng Western blot....... 24

3.4.7.

Máy móc, thiết bị .............................................................................................. 24

3.4.8.

Các vật liệu khác............................................................................................... 25

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 25

3.5.1.

Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của
Viện Thú y ........................................................................................................ 25

3.5.2.

Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng RT–
PCR, xác định TCID50 của vi rút theo phương pháp thường quy của
Viện Thú y ........................................................................................................ 25

3.5.3.

Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 và nhân gen và tinh sạch DNA bằng
phương pháp thường quy .................................................................................. 26

3.5.4.

Tạo dịng protein mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của
nhà sản xuất. ..................................................................................................... 27

3.5.5.

Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger ..................................................... 30

3.5.6.

Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus
tái tổ hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to -bac Expression
System), quy trình cơng nghệ của Viện Thú y Nhật Bản ................................. 30

iv


3.5.7.

Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein

E2 trên tế bào côn trùng (theo công bố của Barbara Malitscheck et al.,
1999) ................................................................................................................. 31

3.5.8.

Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ
hợp. ................................................................................................................. 32

3.5.9.

Phương pháp Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp. ............................ 32

Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 37
4.1.

Kết quả nhân chủng vi rút dtl, kiểm tra các đặc tính vi rút của chung gốc ...... 37

4.1.1.

Kết quả nuôi cấy tế bào .................................................................................... 37

4.1.2.

Kết quả gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a. .................................. 38

4.1.3.

Kiểm tra đặc tính củng gốc, xác định sự có mặt của vi rút DTL bằng phản
ứng RT-PCR phát hiện đoạn gene noncoding E2 của vi rút DTL phân lập
trên tế bào PK15a ............................................................................................. 39

4.2.

Thiết kế mồi đặc hiệu và khuếch đại protein E2 của vi rút dịch tả lợn
bằng phương pháp rt-pcr................................................................................... 40

4.3.

Tạo dịng protein mã hóa E2 trong vector tách dịng pfastbac, kiểm tra
trình tự khung protein biểu hiện ....................................................................... 41

4.3.1.

Tạo dòng gen E2 của vi rút dịch tả lợn trong véc tơ tách dòng pFastBac1/NTTOPO ................................................................................................................................ 41

4.3.2.

Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng ....................................... 44

4.3.3.

Kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng phương pháp
Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) trên tế bào côn trùng và
Western Blot ..................................................................................................... 46

4.4.

Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống
baculovirus........................................................................................................ 47

4.4.1.

Kết quả thực hiện phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay
(IPMA) đối với mẫu huyết thanh thực địa ........................................................ 47

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 50
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 50

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 50

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 51
Một số hình ảnh thực hiện đề tài ..................................................................................... 58

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

%

Percentage

µl

Microliter

ml

Milliliter

µg

Microgram

μM

Micromole

ºC

Celsius

AEC

3- Amino-9-Ethycarbazone

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

ASF

African swine fever

BDV

Border disease virus

bp

Base Pair

BVDV

Bovine viral diarrhoea virus

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid

CPE

Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào)

CSF

Classical swine fever.

CSFV

Classical swine fever virus.

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid.

dNTP

Deoxynucelside triphosphate

DTH

Dịch tả heo

DTL

Dịch tả lợn

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetracetic Acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

EU

European Union

vi


GP

Glycoprotein

IFN

Interferon

IPMA

Immuno - Peroxidase Monolayer Assay

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB

Luria Bertani

MDCK

Madin - Darby Canine Kidney

DMEM

Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium

5’NCR

5' noncoding region

NS

Nonstructural protein

OIE

Office Internationale des Epizooties

ORF

Open Reading Frame

PBS

Phosphate buffered saline.

PCR

Polymerase Chain Reaction

pH

Potential of Hydrogen

PK15

Porcine Kidney.

RNA

Ribonucleic Acid.

RT

Reverse Transcriptase

RT-PCR

Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction.

SF21AE

Spodoptera frugiperda

STE

Swine Testicular Epitheloid

TCID50

50% Tissue Culture Infectious Dose

TN5

Hight FIVE

VNT

Virus Neutralization Test

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 27
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng cắt enzyme................................................................ 29
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ
hợp mang Protein E2 trên tế bào côn trùng ................................................. 31

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp........... 33

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức Thú y
thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 9 năm 2018........................................... 4
Hình 2.2. Cấu trúc bộ gen Flavivirus ............................................................................. 6
Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý phản ứng RT - PCR .......................................................... 17
Hình 4.1. Tế bào PK15a sau 24 giờ ni cấy với độ phóng đại 20X .......................... 37
Hình 4.2. Tế bào PK15a gây nhiễm vi rút DTL với độ phóng đại 20X....................... 38
Hình 4.3. Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR .................................................... 39
Hình 4.4. Phổ điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR. ................................................... 40
Hình 4.5. Cấu trúc vector pFastBac/NT TOPO ........................................................... 41
Hình 4.6. Sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên đã được lựa chọn để kiểm tra khả năng mang
véc tơ pFastBac_E2 tái tổ hợp ..................................................................... 42
Hình 4.7. Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu gen E2 trên khn
plasmid từ các khuẩn lạc lựa chọn. .............................................................. 42
Hình 4.8. Trình tự gen và khung đọc của gen E2 của vi rút dịch tả lợn chủng
VN91 được tách dòng .................................................................................. 43
Hình 4.9. Kết quả so sánh trình tự gen và nhận diện lồi sử dụng cơng cụ Blast
giữa trình tự gen E2 vi rút Dịch tả lợn và ngân hàng NCBI ........................ 44
Hình 4.10 Sơ đồ chủng biểu hiện gen và Baculovirus tái tổ hợp với hệ thống biểuhiện
Bac-to-Bac Expression System của hãng Invitrogen (Invitrogen, 2008).............. 44
Hình 4.11. Sơ đồ các bước tái tổ hợp protein E2 của vi rút DTL bằng hệ thống biểu
hiện Baculovirus .......................................................................................... 45
Hình 4.12. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh và chất
chỉ thi Bluo-gal và các khuẩn lạc này có thể là các dịng chứa Bacmid
tái tổ hợp ...................................................................................................... 45

Hình 4.13. Phổ điện di sản phẩm PCR. .......................................................................... 46
Hình 4.14. Hình ảnh tế bào cơn trùng SF21AE ni ở 27oC trong 72 giờ ..................... 47
Hình 4.15. Kết quả IPMA sử dụng tế bào côn trùng Hight FIVE nhiễm Baculovirus
tái tổ hợp mang gen E2 vi rút dịch tả lợn ..................................................... 48
Hình 4.16. Kiểm tra biểu hiện gen E2 trong Baculovirus tái tổ hợp bằng phương
pháp Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng vi rút dịch tả lợn
do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp ............................................................... 49

ix


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Xengphavone KHONMANY
Tên Luận văn: Nghiên cứu biểu hiện Protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển
(Classical Swine Fever) bằng hệ thống Baculovirus
Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 8640101

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu:
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ
điển sử dụng tế bào cơn trùng làm sinh phẩm dùng trong chẩn đốn và nguyên liệu tiến
tới sản xuất vắc xin phòng bệnh Dịch tả lợn cổ điển tại Việt Nam.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:
Địa điểm nghiên cứu: Bộ mơn Hóa sinh-Miễn dịch, Viện Thú y (Việt Nam).
Các loại tế bào dòng: PK15a, tế bào côn trùng: SF21AE và TN5. Vi rút DTL.
Môi trường cho nuôi cấy tế bào: Môi trường DMEM, tripsin EDTA, Huyết thanh
bào thai bê, PBS (Phosphate Buffer saline), kháng nấm kháng sinh của hãng Gibco,
nước cất 2 lấn.

Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR: Trizol Chloroform,
Iso-Propanol, Ethanol 100% và các thành phần trong tổng hợp cDNA và PCR:
Nuclease-free water, Random Primer, Ribonucleic Acid (RNA), First strand buffer,
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Reverse Transcriptase, MgCl2, PCR buffer 10x,
Taq polymerase (của hãng Promega), Reverse Primer R2, Forward Primer F2.
Hóa chất dùng trong điện di: Agarose, TAE, loading dye, DNA marker, Etidium
Bromide (của hàng Sigma, Cat. No H5041).
Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống
Baculovirus
Máy móc, thiết bị: Buồng cấy vơ trùng, cân phân tích, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm 370C
có 5% CO2, tủ ấm 270C, kính hiển vi soi ngược, tủ lạnh 40C, tủ lạnh -300C, tủ lạnh 800C, bình nitơ lỏng, máy ly tâm, kính hiển vi soi ngược, màng lọc 0,45µm, vontex,
máy đo pH điện tử, máy khuấy từ, máy chạy PCR, Hệ thống điện di, Bộ điện di, Máy
soi chụp ảnh gel, Máy cô đặc SPD 1010, Máy siêu âm.
Các vật liệu khác: Chai nuôi cấy T25, T75, T150, đĩa nuôi cấy 96 giếng, ống ly
tâm 15ml, 50 ml của hãng Corning, Eppendorf 1,5ml, Eppendorf 2,0ml, PCR tube
1,5ml; 0.5ml; 0,2ml, Pipette và đầu tip tương ứng 1000µl, 200 µl, 100µl, 10µl, 2µl (Đầu

x


tip free RNase), máng nhựa, giá đựng, găng tay, khẩu trang, cồn sát trùng... và các máy,
thiết bị khác trong phịng thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu
- Nhân chủng vi rút DTL, kiểm tra các đặc tính vi rút của chủng gốc.
- Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 của vi rút DTL, khuếch đại gen E2, tinh sạch DNA.
- Tạo dịng gen mã hóa E2 trong vector tách dịng pFastBac, kiểm tra trình tự gen.
- Tạo bacmid mang protein E2 của vi rút DTL.
- Chuyển nạp bacmid vào tế bào côn trùng SF21AE, tạo Baculovirus tái tổ hợp
mang protein E2.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện

Baculovirus
Phương pháp nghiên cứu
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng
tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong
lĩnh vực thú y:
- Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của Viện
Thú y.
- Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng TR–PCR, xác
định TCID50 của vi rút DTL theo phương pháp thương quy của Viện Thú y.
- Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2, nhân gen và tinh sạch DNA bằng phương pháp
thường quy.
- Tạo dịng gen mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Giải trình tự gen, kiểm tra trình tự khung gen biểu hiện sử dùng Kít theo hướng
dẫn của nhà sản xuất.
- Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ
hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to bac expression system) quy trình
cơng nghệ của Viện Thú y Nhật bản.
- Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 trên
tế bào côn trùng theo công bố Barbara Malitscheck et al., 1999.
- Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ hợp hoặc
Phương pháp ELISA sử dụng kháng nguyên E2 tái tổ hợp theo quy trình của Viện Thú y.
Kết quả chính và kết luận:
Từ những nghiên cứu đã đạt được ở trên chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:

xi


Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết lập thành cơng phương pháp trung hịa vi
rút và ứng dụng thành cơng quy trình thực hiện VNT với các mẫu huyết thanh thực địa.
Tiến hành tái tổ hợp protein E2 của vi rút dịch tả lợn bằng hệ thống biểu hiện

Baculovirus trên tế bào côn trùng. Chủng vi rút VN91 phân lập tại Việt nam được sử
dụng làm khuôn mẫu để tái tổ hợp protein E2. Trình tự tồn bộ gen chủng vi rút VN91
đã được chúng tôi công bố năm 2018 (GenBank: LC374604). Kết quả nghiên cứu cho
thấy protein E2 tái tổ hợp của vi rút dịch tả lợn có hoạt tính sinh học tự nhiên, được
nhận diện bới kháng thể kháng vi rút dịch tả lợn. Đồng thời, kết quả thu được cũng cho
thấy kháng nguyên E2 tái tổ hợp là ứng cử viên tiềm năng để phát triển vắc xin thế hệ
mới phòng bệnh dịch tả lợn tại Việt Nam.
Đã ứng dụng thành công hệ thống biểu hiện Baculovirus nhằm tái tổ hợp protein
E2 của vi rút DTL phân lập tại Việt Nam. Protein E2 tái tổ hợp trong nghiên cứu này
mang hoạt tính sinh học tự nhiên (được nhận diện bởi kháng thể kháng vi rút DTL).
Đã đánh giá được hoạt tính miễn dịch của kháng nguyên E2 tái tổ hợp và vai trò
tiềm năng của interferon alpha trong đáp ứng miễn dịch tạo bởi kháng nguyên E2 tái tổ
hợp, trong đó kháng nguyên protein E2 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch trung hòa
với vi rút DTL và interferon alpha làm tăng đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm
protein tái tổ hợp protein E2.

xii


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Xengphavone KHONMANY
Thesis title: Study on Protein E2 expression of classical swine fever virus by Baculovirus
system.
Major: Veterinary Medicine

Code: 8640101

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
The objective of the study was to study the protein E2 expression of classical

swine fever virus using insect cell as a diagnostic and bio-material for the prevention of
classical swine fever in Vietnam.
Material and Research Methods
Research location: Department of Biochemistry - Immunology, National Institute
of Veterinary Medicine (Vietnam).
Flow cell types: PK15a, insect cells: SF21AE and TN5. Classical swine fever
(CSF) virus.
Environment for cell culture: DMEM environment, EDTA tripsin, calf fetal serum,
PBS (Phosphate Buffer saline), antibiotic resistant fungus Gibco, distilled water 2 times.
Materials, chemicals, bio-products used in RT-PCR reaction: Trizol Chloroform,
ISO-Propanol, 100% Ethanol and components in cDNA and PCR synthesis: Nucleasefree water, Random Primer, Ribonucleic Acid (RNA) , First strand buffer, dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Reverse Transcriptase, MgCl2, PCR buffer 10x, Taq
polymerase (Promega), Reverse Primer R2, Forward Primer F2.
Chemicals used in electrophoresis: Agarose, TAE, loading dye, DNA marker,
Etidium Bromide (of Sigma, Cat. No H5041).
Materials used for cloning and expression of recombinant protein by Baculovirus
system.
Machine, equipment: Sterile implant chamber, analytical balance, autoclave, oven,
warm cabinet 370C with 5% CO2, 270C incubator, inverted microscope, 40C
refrigerator, refrigerator -300C, refrigerator - 800C, liquid nitrogen cylinders,
centrifuges, inverted microscopes, 0.45µm filter membranes, vontex, electronic pH
meter, magnetic stirrer, PCR machine, electrophoresis system, electrophoresis unit,
scanner Gel image, SPD 1010 Concentrator, Ultrasound machine.

xiii


Other materials: T25, T75, T150 culture bottle, 96 well culture dish, 15ml
centrifuge tube, 50 ml of Corning, Eppendorf 1.5ml, Eppendorf 2.0ml, 1.5ml PCR tube;
0.5ml; 0.2ml, Pipette and tip are 1000µl, 200 µl, 100µl, 10µl, 2µl (tip free RNase),

plastic trough, rack, gloves, mask, alcoholic disinfection ... and machines, equipment
other in the laboratory.
Research content
- Multiplication of CSF virus, checking the virus characteristics of the original strain.
- Design primer specific gene E2 of CSF virus, E2 gene amplification, DNA
purification.
- Generating E2 encoding gene line in pFastBac cloning vector, checking
gene sequence.
- Create bacmid with E2 Protein of CSF virus.
- Transfer bacmid into SF21AE insect cells, creating recombinant Baculovirus
with protein E2.
- Evaluate the biological activity of recombinant E2 protein by Baculovirus
expression system
Methods
In order to conduct research and to carry out the contents of the project, we
have used a combination of modern and regular methods of research in the field of
Veterinary Medicine:
- CSF virus strain, test the virus characteristics of the original strain.
- Protein E2 design of classical swine fever virus, protein E2 amplification, DNA
purification.
- Creates an E2 encoding protein in the pFastBac splitter vector, which checks for
sequences of expression genomes.
- Creates a bacmid carrying the protein E2 of the classical swine fever virus.
- Bacitline transfer into SF21AE insect cells, recombinant Baculovirus carrying
the protein E2.
- Evaluation of the biological activity of recombinant protein E2 by Baculovirus
expression system
Main findings and conclusions
From the research, we have made some conclusions as follows:
In this study, we have successfully established virus neutralization method and

successfully applied VNT procedure with field serum samples. Conducted E2 protein

xiv


recombination of swine cholera virus by Baculovirus expression system on insect cells.
VN91 virus strain isolated in Vietnam is used as a template to recombine protein E2.
The whole sequence of the VN91 virus genome was published in 2018 (GenBank:
LC374604). The study results showed that the recombinant E2 protein of swine cholera
virus has natural biological activity, was identified by antibodies against swine cholera
virus. At the same time, the results also showed that the recombinant E2 antigen is a
potential candidate to develop a new generation vaccine for swine cholera in Vietnam.
Successful application of Baculovirus expression system to recombine E2 protein
of CSF virus isolated in Vietnam. Recombinant E2 protein in this study has natural
biological activity (identified by antibody against CSF virus).
The immunological activity of the recombinant E2 antigen and the potential role
of interferon alpha in the immune response generated by recombinant E2 antigen has
been assessed, in which E2 protein antigen has the ability to produce immunity
response. Neutralization with CSF virus and interferon alpha increases the immune
response of pigs injected with protein recombinant protein E2.

xv


PHẦN I1 MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ngày nay, với những mơ hình chăn ni quy mơ cơng nghiệp ngày càng
phát triển thì kéo theo đó dịch bệnh ngày càng trở nên phức tạp. Trong đó, bệnh
Dịch tả lợn (DTL) cổ điển (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên đàn lợn bởi sự lây lan mạnh, tỷ lệ chết cao

(85-100%) cho mọi lứa tuổi và gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế lớn nhất
cho ngành chăn nuôi heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung.
Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp
châu Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh toán triệt để trước đó.
Dịch tả lợn là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa
những heo sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những
nguyên nhân khác…Tác nhân gây bệnh là một vi rút thuộc chi Pestivirus, họ
Flaviviridae. Vi rút này có tính kháng nguyên chung với vi rút gây bệnh tiêu
chảy ở bò (BVDV- Bovine viral diarrhoea virus) và vi rút bệnh biên giới ở cừu
(BDV- border disease virus).
Trong công tác chẩn đốn hay phịng và trị bệnh, các phương pháp truyền
thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không
thể khắc phục và không thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng
ngày càng khó kiểm sốt. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng
khoảng vài thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành
tựu to lớn, đã, đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống. Trong thú y, sinh
học phân tử với trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm
trong chẩn đốn, phịng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có
dịch tả - một trong 4 bệnh “đỏ” của ngành chăn ni Việt Nam.
Để phân tích chính xác vi rút gây bệnh DTL với những vi rút khác cùng chi
Pestivirus như BVDV, BDV..., kỹ thuật RT - PCR trở nên hữu ích với những
đoạn gene như 5’NTR, E2, NS5B trong việc phân biệt chủng vi rút DTL và tổng
kết sự phân biệt chủng vi rút DTL ở nhiều nước trên thế giới kể cả châu Á; kết
quả cho thấy mối liên giữa các chủng ở một số nước. Trong những năm gần đây,
ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về vi rút DTL của các tác giả, tuy nhiên
chưa có nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như
NS5B, 5’NTR của những vi rút phân lập được từ các ổ dịch. Protein E2 là một

1

trong những gen của bộ gen vi rút DTL cổ điển được sử dụng nhiều trong những
nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút. Vì vậy việc thực hiện đề tài “
Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút Dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống
Baculovirus ” nhằm ứng dụng vào cơng tác chẩn đốn bệnh và tạo tiền đề cho
những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền vi rút Dịch tả lợn sau này.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn
cổ điển sử dụng tế bào côn trùng làm sinh phẩm dùng trong chẩn đoán và nguyên
liệu tiến tới sản xuất vắc xin phòng bệnh Dịch tả lợn cổ điển tại Việt Nam.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Protein E2 của vi rút DTL cổ điển phân lập tại Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2018 tới tháng 2/2019.
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Bộ mơn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y quốc gia (Việt Nam).
1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên
cứu về bệnh dịch tả ở lợn trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y;
là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ
sở về bệnh dịch tả lợn.
1.5. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
Nghiên cứu sử dụng phương pháp tái tổ hợp protein sử dụng hệ thống biểu
hiện Baculovirus của hãng Invitrogen. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái
tổ hợp bằng phương pháp IPMA trên tế bào côn trùng TN5 và phương pháp lai
Western Blot. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho xác định
kháng nguyên tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện Baculovirus vẫn giữ được
những đặc tính kháng nguyên trong tự nhiên mang hoạt tính sinh học và khả
năng tạo đáp ứng miễn dịch cao cho vật chủ.

2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT DỊCH TẢ LỢN (DTL)
2.1.1. Lịch sử căn bệnh DTL ở thế giới
Bệnh Dịch tả lợn (DTL) được đưa vào danh sách loại A của Tổ chức Thú y
Thế giới (OIE) như 1 bệnh truyền lây mạnh và gây thiệt hại kinh tế cho ngành
chăn nuôi lợn của thế giới (Moennig Floegel-Niesmann et al. 2003). Những
nghiên cứu trước đây cho thấy bệnh lây lan chủ yếu qua đường mũi và miệng.
Ngoài ra, vi rút dịch tả lợn cũng bị truyền lây qua tinh dịch hay thức ăn tạp nhiễm
(Floegel Wehrend et al. 2000).
Quá trình phát triển của bệnh DTL khá phức tạp và diễn biến dưới nhiều thể
bệnh khác nhau, tùy thuộc vào độc lực của vi rút, sự tương tác giữa vi rút và cơ thể
vật chủ (Paton and Greiser-Wilke 2003). Nhìn chung, các thể bệnh có thể được phân
loại như sau: Nhiễm sau khi sinh (post-natal infections): bao gồm thể quá cấp, cấp
tính và á cấp tính; Nhiễm qua nhau thai (trans-placental infections); Nhiễm mạn tính
(persistent infections) (Koenen Van Caenegem et al. 1996; Dũng 1999).
Năm 1810 bệnh DTL được (Hanson 1957) mô tả lần đầu ở Tennessce. Đến
năm 1833, bệnh DTL được thông báo đầu tiên ở Ohio (Bắc Mỹ), bệnh lan ra cả
nước Mỹ nhất là vùng Cornbert, dịch bệnh diễn ra ở Pháp năm 1862, ở Đức 1893
(Dahle and Liess 1992) và sau đó bệnh lan ra khắp Châu Mỹ, Châu Âu và Châu
Á (Dũng 1999; Paton and Greiser-Wilke 2003).
Theo (Fuchs 1968) bệnh xuất hiện đầu tiên ở Anh vào năm 1862, sau đó lây
lan sang các nước châu Âu khác là Đan Mạch, Thụy Điển vào năm 1887. Các
nhà khoa học Mỹ cho rằng bệnh xuất phát từ châu Âu và lan sang khắp các nước
trên thế giới, ở Nam Mỹ năm 1899, Nam Phi năm 1900.
Năm 1978 bệnh hoàn toàn bị khống chế ở Bắc Mỹ và sau đó cũng đã được
thanh tốn ở Úc và toàn bộ các nước ở Tây Âu (Paton and Greiser-Wilke 2003;
Singh and Rajak 2017). Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong cơng tác kiểm sốt dịch
bệnh, song bệnh DTL vẫn còn xuất hiện ở một số nước thành viên Châu Âu và gây

thiệt hại nặng về kinh tế. Cụ thể: ở Hà Lan, chi phí trực tiếp để khống chế bệnh DTL
lên tới 93 triệu USD năm 1983 - 1985. Nhiều ổ dịch nghiêm trọng đã xảy ra ở Bỉ,
Đức năm 1994, và Pháp năm 1997 (Moennig 2000). Hơn nữa bệnh DTL vẫn còn là
vấn nạn và lây lan mạnh mẽ ở Nam và Trung Mỹ, vùng Caribbean, Châu Á và Đông
Âu (Moennig 2000, Moennig, Floegel-Niesmann et al. 2003). Hiện nay, tuy dịch đã

3


được khống chế, nhưng bệnh vẫn xảy ra lẻ tẻ như ở Hà Lan năm 1997–1998
(Crauwels et al., 2003), và vi rút DTL vẫn lưu hành tại một số nước ở châu Âu
(Blome et al., 2010; Bhaskar et al., 2015).

Hình 2.1. Bản đồ tình trạng bệnh DTL của các nước thành viên của tổ chức
Thú y thế giới cập nhật lần cuối vào tháng 9 năm 2018
Nguồn />
2.1.2. Lịch sử căn bệnh DTL tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1923 - 1924 bởi
Houdener. Từ đó đến nay vẫn cịn tồn tại phổ biến và luôn là mối đe doạ nghiêm
trọng đối với ngành chăn nuôi lợn nước ta (Dat et al., 1985; Dũng 1999).
Năm 1960 bệnh xảy ra ở Nghệ An, Phú Thọ. Năm 1968 có 481 ổ dịch được
phát hiện ở miền bắc, tiếp đó năm 1971 bệnh DTL đã xảy ra ở 11 trại lợn xung
quanh Sài Gòn. Năm 1974 xảy ra ở 17 tỉnh thành phía bắc làm thiệt hại hơn 4
vạn con lợn. Bệnh đã lây lan sang các tỉnh ở Nam Bộ năm 1981, Thừa Thiên Huế
năm 1990 (Dũng 1999; Duyên Khuyên và cs.,2000).
Các tỉnh thuộc Trung Trung Bộ dịch xảy ra tương đối rộng vào các năm 1976 1978: năm 1976 có 17 ổ dịch, năm 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ dịch.

4

Từ những năm 1980 trở lại đây, theo chương trình quốc gia phịng chống
các bệnh truyền nhiễm quan trọng nói chung và bệnh DTL nói riêng trên đàn lợn
bằng việc sử dụng vắc xin đã thu được những thành quả nhất định, do đó đã phần
nào khống chế được dịch bệnh. Mặc dù vậy bệnh DTL vẫn xem là một trong
những bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa tiềm ẩn đối với ngành chăn nuôi ở nước ta.
Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi (thể hiện
rõ ở miền Bắc) và do biến động số lượng của đàn lợn trong năm nên bệnh có lúc
tăng lúc giảm (Bùi, 2001).
Việc tiêm phịng theo mùa vụ và tiêm phịng bổ sung thường xun góp
phần ổn định và hạn chế sự lây lan của dịch, nhưng trong sản xuất thực tế vì
nhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, do đó bệnh DTL
vẫn xảy ra vào các tháng trong năm. Lợn bệnh thường thể hiện ở thể mạn tính và
các trường hợp khác là do nhiễm vi rút khi sơ sinh, bệnh có thể kéo dài và là một
trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con (Nguyễn Hồ và cs. 2002;
Nguyễn Trần, 2005; Phạm 2005).
2.1.3. Cấu trúc của vi rút DTL
Những mô tả đầu tiên về vi rút gây bệnh DTL đã chỉ ra rằng vi rút DTL
thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. vi rút DTL có quan hệ mật thiết và có
chung tính kháng ngun với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV) và vi rút
gây bệnh biên giới ở cừu (BDV), cả hai loại vi rút này đều có khả năng gây bệnh
tiêu chảy trên lợn. Vi rút gây bệnh DTL là thuộc loại RNA vi rút nhỏ một sợi và
có vỏ bọc ngồi là lipoprotein, đường kính 40 - 50nm, khác hẳn với DNA vi rút
lớn gây bệnh DTL châu phi (African swine fever - ASF), mặc dù cả hai loại vi
rút này đều gây những triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tương tự nhau (Meyers,
Rümenapf et al., 1989; Hoffmann Beer et al., 2005; Leifer, Everett et al., 2010).
Về mặt cấu trúc, bộ gen của vi rút DTL chỉ gồm một khung đọc mở đơn lớn
(open reading frame - ORF) và có chiều dài khoảng 12,3 kb (Meyers Thiel et al.,
1996). Dự vào phân tích trình tự tồn bộ genome của vi rút DTL, các nhà khoa học
đã chia vi rút DTL làm 3 nhóm chính và 4 phân nhóm phụ, bao gồm: 1.1, 1.2, 1.3;
2.1, 2.2, 2.3; 3.1, 3.2, 3.3, và 3.4. Nhóm 1 là nhóm có lịch sử lâu đời nhất và gây

bệnh phổ biến ở châu Âu trong giai đoạn 1920 - 1970; nhóm 2 là tác nhân gây ra
những ổ dịch vào thập niên 90 (Paton McGoldrick et al., 2000). Nhiều nghiên cứu
đã chỉ ra rằng các ổ dịch ở Hà Lan và Anh gây ra bởi vi rút DTL thuộc genotype 2.1
(Oleksiewicz Rasmussen et al., 2003; Sarma Mishra et al., 2011; Postel Schmeiser

5


et al., 2012). Vi rút DTL thuộc nhóm 3 là phổ biến nhất ở Châu Á (Sakoda Ozawa et
al., 1999; Sabogal Mogollón et al., 2006; Sun Yin et al., 2013).
Những nghiên cứu về cấu trúc của vi rút DTL cho thấy khung đọc mở của vi
rút này mã hóa cho một glycoprotein có kích thước khoảng 3900 amino axit, gồm 4
protein cấu trúc (C, Erns, E1, và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (Npro, NS2, NS3,
NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Lowings Ibata et al., 1996; Meyers Thiel et al.,
1996; Crauwels Nielen et al., 2003; Deng Huang et al., 2005; Desai Sharma et al.,
2010; Sun Yin et al., 2013). Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của vi rút
sẽ được xử lý thành những protein vi rút riêng biệt. Protein đầu tiên mã hố là Npro
một protein khơng cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C. Peptidase ký chủ
phân cắt những vị trí C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt khơng hồn
tồn ở vị trí E2/p7. NS2 - 3 được phân cắt bởi autoprotease NS2. Sự phân cắt của
polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme
protease serine NS3 - 4A (Lowings Ibata et al.,1996).
Các protein cấu trúc đóng vai trị quan trọng trong khả năng tạo đáp ứng
miễn dịch của vi rút DTL, trong đó hai protein cấu trúc vỏ, Erns và E2, là những
protein có khả năng sinh miễn dịch mạnh nhất (Paton and Greiser-Wilke 2003).

Hình 2.2. Cấu trúc bộ gen Flavivirus
Nguồn: />
6

2.1.4. Sức đề kháng của vi rút DTL
Sức đề kháng của vi rút DTL phụ thuộc vào trạng thái vật lý của chất chứa
vi rút, vi rút trong dịch nuôi cấy tế bào sẽ bị vô hoạt ở 600C trong 10 phút, vi rút
có thể tồn tại 27 ngày ở thịt đông lạnh, 73 ngày ở tuỷ xương và 168 ngày ở thịt
xơng khói. Trong mơi trường thiên nhiên, ở nhiệt độ thấp dưới 100C vi rút sống
và giữ nguyên độc lực gây bệnh hàng tháng. Ở nhiệt độ bình thường 18 - 300C,
chúng có thể sống nhiều tuần, nhưng dưới ánh sáng trực tiếp của mặt trời thì
chúng khơng tồn tại lâu hơn 10 giờ. Trong chuồng và phân, vi rút bị bất hoạt sau
vài ngày. Vi rút dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao trên 750C, bị vô hoạt ở 600C trong
10 phút, 560C trong 1 giờ. Vi rút bị tiêu diệt trong mơi trường có chất làm tan
lipid, có enzyme protease (Dat et al., 1985).
Vi rút DTL bất hoạt ở pH<3 hoặc pH>11, rất nhạy cảm với Ete,
Chloroform, PVP iodine, Benzalkonium, Dezoxicholat Natri, nước vôi 10%,
Formol 1 - 2% Phencol, Hyzol, … nhưng khá bền vững với Trypsin. Thuốc sát
khuẩn hữu hiệu thường dùng hiện nay là PVP.iodine 10%, B.K.Vet, Formol 1,5
2%, Virkon.S .... (Bùi, 2001).
2.2.

BỆNH DỊCH TẢ LỢN

Bệnh DTL là bệnh truyền nhiễm của loài lợn, có tốc độ lây lan nhanh và
thường ghép với bệnh khác như phó thương hàn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn
hoặc bệnh do Mycoplasma (DUNNE 1975, Wentink and Terpstra 1999). Trước
đây gọi là hog cholera, là do vi rút DTL gây ra và có thể dẫn đến bệnh suất và tử
vong cao ở lợn. Bệnh này được báo cáo cho Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) và
phát hiện virus có thể làm giảm đáng kể xuất khẩu thịt lợn. (Paton and GreiserWilke 2003).
2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh DTL
Bệnh do một loại vi rút có cấu trúc RNA thuộc chi Pestivirus, họ
Flaviviridae gây ra (Wikipidia 2018). Vi rút tồn tại lâu ở ngồi mơi trường, có

thể sống sót vài ngày trong phân lợn, vài tháng đến vài năm trong thịt đơng lạnh.
Tuy nhiên, đây là loại vi rút có sức đề kháng yếu, dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao và
các chất sát trùng thông thường như xút (NaOH) 2%, nước vơi 5%...
2.2.2. Lồi mắc
Vi rút DTL có mặt hầu khắp các quốc gia trên thế giới và lợn là ký chủ duy
nhất (bao gồm cả lợn nhà và lợn rừng). Bệnh có thể lây từ lợn rừng sang lợn nhà

7


hoặc ngược lại. Các loài động vật khác và người không mắc bệnh này (Dat và cs.
1985; Nguyễn Hồ và cs. 2002; Nguyễn và Trần 2005, Phạm 2005). Nhiều tác giả
đã gây bệnh cho chuột nhắt, gà, ngựa, trâu nhưng bệnh khơng biểu hiện trên
những lồi vật thí nghiệm này. Năm 1941, Tenbroek thông báo về việc nuôi cấy
thành công vi rút DTL trong mơi trường tế bào dịch hồn lợn trong dung dịch
Tyrode (Bùi, 2001). Năm 1950, Corone và Albis thực hiện thí nghiệm tiêm
truyền vi rút DTL vào phơi trứng vịt và đã thích ứng với vi rút DTL trên phôi vịt.
Sau đời thứ 8 cấy truyền qua phôi vi rút đã mất độc lực với lợn nhưng gây được
miễn dịch cho lợn. Fonanelli và cộng sự đã thử tiêm cho phôi gà nhưng không
thành công (Bùi, 2001).
2.2.3. Phương thức truyền lây
Nguồn lây truyền mầm bệnh là các chất bài tiết, dịch tiết, máu, hạch lâm ba,
lách của lợn bệnh chứa vi rút. Những lợn khỏi bệnh sau 2 tháng vẫn bài thải mầm
bệnh ra ngồi mơi trường làm nguồn lây nhiễm cho cá thể khác. Những lợn con
bị nhiễm bệnh này sẽ thải ra một lượng lớn vi rút, và các triệu chứng lâm sàng có
thể xuất hiện sau một vài tháng. Do đó, chúng bị lây nhiễm trong suốt đời sống
và sẽ không dễ để phát hiện (Van Oirschot, 2003).
Theo các nghiên cứu cho thấy vi rút lây truyền theo chiều ngang và theo
chiều dọc: Lây truyền vi rút theo chiều ngang trực tiếp giữa các con ốm với con
khỏe, hoặc lây gián tiếp qua các chất bài tiết, qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn

nuôi, phương tiện vận chuyển hay do tiếp xúc với các động vật mang mầm bệnh.
Lây truyền vi rút theo chiều dọc từ mầm bệnh trong các phôi (Van Oirschot, 2003).
Lây truyền theo chiều dọc thường dẫn đến chết non, hoặc những con lợn con sinh ra
bị bệnh, do lợn mẹ mang bệnh (carrier sows) thường sinh ra các con lợn con bị
nhiễm bệnh (Paton and Greiser-Wilke, 2003; Van Oirschot, 2003).
2.2.4. Lứa tuổi mắc bệnh
Bệnh thường xảy ra ở mọi lứa tuổi song tập trung nhiều nhất ở lợn con theo
mẹ và lợn mới cai sữa. Trong những năm gần đây việc tiêm phòng đã được chú ý
do vậy tuổi mắc phụ thuộc nhiều vào sức đề kháng và tình trạng miễn dịch của
đàn lợn. Lợn đực và lợn nái khơng biểu hiện triệu chứng lâm sang nhưng có tỷ lệ
mang trùng vi rút DTL (Dat et al., 1985).
Theo Bùi Quang Anh và cộng sự, lợn từ 2 - 6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh
DTL cao nhất trong tổng số lợn mắc bệnh, lợn con theo mẹ 19,42%; lợn trên 6

8


tháng tuổi 12,08%; còn lợn nái và lợn đực tỷ lệ mắc bệnh DTL thấp nhất
0,212,46% nhưng lại là nguồn mang trùng và lây lan dịch bệnh (Bùi, 2001).
2.2.5. Chất chứa của và độc lực của vi rút
Trong cơ thể, vi rút hấp thu mạnh trên bạch cầu nên máu có độc lực sớm
nhất; các chất bài xuất như nước dãi, nước mũi, nước mắt, nước tiểu, phân, các
phủ tạng đều chứa vi rút; hạch lâm ba và lách chứa nhiều vi rút nhất. Các chủng
vi rút có độc lực cao thường gây bệnh thể cấp tính, các chủng có độc lực thấp
thường gây ra thể á cấp tính hoặc thể khơng điển hình (Mesplède and Albina
1997). Các chủng vi rút có độc tính khác nhau thì có tốc độ lây lan bệnh khác
nhau; những chủng vi rút cường độc lây lan nhanh hơn và gây ra tỷ lệ chết cao
hơn so với chủng độc lực thấp (Terpstra 1991).
Những lợn bị nhiễm bệnh có thể thải vi rút trước khi phát bệnh và tiếp tục
thải vi rút trong quá trình bệnh, sự thải vi rút chỉ dừng lại khi kháng thể được

sinh ra. Vì vậy những lợn bị nhiễm vi rút có độc lực cao có thể thải vi rút với số
lượng lớn trong thời gian 10 -20 ngày, những lợn bị bệnh thể mãn tính thải vi rút
liên tục hoặc từng đợt cho đến khi chết.
2.2.6. Triệu chứng
Thời gian nung bệnh từ 3 - 7 ngày và tuỳ theo độc lực của vi rút, lứa tưổi,
giống, thể trạng, trạng thái miễn dịch mà bệnh có thể xuất hiện ở một trong 4 thể
với các triệu chứng như sau:
2.2.6.1. Thể q cấp tính
Cịn gọi là bệnh DTL trắng, thường xuất hiện ở đầu ổ dịch, lợn con mẫn
cảm với thể này hơn lợn trưởng thành. Con vật ủ rủ cao độ, sốt kịch liệt, chết
nhanh khi chưa xuất hiện triệu chứng bệnh tích đặc trưng, con vật giãy dụa rồi
chết nhanh trong vòng 24 - 48 giờ, tỷ lệ chết tới 100%.
2.2.6.2. Thể cấp tính
Thể này thường gặp, thời gian nung bệnh từ 2 - 4 ngày. Lợn có các triệu
chứng chung: ủ rũ, kém ăn, rồi bỏ ăn, sốt cao 41 – 42 °C kéo dài đến lúc gần
chết, lợn con thường nằm chồng đống lên nhau ở góc chuồng.
Trong quá trình nghiên cứu (Dat và Lien 1985) đã quan sát được triệu
chứng lâm sàng của lợn bị bệnh DTL ở những lứa tuổi khác nhau như sau:
+ Ở lợn con theo mẹ dưới 1 tháng tuổi: gầy yếu, run rẩy, sốt cao 41,5 °C
phân trắng không tiêu, mắt có dử và chảy nước mắt, có con ỉa phân loãng màu

9