Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP PCR và thử nghiệm phát hiện nhiễm một số nấm ở bệnh nhân viêm não màng não

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Mai Thị Minh Ngọc

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT
RFLP-PCR VÀ THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM MỘT
SỐ NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM NÃO, MÀNG NÃO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Mai Thị Minh Ngọc

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT
RFLP-PCR VÀ THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN NHIỄM MỘT
SỐ NẤM Ở BỆNH NHÂN VIÊM NÃO, MÀNG NÃO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Nguyễn Duy Bắc

2. GS.TS. Đặng Thị Thu

HÀ NỘI – 2014


LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là sản phẩm khoa học của thuộc đề tài “Nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện nhiễm Candida và Cryptococcus
neoformans trong dịch não tủy” ”, mã số: 2013.75.59 do Học viện Quân y chủ
trì.
Là người tham gia thực hiện các nội dung thuộc đề tài được trình bày
trong luận văn này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong
các luận văn, luận án nào và đã được chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào
luận văn này.

Hà Nội, ngày 26 tháng5 năm 2014
Học viên

Mai Thị Minh Ngọc


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn này,
tơi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị,
các bạn đồng nghiệp và cơ quan.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.
Nguyễn Duy Bắc – Phó trưởng phịng Đào tạo, Học viện Quân y và GS.TS.
Đặng Thị Thu, Ngun Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học và Công

nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn,
chỉ bảo tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu để tơi có thể hoàn thành
được luận văn này.
Chân thành cảm ơn ThS.BS. Đỗ Ngọc Ánh cùng các cán bộ, nhân viên
của Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Bộ môn ký sinh trùng - Học
viện Quân y đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình
nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học
và Công nghệ thực phẩm, Viện Đào tạo Sau đại học – Trường Đại học Bách
Khoa Hà Nội đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học
tập và nghiên cứu.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu Viện Đại học
Mở Hà Nội, Tập thể cán bộ Phịng Khảo thí & Đảm bảo chất lượng - Viện
Đại học Mở Hà Nội đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
q trình cơng tác và thực hiện nghiên cứu để hồn thành luận văn.
Cuối cùng tơi xin cảm ơn bố mẹ, chồng, các con, anh chị em, người
thân đã động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và
nghiên cứu.
Học viên

Mai Thị Minh Ngọc


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1.Bệnh viêm não, màng não .................................................................................. 3
1.2.Đặc điểm sinh học của một số loài nấm men...................................................... 7
1.2.1.Nấm Cr. neoformans ................................................................................. 7
1.2.2.Nấm Candida .......................................................................................... 10

1.3.Các kỹ thuật chẩn đoán nấm gây viêm não, màng não ................................... 122
1.3.1.Soi tươi .................................................................................................... 12
1.3.2.Nuôi cấy .................................................................................................. 13
1.3.3.Chẩn đoán huyết thanh .......................................................................... 144
1.3.4.Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử ............................................. 155
1.3.4.1. Kỹ thuật PCR ................................................................................. 15
1.3.4.2. Kỹ thuật PCR ngược (RT-PCR)...................................................... 19
1.3.4.3. Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) ................................................... 19
1.3.4.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) ........................................... 19
1.3.4.5. Kỹ thuật RAPD .............................................................................. 20
1.3.4.6. Kỹ thuật AFLP ............................................................................... 20
1.3.4.7. Kỹ thuật RFLP ............................................................................... 20
1.3.4.8. Kỹ thuật RFLP-PCR ...................................................................... 21
1.3.5. Kỹ thuật giải trình tự gen và các yếu tố ảnh hưởng................................ 24
1.3.5.1.Sơ lược về kỹ thuật giải trình tự ...................................................... 24
1.3.5.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng đọc trình tự.......................... 25
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 26
2.1.Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................... 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 27
2.2.1. Thu thập và phân lập mẫu nấm sử dụng trong nghiên cứu ....................... 27
2.2.1.1. Kỹ thuật nuôi cấy ............................................................................ 27
2.2.1.2. Phương pháp soi tươi và nhuộm ..................................................... 27
2.2.1.3. Thử nghiệm huyết thanh.................................................................. 28


2.2.2. Tách DNA và chạy phản ứng PCR.......................................................... 28
2.2.2.1. Tách DNA ....................................................................................... 28
2.2.2.2. Chạy phản ứng PCR ....................................................................... 30
2.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng enzyme MspI .......................................... 30
2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt giới hạn ...................................... 31

2.2.5. Điện di kiểm tra ngưỡng phát hiện .......................................................... 31
2.2.6. Điện di kiểm tra tính đặc hiệu ................................................................. 31
2.2.7. Giải trình tự gen đoạn gen thu được từ phản ứng PCR ............................ 31
2.3. Phân tích và xử lý số liệu nghiên cứu .............................................................. 33
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................................... 34
3.1. Kết quả xây dựng quy trình RFLP-PCR phát hiện nhiễm nấm Candida (C.
albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis) và Cryptococcus
neoformans ..................................................................................................... 34
3.1.1.Nuôi cấy và tách chiết DNA từ các chủng nấm chuẩn .............................. 34
3.1.2.Tối ưu hóa quy trình phản ứng PCR......................................................... 36
3.1.2.1.Tối ưu nồng độ Mg2+ ....................................................................... 36
3.1.2.2.Kết quả tối ưu nồng độ các dNTP .................................................... 37
3.1.2.3.Kết quả tối ưu nồng độ và nhiệt độ gắn mồi ..................................... 38
3.1.3.Kết quả cắt giới hạn bằng enzym MspI .................................................... 40
3.1.4.Kết quả thử ngưỡng phát hiện .................................................................. 41
3.1.5.Kết quả thử tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1 và ITS4 ............................... 44
3.2.Kết quả giám định lại loài dựa vào phân tích trình tự gen ................................ 45
3.2.1.Kết quả giải trình tự các chủng nấm chuẩn ......................................... 45
3.2.2.Kết quả xác định lồi dựa vào trình tự ................................................ 48
3.3. Bước đầu thử nghiệm kỹ thuật RFLP-PCR trên nấm Candida và Cr.neoformans
từ mẫu bệnh phẩm người ................................................................................ 51
3.3.1.Phân lập các chủng nấm Candida và Cr. neoformans từ mẫu bệnh phẩm
người ...................................................................................................... 51
3.3.2.Kết quả định danh các chủng nấm bằng kỹ thuật soi tươi và nuôi cấy ...... 52
3.3.3.Kết quả đánh giá khả năng phát hiện nhiễm nấm Candida và
Cr.neoformans bằng kỹ thuật RFLP-PCR xây dựng được. ...................... 53


3.3.4. Kết quả kiểm tra bằng giải trình tự gen ................................................... 55
3.4. Kết quả chẩn đoán phát hiện nấm trong dịch não tủy của bệnh nhân viêm não,

màng não bằng kỹ thuật RFLP-PCR ............................................................. 58
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 61
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 63
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 68
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A

: Adenine

AIDS

: Acquired Immunodeficiency Syndrome

C

: Cytosine

CS

: Cộng sự

CFU

: Colony Forming Unit

DNA

: DeoxyriboNucleic Acid

dNTP

: Deoxynucleotide triphotphat

ETDA

: EthyleneDiamineTetraacetic Acid

EtBr

: Ethidium bromide

G

: Guanine

HIV

: Human immunodeficiency virus

ITS

: Internal Transcribed Spacer

MRI

: Magnetic Resonance Imaging

OD

: Optical density

PCR

: Polymerase chain reaction

RFLP

: Restriction fragment length polymorphism

RNA

: RiboNucleic Acid

T

: Thymine

UI

: Unit International


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả nồng độ dịch treo và nồng độ DNA thu được từ các chủng nấm

chuẩn........................................................................................................35
Bảng 3.2: Kết quả ngưỡng phát hiện theo nồng độ dịch nấm…………………...…..42
Bảng 3.3: Kết quả ngưỡng phát hiện theo nồng độ DNA……………..…………….43
Bảng 3.4: Kết quả thử tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1 và ITS4 đối với DNA của các
vi khuẩn, virus HBV và của người…………………….………………..44
Bảng 3.5: Trình tự đoạn gen thu được từ các chủng nấm…………………..…….…46
Bảng 3.6: Tỷ lệ tương đồng của trình tự gen thu được với ngân hàng gen..............48
Bảng 3.7. Phân loại mẫu bệnh phẩm theo giới tính và vị trí phân lập......................51
Bảng 3.8: Kết quả định danh nấm Candida và Cr. neoformans phân lập ở Việt Nam
bằng hình thái và thử nghiệm huyết thanh..................................................52
Bảng 3.9: Kết quả định danh nấm Candida và Cr. neoformans bằng kỹ thuật RFLPPCR .............................................................................................................54
Bảng 3.10: Sự phù hợp giữa kết quả định lồi bằng kỹ thuật RFLP-PCR và bằng giải
trình tự của một số mẫu vi nấm...................................................................55
Bảng 3.11. Kết quả giải trình tự nucleotide của chủng nấm N19, N55.......................57
Bảng 3.12. Kết quả chẩn đoán phát hiện nấm trong dịch não tủy của bệnh nhân viêm
não, màng não.............................................................................................59


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc trong mơi trường Sabouraud và tế bào nấm trong tiêu
bản soi tươi, thử nghiệm huyết thanh và nhuộm mực tàu ......................... 34
Hình 3.2. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+...................................................................37
Hình 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP ................................................................38
Hình 3.4. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi đối với 2 chủng nấm Cr. neoformans
(A) và C. albicans (B). ...............................................................................39
Hình 3.5. Kết quả phản ứng PCR ở nhiệt độ gắn mồi 550C của 6 chủng nấm...…..40
Hình 3.6. Sản phẩm PCR và cắt giới hạn bằng enzym MspI của các chủng nấm
Candida và Cr. neoformans……...……………………………..………..41
Hình 3.7. Kết quả ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR của 6 chủng nấm……...…43

Hình 3.8. Kết quả thử tính đặc hiệu với cặp mồi ITS1 và ITS4………….…….……45
Hình 3.9. Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide của chủng C. albicans với
ngân hàng gen………………………………………………….……..…48
Hình 3.10. Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide của chủng C. parapsilosis
với ngân hàng gen………………………………………………………49
Hình 3.11. Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide của chủng C. tropicalis
với ngân hàng gen………………………………………………………49
Hình 3.12. Minh họa so sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide của chủng Cr. neoformans
với ngân hàng gen………………………………………...…………….50
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình kỹ thuật RFLP-PCR phát hiện nấm Candida và
Cr.neoformans ở bệnh nhân viêm não, màng não…………….......……51
Hình 3.14. Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng Enzym MspI của các chủng nấm
được phân lập từ mẫu bệnh phẩm người....................................................56


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh, các dẫn chất steroid, thuốc
chống ung thư đang ngày càng trở nên phổ biến. Bên cạnh đó, các bệnh lý gây suy
giảm miễn dịch, bệnh lý ác tính có xu hướng gia tăng do nhiều nguyên nhân khác
nhau. Các yếu tố này tạo điều kiện thuận lợi cho nấm ký sinh gây bệnh ở người, đặc
biệt gây viêm não, màng não.
Ở Việt Nam, việc chẩn đoán nấm chủ yếu dựa vào các kỹ thuật truyền thống
như đặc điểm lâm sàng, soi tươi, xét nghiệm miễn dịch… Các kỹ thuật truyền thống
mặc dù vẫn đem lại hiệu quả chẩn đoán tuy nhiên độ nhạy thấp (soi tươi) hoặc mất
nhiều thời gian (nuôi cấy) và trong nhiều trường hợp chưa đáp ứng được nhu cầu
chẩn đoán bệnh ở lâm sàng. Trong khi đó, các bệnh cấp tính do nấm gây ra có biểu
hiện lâm sàng rất giống với nhiều bệnh do các căn nguyên khác trong khi yêu cầu
chẩn đoán đúng, chẩn đoán sớm là rất cần thiết. Việc chẩn đoán đúng, chẩn đốn
sớm căn ngun gây bệnh khơng chỉ giảm được các biến chứng của bệnh mà cịn
giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân.

Ngày nay, các kỹ thuật về sinh học phân tử ngày càng được sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị các bệnh ở người, trong đó có các bệnh do
nấm. Tuy nhiên, vấn đề chẩn đoán nấm gây bệnh viêm não, màng não bằng sinh
học phân tử hiện chưa được quan tâm nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu áp
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán các bệnh do vi nấm gây ra
trong lâm sàng là hết sức cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn cao. Nhiều kỹ thuật sinh
học phân tử có thể áp dụng trong chẩn đoán vi nấm gây viêm não, màng não là phản
ứng chuỗi polymerase (PCR – Polymerase Chain Reaction), PCR lồng (NestedPCR), PCR đa mồi (Multiplex-PCR), RFLP-PCR (Restriction Fragment Length
Polymorphism -PCR) ... RFLP-PCR là kỹ thuật gồm 2 bước phân tích: nhân đoạn
gen đích bằng phản ứng PCR và cắt giới hạn đoạn gen đích bằng enzyme giới hạn.
Phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, cùng lúc có thể xác định được đồng
thời nhiều vi nấm gây bệnh. Tuy nhiên, để có thể đưa được các kỹ thuật này vào áp
dụng chẩn đoán, việc thiết lập các điều kiện trong qui trình chẩn đốn là rất quan
trọng. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây
1


dựng quy trình kỹ thuật RFLP-PCR và thử nghiệm phát hiện nhiễm một số nấm ở
bệnh nhân viêm não, màng não” với mục tiêu như sau:

1. Xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP-PCR để phát hiện một số loài nấm
thường gặp ở bệnh nhân viêm não, màng não.
2.

Bước đầu thử nghiệm khả năng phát hiện một số loài nấm từ mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân viêm não, màng não bằng kỹ thuật RFLP-PCR.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
1. Xây dựng quy trình kỹ thuật RFLP-PCR để phát hiện nhiễm một số loài nấm
(Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis và

Cryptococcus neoformans) thường xuất hiện ở bệnh nhân viêm não, màng
não (Thiết kế, lựa chọn mồi đặc hiệu của kỹ thuật RFLP-PCR, tối ưu hóa
các điều kiện của quy trình kỹ thuật RFLP-PCR .. ).

2. Phân lập các chủng nấm từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được tạo nguồn
nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu phát hiện các chủng nấm có nguồn
gốc ở Việt Nam.

3. Bước đầu đánh giá thử nghiệm khả năng phát hiện một số loài nấm (C.
albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis và
Cryptococcus neoformans) từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân viêm màng
não, viêm não bằng kỹ thuật RFLP-PCR.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.

Bệnh viêm não, màng não

 Căn nguyên gây viêm não, màng não:
Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng nhu mô não (viêm não), màng
nuôi, màng nhện và dịch não tủy (viêm màng não). Trong viêm não bệnh nhân
thường có biểu hiện đặc trưng là mất nhận thức, cịn trong viêm màng não bệnh
nhân thường có các dấu hiệu kích thích của màng não với các dấu hiệu cứng gáy
hoặc hạn chế vận động cột sống. Tuy nhiên, trên thực tế đơi khi khó phân biệt được
rõ ràng giữa viêm não và viêm màng não vì bệnh nhân thường có dấu hiệu và triệu
chứng của cả viêm não và viêm màng não. Căn nguyên của gây viêm màng não có

thể là vi khuẩn, vi nấm, giun sán hoặc virus.
Các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae và
Neisseria meningitides được cho là những nguyên nhân gây bệnh thường gặp nhất
trong viêm não, màng não trên toàn thế giới. Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác
cũng thường gặp nhưng được xếp đứng sau (Bảng 1.1). Theo nghiên cứu của J.E.
Safdieh và CS (2008) về nguyên nhân gây viêm não, màng não ở bệnh nhân ung thư
cho thấy: 68% các trường hợp mắc bệnh là do các cẩu khuẩn Gram (+), 10% là do
trực khuẩn Gram (+), 14% do trực khuẩn Gram (-), 7% do nấm Cryptococcus và 1%
do nấm Candida alibicans.
 Viêm màng não do nấm:
Mặc dù một số nấm có thể gây viêm não, màng não ở người bình thường
nhưng hầu hết viêm não, màng não gặp ở những người có hệ miễn dịch bị tổn
thương. Các nấm gây viêm não, màng não thường xâm nhập vào cơ thể qua 2 con
đường da và hơ hấp. Một số ít có thể xâm nhập từ đường tiêu hóa. Các dạng tổn
thương não, màng não do nấm có thể là viêm não, viêm màng não cấp và mạn tính,
áp xe não, u dạng hạt, viêm não, đột quỵ… nhưng các dạng tổn thương hay gặp nhất
là viêm não và viêm màng não. Các nấm gây viêm não, màng não thường gặp là
Candida, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus và Penicillium
marneffei.

3


Bảng 1.1: Các nguyên nhân thường gặp gây viêm não, màng não ở người [26]
Mầm
bệnh
Vi
khuẩn

Tên loài

Streptococcus pneumoniae
H. influenzae type B
Neiseria meningitides

Khu vực phân bố

Đối tượng mắc

Trên toàn thế giới
Trên toàn thế giới
-SerogroupA,W-135, C
và X gây dịch ở Châu
Phi.
-Serogoup B, C ở Châu
Âu, Mỹ, Úc và Đơng Á
Đơng Nam Á
Trên tồn thế giới
Trên toàn thế giới
Trên toàn thế giới
Trên toàn thế giới
Trên toàn thế giới
Các nước nhiệt đới
Trên toàn thế giới

Người nhiễm HIV
Trẻ em

Streptococcus suis
Staphylococcus aureus
Streptococcus group B

Listeria monocytogenes
Enterobacteriacae
Salmonella non typhi
Mycobacterium tuberculosis
Cryptococcus neoformans
Nấm
Candida
Penicillum marneffei
Giun sán Angiostrongylus cantonensis, Đông Nam Á
Gnathostoma spinigerum và
Toxocara canis
- Herpes virus
Virus
- Enterovirus
- Japanese Encephalitis

Trẻ sơ sinh
Trẻ sơ sinh, người
cao tuổi và người
suy giảm miễn dịch
Người nhiễm HIV
Người nhiễm HIV,
ung thư, suy giảm
đề kháng…

Hầu hết các nấm gây viêm não, màng não là các nấm gây bệnh khi có điều
kiện thuận lợi (nấm gây bệnh cơ hội). Do đó, ở những người có các yếu tố cơ hội sẽ
tăng khả năng bị viêm não, màng não do vi nấm. Các yếu tố làm tăng khả năng bị
bệnh do nấm bao gồm: tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh, đặc biệt là các kháng
sinh thế hệ mới, kháng sinh chống lao, sử dụng các thuốc dẫn chất steroid trong

điều trị bệnh lý cột sống, các hóa chất và thuốc chống ung thư, người mắc bệnh ung
thư, bệnh nhân HIV/AIDS, bệnh nhân bỏng diện rộng, shock bỏng, tình trạng thiếu
dinh dưỡng, thiếu máu, can thiệp cấy ghép tế bào gốc, bệnh nhân mắc các bệnh mạn
tính… Gần đây, nhiều tác giả cho rằng, việc thực hiện các thủ thuật can thiệp mạch
trong điều trị cũng tạo thuận lợi cho một số nấm xâm nhập gây bệnh nội tạng, nhất
4


là các bệnh nhân tại các khoa điều trị tích cực (ICU), những bệnh nhân di chứng sau
đột quỵ, liệt 2 chi dưới… phải nằm lâu một chỗ (Ulrike Binder và CS., 2011). Tình
trạng viêm não, màng não có thể cịn gặp khi bệnh nhân bị vơ tình đưa nấm vào
màng não do thuốc điều trị bệnh bị nhiễm nấm. Đó là trường hợp bùng phát viêm
não, màng não tại Mỹ xuất hiện từ đầu tháng 10/2011 vừa qua. Các bệnh nhân trong
đợt bùng phát này đều liên quan đến việc tiêm các lọ thuốc Methyprednisolone
acetate có nhiễm các nấm Aspergillus sp. và Exserohilum sp. của Công ty dược
phẩm New England Compounding Center tại Framingham (Mỹ). Vụ việc trên đã
khiến hơn 300 nạn nhân bị viêm não, màng não và hơn 25 người tử vong. Công ty
dược phẩm trên ngay sau đó đã bị đóng cửa và tước giấy phép hoạt động.
Theo Youssuf Gherbawy và CS (2010), nhiễm nấm sâu và nhiễm nấm hệ
thống nói chung là biến chứng nặng, có nguy cơ đe dọa đến tính mạng người bệnh.
Tỷ lệ tử vong do nhiễm nấm sâu và nhiễm nấm hệ thống rất cao. Một thống kê cho
thấy, tỷ lệ nhiễm nấm máu thấp hơn so với các nhiễm khuẩn huyết (nhiễm nấm máu
do Candida chiếm khoảng 10%, Aspergilus spp. chiếm khoảng 5-15% và các nấm
khác khoảng 2%) nhưng tỷ lệ tử vong lại cao hơn. Tỷ lệ tử vong ở người nhiễm nấm
máu trên > 60%, trong khi tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn huyết chỉ 30-50%. Đối với
viêm não, màng não do nấm, mặc dù chưa có con số thống kê cụ thể nhưng từ số
chết và mắc bệnh trong vụ bùng phát viêm não, màng não ở Mỹ trên đây có thể thấy
tỷ lệ chết ở bệnh nhân mắc viêm não, màng não vào khoảng 10%.
Biểu hiện lâm sàng ở những bệnh nhân bị viêm não, màng não do nấm
thường rất đa dạng. Các triệu chứng thường gặp là sốt cao, đau đầu, dấu hiệu cứng

gáy và dấu hiệu Kernig dương tính, buồn nơn và nơn, sợ ánh sáng, giảm trí nhớ,
tăng cảm tồn thân, táo bón… Theo Jeremy N Day (2004), ở bệnh nhân viêm màng
não do nấm Cr. neoformans đau đầu là triệu chứng hay gặp nhất, với trên 75% các
trường hợp, ở cả người nhiễm và không nhiễm HIV. Sốt cũng là các triệu chứng
thường gặp với tỷ lệ > 50% các trường hợp. Cũng theo tác giả này, triệu chứng như
cứng gáy gặp không phổ biến ở bệnh nhân HIV (< 25%) và triệu chứng thần kinh
trung ương chỉ gặp dưới 20%. Trên thực tế lâm sàng, các triệu chứng viêm não,
màng não do vi nấm khơng đặc hiệu, khó phân biệt với các biểu hiện ở bệnh nhân
viêm não, màng não do vi khuẩn, virus và ký sinh trùng. Mặt khác, ổ nguyên phát

5


có thể khơng tìm thấy hoặc khơng rõ ràng… Hơn nữa, các thay đổi về dịch não tủy
của viêm màng não do nấm rất giống so với virus hoặc do các ký sinh trùng (nhưng
có sự khác biệt đáng kể so với viêm màng não do một số vi khuẩn và lao), tổn
thương trên CT, MRI cũng không đặc hiệu. Đó là những lý do làm cho viêm màng
não do nấm rất khó phân biệt với viêm màng não do các nguyên nhân khác.
Tình hình nhiễm nấm ở Việt Nam
Bệnh nhiễm trùng cơ hội là vấn đề quan tâm hàng đầu trong công tác điều trị
bệnh nhân HIV/AIDS. Vi nấm cơ hội là tác nhân khá phổ biến, gây tổn thương ở
nhiều cơ quan nội tạng và ngoài da của bệnh nhân. Ở Việt Nam, bệnh nhiễm vi nấm
rất phổ biến, nhất là khi có đại dịch HIV/AIDS. Bệnh nhiễm nấm chủ yếu trên bệnh
nhân suy giảm miễn dịch, nhất là do HIV/AIDS. Các bệnh nhân không nhiễm
HIV/AIDS chiếm tỷ lệ thấp. Số ca nhiễm vi nấm các loại được phát hiện ngày càng
nhiều, càng đa dạng. Kết quả nghiên cứu tại bệnh viện nhiệt đới: nhiễm vi nấm ở hệ
thần kinh trung ương năm 2003 là 155/376 ca AIDS được chọc dò dịch não tủy
(41.2%), năm 2004 là 203/444 ca AIDS được chọc dò dịch não tủy (45.72%), 8
tháng đầu năm 2005 là 156/320 ca được chọc dò dịch não tủy (48.75%). Nhiễm vi
nấm trong máu năm 2003 là 104/589 ca AIDS được cấy máu (17.65%), năm 2004

là: 165/1012 ca AIDS được cấy máu (16.3%), 8 tháng đầu năm 2005: 113/736 ca
AIDS được cấy máu (15.2%). Nhiễm nấm họng năm 2003 là 42/47 ca (89.36%),
năm 2004 là 73/90 ca (81%), 8 tháng đầu năm 2005 là 50/58 ca (86.2 %). Năm
2005 thực hiện nội soi phế quản trên 100 bệnh nhân HIV/AIDS đầu tiên và lấy dịch
rửa để phân lập vi nấm, có 13 ca nhiễm Penicillium marneffei (13%), 13 ca nhiễm
Candida albicans (13%), 2 ca nhiễm Cryptococcus neoformans (2%). Tình hình
nhiễm vi nấm ngày càng phức tạp địi hỏi phải quan tâm chẩn đốn sớm để có
hướng điều trị thích hợp [11].
 Viêm màng não do nấm Cryptococcus neofomans:
Là loại viêm màng não thường gặp ở bệnh nhân HIV/AIDS, rất hiếm gặp ở
người bình thường. Bệnh diễn biến từ từ; các triệu chứng chính là đau đầu, buồn
nơn, lú lẫn, giảm thị lực… Sốt và dấu hiệu màng não thường nhẹ hoặc hồn tồn
khơng có. Liệt các dây thần kinh sọ não thường không đối xứng, xuất hiện ở khoảng

6


1/4 số bệnh nhân. Bệnh tiến triển dẫn tới hôn mê; bệnh nhân thường tử vong do
chèn ép thân tủy.
Cryptococcus neofomans gồm 2 loài khác nhau là Cr. neoformans var.
neoformans (Serotype A và D) và Cr. neoformans var. gatti (Serotype B và C). Cả 2
lồi này đều có thể gây viêm não, màng não nhưng hầu hết các trường hợp viêm
mão, màng não gây ra bởi Cr. neoformans var. neoformans. Khoảng trên 90%
những trường hợp viêm não, màng não do Cr. neoformans ở người nhiễm HIV là
Cr. neoformans var. neoformans. Cịn bệnh do Cr. neoformans var. gatti mang tính
chất địa phương (Majid Zarrin và CS.,2010). Viêm màng não do Cr. neoformans
thường được chẩn đoán bằng soi tươi nhuộm mực tàu hoặc ni cấy. Tỷ lệ dương
tính của kỹ thuật soi tươi nhuộm mực tàu từ 50-80%.
 Viêm màng não do nấm Candida:
Các nấm này thường có nguồn gốc từ niêm mạc (miệng, sinh dục, đường tiêu

hóa) hoặc ở da. Trong số các nấm Candida thì nấm C. albicans là nấm hay gây
viêm màng não nhất. Các nấm Candida khác cũng được xác định gây viêm màng
não là C. tropicalis, C. parapsilosis, C. lusitaniae, C. glabrata và C. krusei. Viêm
màng não do các nấm Canidida spp. thường gặp ở trẻ nhỏ hơn là người lớn. Khác
với nấm Cr. neoformans (thường gây viêm não, màng não ở người có tổn thương hệ
miễn dịch), nấm Candida có thể gây viêm não, màng não ở những cơ thể khỏe
mạnh (Majid Zarrin và CS., 2010).
 Các loài nấm khác gây viêm màng não:
Tỷ lệ gặp các nấm khác gây viêm não, màng não ít hơn các nấm Cr.
neoformans và Candida Vì vậy, việc chẩn đốn cũng trở nên khó khăn hơn do bệnh
ít được quan tâm. Các nấm này bao gồm: các nấm loài nấm Aspergillus (thường gặp
nhất là Aspergillus fumigatus), các nấm thuộc giống Zygomycetes, các nấm lưỡng
dạng C. immitis và Histoplasma capulatum...
1.2.

Đặc điểm sinh học của một số loài nấm men
Các loài nấm gây bệnh viêm não, màng não thường gặp nhất là nấm men,

điển hình là Candida và Cr. neoformans.
1.2.1. Nấm Cr. neoformans
7


 Lịch sử phát hiện
Cryptococcus có nhiều lồi nhưng chủ yếu gặp Cryptococcus neoformans
gây bệnh. Bệnh gọi là Cryptococcosis. Nấm thường nhiễm qua đường hơ hấp nhưng
có ái tính với hệ thần kinh trung ương. Bệnh được Busse và Buschkle phát hiện từ
năm 1892. Năm 1905, Von Hansemann đã giới thiệu ca bệnh viêm màng não do
nấm Cr. neoformans đầu tiên, tiếp đó là những ca nhiễm trùng do nấm Cr.
neoformans ở phổi, thận và nhiều cơ quan khác. Ngoài Cr. neoformans, lồi Cr.

albidus và Cr. laurentii cũng có khả năng gây bệnh nhưng ít gặp (Lê Bách Quang
và cs, 2008).
Trước đây, người ta cho rằng nấm Cr. neoformans có 2 giống, đó là Cr.
neoformans var. neoformans (gồm các tuýp huyết thanh A, D, AD) và Cr. neoformans
var. gattii (gồm các tuýp B, C). Hiện nay, người ta đã khẳng định có 3 giống Cr.
neoformans là grubii (tuýp A), gattii (tuýp B, C) và neoformans (tuýp D), trong đó Cr.
neoformans var. gattii được cho là một loài riêng biệt với tên là Cr. bacillisporus. Nấm
Cr. neoformans var. neoformans còn được gọi là Filobasidiella neoformans (Trần
Xuân Mai và cs., 2004; Arturo Casadevall và J. Perfect, 1998).
 Đặc điểm sinh học của Cr. neoformans:
Cr. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được bao
ngồi bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi
từ 2-40µm.
Cr. neoformans có thể mọc trên mơi trường thạch Sabouraud dextrose, thạch
máu cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C trong vòng
khoảng 72h. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 370C. Cr.
neoformans phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5% CO2, pH hơi kiềm và một
lượng nhỏ chất sắt .
Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm Cr. neoformans mọc
thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài
milimet [7, 9].

8


Hình 1.1: Đặc điểm Cr.neoformans. A:Khuẩn lạc Cr. neoformans trên môi
trường Staid agar; B: Nấm Cr. neoformans khi nhuộm mực tàu

(Nguồn: Jeremy N Day, 2004)
Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2, độ pH ảnh hưởng

tới sự phát triển của các capsule. Nhiệt độ cao từ 39 - 400C hoặc quá thấp ức chế sự
tăng trưởng của nấm. Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm tăng tổng hợp và kích thước
capsule, ở nồng độ CO2 cao nấm chỉ sản suất các capsule với kích thước nhỏ. Mơi
trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl 2,9%), hoặc pH acid sẽ
làm giảm sản xuất các capsule [7].
Cr. neoformans là một sinh vật sống hoại sinh, ngồi cơ thể vật chủ, chúng
có thể sống tự do bên ngồi mơi trường. Nấm có thể được tìm thấy ở khắp nơi trên
thế giới trong chất thải của gia cầm, phân chim bồ câu, vẹt, yến, trong các hang
động, nước trái cây lên men, trong sữa, trong đường ruột của ngựa, trên cơ thể dơi,
gián, trong đất và các hốc cây khác nhau. Nấm cịn được tìm thấy trong thân gỗ mục
của một số loài cây như: cây bạch đàn (Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus
tereticornis), cây cao su màu đỏ (E. tereticornis) [18].
 Khả năng gây bệnh
Cr. neoformans chủ yếu gây bệnh ở những người suy giảm miễn dịch, tổn
thương hay gặp ở hệ thần kinh (Lê Bách Quang và cs., 2008; Arturo Casadevall và
J. Perfect., 1998).
 Chẩn đoán:
Chẩn đốn trực tiếp: Nhuộm soi, ni cấy, phản ứng PCR, phản ứng huyết thanh.

9


- Chọc dò tủy sống: dịch não tủy thường trong, áp lực tăng cao; đường và
protein ít biến loạn; tế bào tăng nhẹ, chủ yếu bạch cầu lympho. Nhuộm dịch não tủy
bằng mực tàu, soi tìm nấm. Ni cấy nấm từ dịch não tuỷ, máu, tổ chức.
- Sinh thiết bệnh phẩm da, soi, cấy tìm nấm.
- Phát hiện kháng nguyên trong huyết thanh [15].
Chẩn đoán gián tiếp: Các phản ứng dùng để phát hiện kháng thể kháng lại Cr.
neoformans trong máu bệnh nhân. Các xét nghiệm này thường khơng có ý nghĩa
chẩn đoán

1.2.2. Nấm Candida
 Đặc điểm sinh học.
Candida là nấm men, kích thước 2 - 5 m, hình trịn hoặc bầu dục. Candida
thường sống hoại sinh trong đường tiêu hoá của người và động vật, trong âm đạo...
Hay gặp nhất là C. albicans, có thể gặp các lồi khác như C. tropicalis, C.
parapsilopsis, C. glabrata… ở ngoại cảnh ít khi phân lập được C. albicans, có thể
phân lập được C. tropicalis, C. parapsilopsis, C. glabrata, C. krusei, C.
guilliermondii trong môi trường tự nhiên (đất, nước, thực vật).
Ở trạng thái hoại sinh, số lượng tế bào nấm rất ít và khơng có sợi giả, nấm
giữ thế cân bằng với các loại vi sinh vật hội sinh khác. Khi ký sinh gây bệnh, số
lượng tế bào tăng lên nhiều, xuất hiện những sợi tơ nấm giả cho phép nấm len lỏi
giữa những tế bào và xâm nhập sâu hơn vào cơ thể. Lồi gây bệnh hay gặp nhất là
C. albicans.

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái nấm Candida albicans
(Nguồn: http:// wikipedia.org)
 Khả năng gây bệnh
10


Candida có thể gây bệnh ở bất kì cơ quan và tổ chức nào của cơ thể nhưng
phổ biến nhất là da và niêm mạc. Bệnh do Candida gây ra có thể cấp tính, bán cấp
hoặc mãn tính. Trên người có chức năng miễn dịch bình thường, nấm chỉ gây bệnh
ở da – niêm mạc, những trường hợp nặng chỉ gặp ở người suy giảm miễn dịch.
Các yếu tố thuận lợi:
+ Yếu tố sinh lý: trẻ sơ sinh, người già, phụ nữ có thai...
+ Yếu tố nghề nghiệp: những người thường xuyên tiếp xúc với nước như bán
trái cây, bán cá, làm bếp trong nhà hàng...
+ Yếu tố bệnh lý: đái đường, suy dinh dưỡng, ung thư, bệnh máu ác tính,
nhiễm HIV/AIDS, suy giảm miễn dịch...

+ Thuốc: kháng sinh phổ rộng kéo dài, corticoid, thuốc ức chế miễn dịch.
 Chẩn đoán
+ Xét nghiệm trực tiếp: thấy tế bào nấm men và sợi nấm giả.

Hình 1.3. Tế bào men và sợi giả
(Nguồn: http:// wikipedia.org)
+ Mô bệnh học: mô sinh thiết nhuộm PAS, GMS hoặc Gram. Phát hiện tế
bào nấm men, nẩy búp, có sợi nấm giả, sợi giả thường nhầm sợi của Aspergillus nếu
khơng có tế bào men nẩy búp.
+ Ni cấy: khuẩn lạc thường có mầu trắng, kem, mặt nhẵn hoặc như sáp.
Định loài nấm dựa vào thử nghiệm ống mầm, phản ứng sinh hoá…
Kết quả: phát hiện nấm từ bệnh phẩm vơ khuẩn có giá trị chẩn đốn. Phát
hiện sợi giả ở da, niêm mạc có giá trị nếu kèm triệu chứng lâm sàng. Phát hiện nấm
men từ bệnh phẩm khơng vơ khuẩn ít có ý nghĩa.
+ Chẩn đốn huyết thanh:

11


- Phát hiện kháng thể thường ít giá trị.
- Phát hiện kháng nguyên -glucan thành tế bào, enolase, mannan.
+ Phát hiện chất chuyển hoá D-arabinitol trong huyết thanh, nước tiểu.
1.3.

Các kỹ thuật chẩn đoán nấm gây viêm não, màng não
Trong thực hành điều trị, việc đưa ra một phán quyết trong điều trị phụ thuộc

rất nhiều vào thời gian chẩn đoán, căn nguyên gây bệnh. Trong bệnh viêm não,
màng não do vi nấm, để chẩn đốn bệnh người ta có thể thực hiện các kỹ thuật khác
nhau như: soi tươi, ni cấy, huyết thanh học, chẩn đốn hình ảnh (CT, MRI) và

sinh học phân tử. Kỹ thuật soi tươi có ưu điểm là nhanh nhưng độ nhạy thấp. Nuôi
cấy mất nhiều thời gian và nhiều nấm nội tạng phát triển rất chậm hoặc không mọc
trong môi trường nuôi cấy do nhiều lý do khác nhau (thay đổi môi trường đột ngột,
thay đổi nhiệt độ trong q trình ni cấy, mơi trường ni cấy khơng phù hợp…)
nên việc chẩn đốn bệnh nấm nội tạng thường gặp rất khó khăn (khó hơn chẩn đốn
nhiễm khuẩn) và rất dễ nhầm lẫn, bỏ sót. Chẩn đốn muộn, chẩn đốn nhầm, lựa
chọn thuốc khơng đúng trong điều trị có thể làm tổn hại sức khỏe thêm cho người
bệnh.
Bệnh phẩm phụ thuộc vào vị trí nấm ký sinh. Bệnh phẩm có thể là máu, dịch
não tủy, đờm, dịch soi phế quản, nước tiểu, mảnh mô bị tổn thương, chất hút từ tổn
thương da, chất cạo, mảnh sinh thiết mô bị tổn thương, dịch khớp, dịch màng tim
v.v…[9].
1.3.1. Soi tươi
Soi tươi là kỹ thuật soi tìm vi nấm trong bệnh phẩm thu thập bằng cách xử lý
bệnh phẩm với các hóa chất thơng thường. Soi tươi có thuận lợi là cho kết quả
nhanh, dễ thực hiện, độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy thấp. Như trường hợp viêm
màng não do Cryptococcus neoformans, theo Dolan Champa Saha và CS (2009) độ
nhạy của soi tươi chỉ khoảng 50-80%, theo Jeremy N Day (2004) độ nhạy của soi
tươi là 75% và theo Tihana Bicanic et al (2004), ở bệnh nhân HIV/AIDS bị viêm
màng não do Cryptococcus neoformans tỷ lệ soi tươi dương tính là 70-90% và ở
khơng có AIDS tỷ lệ này khoảng 50%. Các tác giả đều cho rằng kỹ thuật soi tươi
dương tính khi số lượng tế bào nấm trong một đơn vị thể tích bệnh phẩm cần trên

12


một giới hạn nhất định. Theo Jeremy N Day (2004) đối với Cryptococcus
neoformans con số này cần trên 104 tế bào nấm/ml dịch não tủy. Ngồi ra, soi tươi
cịn có nhược điểm là khó thực hiện được khi bệnh phẩm là máu, mảnh sinh thiết
mô…

Với dịch não tủy hoặc các dịch tiết khác có thể nhuộm ngay bằng mực tàu rồi
soi dưới kính hiển vi. Với đờm và mủ cần phải được làm sạch trước với KOH 10%
trước khi nhuộm mực tàu. Độ nhạy của xét nghiệm có thể đạt 75-85% (Paola
Rappelli và cs., 1998).
Kết quả quan sát cho hình ảnh nấm Cr. neoformans là những tế bào nấm
men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày. Độ dày của lớp vỏ
rất thay đổi. Nhuộm soi là phương pháp đơn giản nhất cho chẩn đoán tìm nấm trong
dịch não tủy (Lê Bách Quang và cs., 2010).
Ở bệnh nhân HIV/AIDS bị viêm màng não do Cr. neoformans, phương pháp
nhuộm mực tàu có tỷ lệ dương tính 70-90%, nhưng ở người bình thường viêm màng
não do Cr. neoformans tỷ lệ dương tính chỉ khoảng 50% (Tihana Bicanic và
Thomas S. Harrison., 2004).
Với các lát cắt sinh thiết mô, các nang nấm xuất hiện bao quanh bởi một
khoảng trắng rộng vì sự kém bắt màu thuốc nhuộm của vỏ polysaccharide và sự
xoắn vặn do cắt lát. Trong lát cắt, tế bào nấm thường méo mó hoặc bị xẹp. Các
capsule có thể được làm nổi bật bằng cách nhuộm PAS, HE, hoặc mucicarmine (Lê
Bách Quang và cs., 2010; Arturo Casadevall và J. Perfect., 1998).
1.3.2. Nuôi cấy
Nuôi cấy là kỹ thuật làm tăng số lượng vi nấm ở bệnh phẩm trên mơi trường
ni cấy sau một thời gian nhất định. Có nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau cho
vi nấm nhưng chủ yếu dùng mơi trường Sabouraud hoặc Sabouraud có pha thêm
kháng sinh. Để vi nấm phát triển thành khuẩn lạc cần một thời gian nhất định. Do
vậy, nuôi cấy thời gian thường dài và dài hơn soi tươi rất nhiều. Trung bình phải
mất ít nhất 3-5 ngày mới có kết quả ni cấy. Đặc biệt, có những nấm phải sau 2-3
tuần mới mọc trong môi trường nuôi cấy nên trong những trường hợp này ni cấy
khơng đáp ứng được tính cấp bách trong điều trị (Mark D. Lindsley và cs., 2001).
Kỹ thuật này cịn có nhược điểm là có thể cho kết quả dương tính giả do nhiễm nấm
13

từ khơng khí. Ngồi ra, tỷ lệ cấy nấm dương tính của một số nấm khơng cao, theo
Jeremy N Day (2004) độ nhạy của cấy nấm trong chẩn đoán viêm màng não do
Cryptococcus neoformans có thể đạt 90%. Do có độ chính xác cao hơn soi tươi nên
ở những nơi chưa có các phương tiện chẩn đốn khác ni cấy vẫn là một lựa chọn
tốt nhất.
Các bệnh phẩm máu hoặc dịch não tủy được cấy trên môi trường thạch
Sabouraud dextrose ở 370C, đọc kết quả hàng ngày. Nấm mọc thành các khuẩn lạc
lồi, mịn, nhày, màu kem. Cấy máu có độ nhạy tới hơn 70% ở các trường hợp bệnh
nhân AIDS (Lê Bách Quang và cs., 2010; Trần Xuân Mai và cs., 2004).
1.3.3. Chẩn đoán huyết thanh
Chẩn đoán huyết thanh có thể phát hiện kháng nguyên hay kháng thể kháng
nấm trong máu. Các kỹ thuật miễn dịch có thể được áp dụng trong chẩn đoán vi
nấm là kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (immunodiffusion-ID), kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent-antibody), kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang gián tiếp (indirect fluorescent-antibody), kỹ thuật ngưng kết latex (latex
agglutination - LA), kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hoặc
kỹ thuật Western blot… Tuy nhiên, do sau 3-4 tuần nhiễm nấm cơ thể mới sinh
kháng thể kháng nấm nên các kỹ thuật phát hiện kháng thể ít có giá trị trong chẩn
đốn nhiễm nấm cấp tính và hiện ít được áp dụng trong lâm sàng
Phát hiện kháng nguyên có độ đặc hiệu cao nhưng độ đặc hiệu có thể cao
hoặc khơng cao do thường sử dụng kháng thể đa dòng. Theo Tihana Bicanic và
CS (2004), kỹ thuật ngưng kết latex phát hiện nấm Cr. neoformans độ nhạy có
thể đạt trên 90% [48]. Phản ứng có độ nhạy cao nhưng thường có dương tính
giả hay âm tính giả (Paola Rappelli và cs., 1998).
Do những có những hạn chế nên sử dụng các phương pháp truyền thống
cịn gặp nhiều khó khăn trong chẩn đốn vi nấm nội tạng gây bệnh. Vì vậy, thực
tế đã có rất nhiều ca bệnh khơng được chẩn đốn kịp thời hoặc bị bỏ sót dẫn đến
các tai biến, biến chứng làm kéo dài thời gian nằm viện, tăng chi phí, để lại di
chứng nặng hoặc đe dọa tính mạng của người bệnh. Vì vậy u cầu chẩn đốn
đúng, chẩn đốn sớm ngày càng trở nên cấp thiết.

14


1.3.4. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Sự ra đời và phát triển của sinh học phân tử trong vòng 2 thập niên trở lại
đây đã đem lại các cơng cụ chẩn đốn bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời
gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các
cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một
lượng rất nhỏ (vài picrogam) DNA cũng có thể cho kết quả chẩn đoán.
Phản ứng PCR phát hiện một vài gene của nấm gần đây đang phát triển, có
thể dùng phản ứng kỹ thuật RFLP-PCR (D W. Wiliams và CS.,1995; SH Mirhendi
và cs., 2001; Mohammad Ghahri và CS., 2012; K. Diva và CS., 2012 ), Nested-PCR
(Paola Rappelli và cs.,1998; SB. Jahromi, Mansoor Abachi và cs., 2006) hay PCR
căn bản để phát hiện nấm... Theo Shahindokht Bassiri Jahromi và CS (2006) dùng
kỹ thuật Seminested-PCR và Paola Rappelli và CS (1998) sử dụng kỹ thuật NestedPCR cho thấy các kỹ thuật này có khả năng chẩn đoán nhiễm nấm Cr. neoformans
trong dịch não tủy khi số lượng tế nào nấm trên 102/ml. Trong khi soi tươi ngưỡng
này là > 104 tế bào nấm/ml (Jeremy N Day., 2004).
1.3.4.1. Kỹ thuật PCR
PCR là phản ứng nhân nhanh số lượng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự
nhân đơi DNA invitro. Q trình này được tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase.
a) Nguyên lý cơ bản của PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba
giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Giai đoạn 1: Gây biến tính (denaturation): Biến tính mẫu DNA thành chuỗi
đơn ở nhiệt độ 90-95oC
- Giai đoạn 2: Gắn mồi (annealing): Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch
khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, ở nhiệt độ 40-65oC.
- Giai đoạn 1: Kéo dài phân tử DNA (extension): Giai đoạn kéo dài tổng hợp
bản sao DNA ở nhiệt độ 70-72oC.

Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên được lập lại nhiều lần [1, 12].

15