Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây bạch cập (bletilla striata (thunb ) reichb f )

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

HỒNG THỊ NHƯ NỤ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO
CÂY BẠCH CẬP (BLETILLA STRIATA (THUNB.)
REICHB.F.)

Ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

8420201

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Đinh Trường Sơn


NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng
để bảo vệ bất kỳ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Như Nụ

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viện của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Lời đầu tiên, tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh
Trường Sơn - Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học
viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn dành nhiều thời gian, cơng sức, giúp
đỡ và động viên tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài và hồn thành luận văn này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô giáo trong Khoa Công nghệ
sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, TS. Nghiêm
Tiến Chung - Bộ môn Giống - Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà
Nội, TS. Nguyễn Văn Khiêm - Phụ trách Trung tâm Nghiên cứu nguồn gen và giống
dược liệu - Viện Dược liệu, cùng toàn thể các cán bộ, đồng nghiệp trong Trung tâm đã
giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi học tập và hồn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, tất cả người thân, bạn bè, những người
luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Như Nụ

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ i
Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt....................................................................................................v
Danh mục bảng ........................................................................................................... vi
Danh mục hình ........................................................................................................... vii
Trích yếu luận văn ..................................................................................................... viii
Thesis abstract ............................................................................................................. ix
Phần 1. Mở đầu ...........................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề .......................................................................................................1

1.2.

Mục đích và yêu cầu ........................................................................................2

1.2.1.

Mục đích .........................................................................................................2

1.2.2.

Yêu cầu ...........................................................................................................2

1.3.

Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của để tài ..............................................................2

1.3.1.

Ý nghĩa khoa học .............................................................................................2

1.3.2.

Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ..........................................................................................3
2.1.

Giới thiệu chung về cây bạch cập .....................................................................3

2.1.1.

Nguồn gốc .......................................................................................................3

2.1.2.

Vị trí phân loại .................................................................................................3

2.1.3.

Đặc điểm thực vật học .....................................................................................6

2.1.4.

Bộ phận dùng và cách sơ chế ...........................................................................6

2.1.5.

Thành phần hóa học .........................................................................................7

2.1.6.

Tác dụng dược lý và công dụng .......................................................................7

2.2.

Các phương pháp nhân giống cây bạch cập ......................................................8

2.2.1.

Bằng hạt: gieo trực tiếp ....................................................................................8

2.2.2.

Bằng củ (thân rễ) .............................................................................................9

2.3.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về nhân giống In Vitro cây bạch cập .......9

2.3.1.

Ngoài nước ......................................................................................................9

2.3.2.

Trong nước ....................................................................................................11

2.4.

Kỹ thuật nhân giống In Vitro..........................................................................11

2.4.1.

Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật (tính tồn năng của tế bào) .........11

2.4.2.

Các bước cơ bản của quá trình nhân giống In Vitro ........................................12

iii


2.4.3.

Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống In Vitro .................................13

Phần 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu ......................................15
3.1.

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ...................................................................15

3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................................15

3.3.

Nội dung nghiên cứu......................................................................................15

3.4.

Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................16

3.4.1.

Phương pháp nuôi cấy In Vitro ......................................................................16

3.4.2.

Phương pháp khử trùng mẫu cấy ....................................................................16

3.4.3.

Phương pháp xác định khối lượng và đường kính củ In Vitro .........................16

3.4.4.

Phương pháp bố trí thí nghiệm .......................................................................17

3.5.

Các chỉ tiêu theo dõi ......................................................................................20

3.6.

Xử lý số liệu ..................................................................................................20

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................21
4.1.

Tạo vật liệu khởi đầu .....................................................................................21

4.2.

Nghiên cứu tái sinh chồi In Vitro cây bạch cập ..............................................22

4.3.

Nghiên cứu nhân nhanh chồi In Vitro cây bạch cập ........................................25

4.3.1.

Ảnh hưởng của ba và α-naa đến khả năng nhân nhanh chồi In Vitro...............25

4.3.2.

Ảnh hưởng của ba và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi In Vitro.............28

4.4.

Nghiên cứu tạo củ In Vitro cây bạch cập ........................................................29

4.4.1.

Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng tạo củ In Vitro ...............30

4.4.2.

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo củ In Vitro bạch cập ...........31

4.5.

Nghiên cứu đưa cây ra vườn ươm ..................................................................34

4.5.1.

Ảnh hưởng của kích thước củ In Vitro đến khả năng sinh trưởng của cây giai
đoạn vườn ươm..............................................................................................34

4.5.2.

Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây bạch cập giai đoạn
vườn ươm ......................................................................................................35

4.5.3.

Ảnh hưởng của thời điểm ra cây đến khả năng thích nghi của cây ngoài vườn
ươm ...............................................................................................................36

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................41
5.1.

Kết luận .........................................................................................................41

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................41

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................42

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

AC

Than hoạt tính

BA

6 - Benzyl adenine

cs

Cộng sự

CT

Cơng thức

CV%

Độ biến động thí nghiệm

ĐC

Đối chứng

IBA

Indol butyric acid

Kin

Kinetin

LSD 0.05

Mức sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa 5%

MS

Murashige and Skoog

α-NAA

α-naphtalene acetic acid

TB

Trung bình

TDZ

N-phenyl-N-1,2,3-thidiazol-5-yl urea

TN

Thí nghiệm

2,4 - D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái của 4 loài Bletilla ở Trung Quốc ................................... 4

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng củ bạch cập (sau
4 tuần nuôi cấy) ......................................................................................... 21
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi In Vitro bạch cập (sau
4 tuần nuôi cấy) ......................................................................................... 23
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi In Vitro cây bạch
cập (sau 4 tuần nuôi cấy) ........................................................................... 24
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi .................. 26
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi
In Vitro cây bạch cập (sau 6 tuần nuôi cấy) ............................................... 28
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến khả năng tạo củ In Vitro
(sau 8 tuần nuôi cấy) ................................................................................. 30
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo củ in vitro cây bạch
cập (sau 8 tuần ni cấy) ........................................................................... 31
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của kích thước củ In Vitro đến khả năng sinh trưởng của
cây bạch cập giai đoạn vườn ươm (sau 30 ngày)........................................ 34
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng thích nghi của cây ............................ 36
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của thời điểm ra cây đến khả năng thích nghi của cây
ngồi vườn ươm (sau 30 ngày) .................................................................. 37
Bảng 11.

Bước đầu đánh giá khả năng sinh trưởng của cây nuôi cấy mô so với
cây tách mầm (sau 3 tháng) ....................................................................... 38

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cây bạch cập (Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f.) .......................................... 6
Hình 2.2. Củ dạng thân rễ (rhizome) của bạch cập ...................................................... 6
Hình 2.3. Dược liệu (củ dạng thân rễ) bạch cập khơ .................................................... 7

Hình 3.1. Củ bạch cập vào mẫu ................................................................................ 15
Hình 3.2. Cân kỹ thuật .............................................................................................. 16
Hình 3.3. Thước cặp ................................................................................................. 16
Hình 4.1. Mẫu củ bạch cập sau 4 tuần được khử trùng .............................................. 22
Hình 4.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh chồi in vitro bạch cập................ 23
Hình 4.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi in vitro ......................... 25
Hình 4.4. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi .................. 27
Hình 4.5. Ảnh hưởng kinetin (phối hợp với BA 1,5 mg/L) đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro cây bạch cập................................................................ 29
Hình 4.6. Củ bạch cập trên mơi trường MS lỏng ....................................................... 30
Hình 4.7 a. Củ in vitro trong môi trường MS lỏng ở các nồng độ đường ...................... 32
Hình 4.7 b. Độ đồng đều của củ ở các nồng độ đường ................................................. 33
Hình 4.8. Ảnh hưởng của kích thước củ in vitro đến khả năng sinh trưởng của
cây giai đoạn vườn ươm ............................................................................ 35
Hình 4.9 a. Cây bạch cập trồng trong cát non .............................................................. 36
Hình 4.9 b. Chồi và rễ mới .......................................................................................... 36
Hình 4.10. Cây bạch cập ra vườn ươm vào thời điểm tháng 9 - 10 .............................. 37
Hình 4.11. Cây bạch cập ni cấy mơ ngoài đồng ruộng ............................................. 39

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Hồng Thị Như Nụ
Tên Luận văn: “Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây bạch cập (Bletilla striata
(Thunb.) Reichb.f.)”.
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu: Xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro cây bạch
cập (Bletilla striata (Thunb.) Reichb.f.) với hệ số nhân giống cao, chất lượng cây giống
tốt, nhằm cung cấp cây giống cho thị trường Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
thông dụng trên môi trường cơ bản MS, có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, pH
môi trường 5,8 - 6,0 được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, áp suất 1 atm. Các thí
nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo: Nhiệt độ phịng ni: 25 ± 2oC, cường
độ ánh sáng: 2.000 – 3.000 Lux, chế độ chiếu sáng: 14h sáng/10h tối, độ ẩm phịng
ni: 70%. Củ bạch cập được khử trùng bằng dung dịch thủy ngân clorua (HgCl2 0,1%)
trong các khoảng thời gian khác nhau. Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm
IRRISTART 4.0 và Microsoft Excel.
Kết quả chính và kết luận:
1. Đối với củ bạch cập, cách khử trùng thích hợp nhất là dùng HgCl2 0,1% với thời
gian khử trùng 12 phút, cho tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, khả năng tái sinh chồi tốt.
2. Môi trường thích hợp nhất để củ bạch cập tái sinh chồi là môi trường MS + 1,5
mg/L BA + 30g/L đường + 6,2 g/L agar.
3. Mơi trường thích hợp nhất để nhân nhanh chồi bạch cập là môi trường MS có
bổ sung 1,5 mg/L BA + 0,5 mg/L kinetin + 30 g/L đường + 6,2 g/L agar. Trên môi
trường này, số chồi/mẫu đạt 6,45; chiều cao trung bình là 10,23 cm và số lá trung bình
là 4 sau 6 tuần nuôi cấy.
4. Môi trường tốt nhất cho cây bạch cập in vitro tạo củ là môi trường MS lỏng +
40 g/L đường với số củ/mẫu đạt 4,6; khối lượng củ tươi đạt 0,44 g, và đường kính củ
đạt 11,13 mm sau 8 tuần, củ to và đồng đều.
5. Kích thước củ in vitro càng lớn thì tỷ lệ sống của cây ex vitro trong vườn ươm
càng cao. Cây có đường kính củ 9 - 11 mm là đảm bảo đủ tiêu chuẩn đưa ra vườn ươm.
6. Cát là giá thể tốt nhất để ra cây bạch cập với tỷ lệ sống đạt 93,6%, thời điểm ra
cây vào khoảng tháng 9 - tháng 10 là thích hợp.

viii

THESIS ABSTRACT
Author: Hoang Thi Nhu Nu
Title: Studies on micropropagation of Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.
Major: Biotechnology

Code: 8420201

Training Facility Name: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Objectives: Studies on micropropagation of Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. with
high propagation coefficient, good seedling quality, to provide seedlings for Vietnam.
Methods:
Using plant tissue culture with basic MS medium, supplemented with growth
regulators, adjusted to pH of 5.8 - 6.0, and sterilized at 121oC, 1 atm for 20 minutes.
Experiments were conducted at room temperature of 25 ± 20C under light intensity of
2.000 – 3.000 Lux with a lighting period of 14 hrs light/10 hrs dark and relative
humidity below 70%. The rhizomes used as starting materials were surface sterilized
with a 0.1% HgCl2 solutionfor different time periods. Results obtained were statistically
processed using IRRISTART 4.0 software and Microsoft Excel.
Results and Conclusions
1. The best way for surface sterilization of the rhizomes used as starting materials
was to soak with a solution of 0.1% HgCl2 solution for 12 minutes giving the lowest
infection rate, as well as the highest survival rate, and good shoot regeneration.
2. The most suitable medium for shoot regeneration is MS + 1.5 mg/L BA + 30
g/L saccharose + 6.2 g/L agar.
3. The best medium for shoot multiplication of Bletilla striata was 1.5 mg/L BA +
0.5 mg/L kinetin + 30 g/L saccharose + 6.2 g/L agar with a multiplication rate of 6.45
shoots per explant, reaching the height of 10.23 cm and producing 4 leaves in 6 weeks.
4. Best in vitro tuberisation was observed in a liquid basic MS medium + 40 g/L

saccharose. Each plantlet gave an average of 4.6 rhizomes with 0.44 g in weight and
11.13 mm in diameter in 8 weeks of culture. The tubers were quite even in size.
5. The greater the size of in vitro tubers, the higher the survival rate of the ex vitro
plantson transferring into nursery. Tubers with a diameter of 9 - 11 mm proved to be
suitable for transfer.
6. Sand was the best planting medium for raising the plantlets giving a survival
rate of as high as 93.6% is September - October.

ix


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch cập (Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.) là cây thân thảo, sống lâu năm,
thuộc họ Lan (Orchidaceae). Ở Trung Quốc từ hàng ngàn năm trước, củ bạch cập đã
được sử dụng làm thuốc trong y học truyền thống để điều trị các bệnh thổ huyết,
chấn thương, chảy máu (dạ dày), loét, sưng, đau, bỏng và nứt nẻ da. Cho đến nay,
người ta đã phân lập được 125 hợp chất từ bạch cập có vai trò quan trọng trong
phòng chống khối u, chống viêm (Diao et al., 2008; Zhan et al., 2014), thúc đẩy
chữa lành vết thương (Luo et al., 2010), tăng trưởng tế bào (Liu MZ et al., 2008),
chống viêm gan (Wang et al., 2014), điều hòa miễn dịch (Peng et al., 2014) và có
các tác dụng dược lý khác. Ngồi ra, bạch cập cịn được sử dụng làm mỹ phẩm, lớp
phủ cơng nghiệp và chất kết dính (Cui et al., 2016). Ở Việt Nam, bạch cập được
xem là một cây thuốc quý để chữa các bệnh xuất huyết đường ruột, ho khạc ra máu,
chảy máu cam, trị vết thương hở, bỏng lửa, v.v… nhưng hiếm vì vùng phân bố tự
nhiên cũng như trữ lượng rất hạn chế (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Do có nhiều cơng dụng trong phịng trị bệnh nên trong những năm gần đây,
nhu cầu ở thị trường trong nước và quốc tế đối với bạch cập tăng nên nhanh chóng,
dẫn đến việc khai thác nguồn tài nguyên này trong tự nhiên tới mức cạn kiệt và khan
hiếm (Li et al., 2012; Cui et al., 2016). Ở Việt Nam, bạch cập đã được liệt kê trong

“Sách Đỏ Việt Nam” để chú ý bảo vệ. Trên bình diện quốc tế, bạch cập đã được đưa
vào Phụ lục I của Công ước về bn bán các lồi động vật và thực vật hoang dã có
nguy cơ tuyệt chủng, và nằm trong sự bảo vệ hạng hai của danh sách bảo tồn thực
vật hoang dã quốc gia ở Trung Quốc (Guan CD et al., 2010). Vì vậy, việc nhân
giống với quy mơ lớn nhằm đảm bảo cung cấp cho thị trường và gián tiếp góp phần
bảo tồn nguồn gen bạch cập trong tự nhiên là một nhu cầu cấp thiết.
Hạt bạch cập không có nội nhũ nên cần nấm cộng sinh (khuẩn căn) để có
thể nảy mầm, nên khả năng nảy mầm của nó trong tự nhiên rất thấp. Trong thực
tế trồng trọt, tách mầm là phương pháp chính để nhân giống bạch cập. Tuy nhiên,
phương pháp này không phù hợp với sản xuất giống ở quy mô lớn do chu kỳ
nhân giống dài, hiệu quả và hệ số nhân giống thấp (Guan CD et al., 2010). Kỹ
thuật nhân giống vơ tính in vitro cho phép nhân nhanh cây giống với hệ số nhân
cao, cây giống đồng đều, số lượng lớn, có thể cung cấp một cách chủ động, khắc
phục được những hạn chế của phương pháp nhân giống nói trên.

1


Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên đây, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây bạch cập
(Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.)”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU
1.2.1. Mục đích
Xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro cây bạch cập (Bletilla striata
(Thunb.) Reichb. f.)
1.2.2. Yêu cầu
Xác định được cách khử trùng mẫu để tạo nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy
in vitro.
Xác định được môi trường tái sinh chồi in vitro thích hợp.
Xác định được mơi trường nhân nhanh in vitro thích hợp cho hệ số nhân cao.

Xác định mơi trường thích hợp tạo củ in vitro.
Xác định được kích thước củ, giá thể và thời điểm thích hợp để đưa cây in
vitro ra vườn ươm.
1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN CỦA ĐỂ TÀI
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về nhân giống in vitro cây bạch cập ở
Việt Nam. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm tài liệu khoa học về khả năng ứng
dụng của kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro đối với cây bạch cập nói riêng và
các lồi cây dược liệu nói chung, đồng thời nó cũng là cơ sở cho các nghiên cứu
tiếp theo về đối tượng tiềm năng này.
Kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo, phục vụ cho công
tác nghiên cứu khoa học và giảng dạy ở trường Đại học, Cao đẳng và Trung cấp
chuyên nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen
bạch cập, thúc đẩy sản xuất trên quy mô lớn, chủ động trong khâu sản xuất, cung
cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, với giá thành cạnh tranh, tạo
nguồn nguyên liệu bạch cập cho ngành Dược Việt Nam để góp phần phịng
chống bệnh tật cho cộng đồng và mang lại giá trị về kinh tế cho xã hội.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY BẠCH CẬP
2.1.1. Nguồn gốc
Bạch cập có nguồn gốc từ Trung Quốc, phân bố chủ yếu ở các tỉnh Tứ
Xuyên, Vân Nam, Quý Châu, Hồ Nam, Hồ Bắc và Chiết Giang (Lin et al., 2013).
Bạch cập được mô tả lần đầu tiên trong cuốn sách “Thần Nông bản thảo”
(Shennong’s Materia medica) của Trung Quốc về nông nghiệp và cây dược liệu

(Sun et al., 2010).
Ở nước ta, bạch cập mọc hoang dại ở một số vùng cao, có khí hậu mát như
tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang và Tuyên Quang.
2.1.2. Vị trí phân loại
Bạch cập có tên khoa học là Bletilla striata (Thunb.) Reichb.f., thuộc họ
Lan (Orchidaceae). Trên thế giới, chi Bletilla bao gồm khoảng 6 loài, phân bố
chủ yếu ở Trung Quốc, Bắc Triều Tiên, Nhật Bản và Miến Điện (Li B et al.,
1993). Ở Trung Quốc có bốn loài là B. striata, B. formosana, B. ochracea và B.
sinensis (Bảng 2.1). Hiện tại, chỉ có B. striata được ghi nhận là cây thuốc trong
Dược điển Trung Quốc (Zhao YX et al., 2013). Vì vậy B. striata rất dễ nhầm lẫn
với 3 lồi cịn lại.

3


Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái của 4 lồi Bletilla ở Trung Quốc
(Chinese Academy of Sciences ‘‘Chinese Flora’’ Editorial Board, 1999)
Độ cao
(m)

Tên lồi

Lá

Củ

Hoa

B. striata

4 - 6 lá, lá thường
to, thn hẹp hoặc
hình mác, đầu lá
nhọn, phần mặt lá
được bao bọc lại,
và ơm lấy nhau.

Hình cầu, có các
vịng trịn đồng
tâm ở phần phía
trên, chứa nhiều
nhớt.

Số hoa trên cụm: 3 - 10
bơng; hoa to; màu đỏ tía
hoặc hồng tía; đài hoa và
cánh hoa dài khoảng 25 30 mm; môi hoa chia thành
3 thùy, 5 phiến môi trên,
phiến uốn lượn. Hoa nở từ
tháng 4 - tháng 5.

100 3.200

Phía Nam của tỉnh Sơn Tây,
phía Đông Nam của tỉnh Cam
Túc, Giang Tô, An Huy, Chiết
Giang, Giang Tây, Hồ Nam,
Quảng Đông, Quảng Tây, Tứ
Xuyên, Quý Châu - Trung
Quốc, Bán đảo Triều Tiên và

Nhật Bản.

3 - 5 lá, nhỏ, có kích Hình cầu dạng
thước thay đổi đa trứng, có các vịng
dạng.
trịn đồng tâm ở
phần phía trên,
chứa nhiều nhớt.

Hoa mọc thành chùm gồm
2 - 6 bông; hoa nhỏ, có màu
tím hoặc hồng; đài và cánh
hoa dài khoảng 15 - 21 mm;
môi hoa chia thành 3 thùy,
5 phiến môi trên; phiến uốn
lượn. Hoa nở từ tháng 4 tháng 5 hoặc tháng 6.

600 3.100

Phía Nam của tỉnh Sơn Tây,
phía Đơng Nam của tỉnh Cam
Túc, Quảng Tây, Tứ Xuyên,
Quý Châu, trung tâm phía Tây
Bắc của Vân Nam, phía Đơng
Nam của Tây Tạng - Trung
Quốc, Đài Loan và Nhật Bản.

4 lá, thuôn hình Hình cầu dạng Số hoa trên cụm: 3 - 10
mác
trứng, hoặc các bơng; hoa to trung bình;

300 2.350

Phía Nam của tỉnh Sơn Tây,
phía Đơng Nam của tỉnh Cam

B. formosana

B. ochracea

4

Phân bố địa lý


Tên lồi

Lá

Củ

Hoa

Độ cao
(m)

hình dạng khơng màu trắng vàng hoặc xanh
đều, có các vịng vàng; đài hoa và cánh hoa
trịn đồng tâm ở dài khoảng 25 - 30 mm;

Phân bố địa lý
Túc, Hà Nam, Hồ Bắc, Quảng
Tây, Tứ Xuyên, Quảng Châu,
Vân Nam - Trung Quốc.

phần phía trên, mơi hoa chia thành 3 thùy, 5
chứa nhiều nhớt.
phiến môi trên, phiến uốn
lượn. Hoa nở từ tháng 5 tháng 6.
B. sinensis

2 - 3 lá, hình mác

-

Số hoa trên cụm: 3 - 10
bơng; hoa nhỏ và có màu
tím, mơi hoa khơng chia
thùy hoặc khơng chia 3
thùy riêng biệt, 3 phiến mơi
trên, phiến có mép răng cưa
hoặc cờ.

5

-

Tỉnh Vân Nam - Trung Quốc
và Thái Lan.

2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Bạch cập là cây thảo sống lâu năm, cao 18 - 60 cm, lá mọc so le từ rễ lên
gồm 4 - 6 lá hình mác, dài 18 - 40 cm, rộng 5 cm. Hoa mọc thành chùm ở thân
ngọn, mỗi chùm có từ 3 đến 10 bơng. Hoa to, màu đỏ tía hoặc hồng tía, đài hoa
và cánh hoa dài khoảng 25 - 30 mm; môi hoa chia thành 3 thùy. Hoa nở rộ từ
tháng 4 đến tháng 5. Quả hình thoi, có 6 cạnh, dài khoảng 3 cm, đường kính 1 cm.
Thân rễ hình cầu dẹt, khơng đều, hầu hết có ngạnh dạng móng, dài 1,5 - 5 cm,
dày 0,5 - 1,5 cm. Mặt ngồi trắng ngà hoặc trắng xám, bên trên có vân trịn đồng
tâm, có các nốt màu nâu là sẹo của rễ con. Các sẹo của thân nhô cao lên, mặt
dưới có vết của củ khác nối liền. Mặt cắt ngang màu hơi trắng trong như sừng
(Flora of China Editorial Committee, 2009; Wiart, 2012) (Hình 2.1 và 2.2).

Hình 2.1. Cây bạch cập (Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f.)

Hình 2.2. Củ dạng thân rễ (rhizome) của bạch cập
2.1.4. Bộ phận dùng và cách sơ chế
Sử dụng thân rễ (củ) đã phơi hoặc sấy khô. Củ bạch cập được thu hoạch vào
tháng 11, bỏ rễ con, rửa sạch đất cát, luộc hoặc đồ lên đến khi mặt cắt ngang thân

6


rễ khơng cịn lõi trắng, phơi đến khơ một nửa, bỏ vỏ ngồi rồi phơi tiếp đến khơ
(Hình 2.3).

Hình 2.3. Dược liệu (củ dạng thân rễ) bạch cập khô
2.1.5. Thành phần hóa học
Đến nay, người ta đã phân lập được khoảng 125 hợp chất từ bạch cập, trong
đó có các polysaccharide, bibenzyl, dihydrophenanthrene, biphenanthrene,

phenanthrene (Yamaki M et al., 1991; Li B et al., 1993; Morita et al., 2005; Feng
JQ et al., 2008), các triterpenoid và saponin của chúng, các steroid và saponin
của chúng, các cyanidin glycoside, phenanthraquinone, anthraquinone, lignan,
organic acid, và các glucosyloxybenzyl 2 - isobutylmalate (He et al., 2017). Ngồi
ra cịn có tinh bột, tinh dầu và chất nhầy (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
2.1.6. Tác dụng dược lý và cơng dụng
Tác dụng cầm máu: Bạch cập có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu, làm
tăng tốc độ lắng máu ở thỏ. Trong một thí nghiệm, người ta cắt ngang đùi thỏ,
kẹp các động mạch lớn lại rồi đắp dịch chiết bạch cập lên, máu đang chảy được
cầm ngay. Tiêm vào tĩnh mạch chủ dưới của ếch, bạch cập làm ngưng kết hồng
cầu trong mạch máu ngoại vi, hình thành khối huyết có tác dụng bịt những mạch
máu bị tổn thương mà không làm tắc các mạch lớn. Bạch cập ít gây kích thích tại
chỗ, những huyết khối do bạch cập gây nên tự tiêu trong vòng 5 ngày. Tác dụng
cầm máu của bạch cập được cho là có liên quan đến thành phần chất nhầy.
Bạch cập cũng có tác dụng cầm máu rất tốt đối với xuất huyết đường tiêu
hóa, cả trên động vật thực nghiệm và điều trị lâm sàng: Chó thực nghiệm được
gây mê, dạ dày và tá tràng bị chọc thủng mỗi chỗ một lỗ đường kính 1 cm, sau đó

7


được bơm 9 g bột bạch cập. Sau 15 giây, bột bạch cập hình thành một màng phủ
kín lỗ thủng. Trong một thử nghiệm lâm sàng, bột bạch cập đã được dùng để điều
trị 70 bệnh nhân loét xuất huyết dạ dày. Kết quả có 68 người khỏi (đạt 97,2%),
thời gian điều trị 4,14 ± 3,0 ngày. Một nghiên cứu khác trên 100 bệnh nhân, có
90 người khỏi (90%), thời gian điều trị là 3,51 ± 1,54 ngày. Dùng bạch cập điều
trị cho 300 bệnh nhân xuất huyết đường hô hấp trên ở Trung Quốc cũng đạt kết
quả rất tốt (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).
Nói chung, bạch cập được dùng làm thuốc cầm máu để điều trị các bệnh
chảy máu trong (nhất là đường tiêu hóa, đường hơ hấp trên) như nôn ra máu, lỵ

ra máu, ho khạc ra máu, chảy máu cam, v.v... và các vết thương cũng như ung
nhọt, bỏng ngoài da.
Ngoài tác dụng cầm máu, mới đây, người ta còn phát hiện thêm nhiều tác
dụng dược lý và công dụng mới của bạch cập, như chống khối u (Zhan et al.,
2014), kháng khuẩn, chống viêm (Diao et al., 2008), kích thích lành vết thương
(Luo et al., 2010), kích thích sinh trưởng tế bào, chống tạo mạch máu (Liu et
al., 2008), chống xơ gan (Wang et al., 2014), điều hòa miễn dịch (Peng et al.,
2014), v.v… Những tác dụng này khiến bạch cập có thể làm giảm khối u và
những tổn thương do oxy hóa, cũng như đẩy nhanh quá trình lành vết thương
nhờ kháng khuẩn.
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CÂY BẠCH CẬP
2.2.1. Bằng hạt: Gieo trực tiếp
Cấu trúc hạt của họ Lan rất đơn giản, khơng có nội nhũ. Tuy nhiên, các tế
bào nhu mơ của phôi hạt bạch cập chứa một lượng lớn protein, chất béo và
carbohydrate, có thể được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho hạt nảy mầm như
nội nhũ. Do đó, khả năng nảy mầm của hạt bạch cập tốt hơn so với các lồi lan
khác trong điều kiện thơng thường (Guo SX and Xu JT, 1990).
Hạt bạch cập có thể được gieo trên giá thể gồm bột vỏ cây, mùn, đất giàu
dinh dưỡng, phân gia cầm và đất than bùn theo tỷ lệ 15: 20: 8: 1: 5 v/v. Cây con
cần được giữ ở nhiệt độ khơng khí 20 - 35°C với độ ẩm tương đối 60 - 80%.
Các dung dịch dinh dưỡng khác nhau được phun định kỳ ở các giai đoạn nảy
mầm khác nhau của hạt có thể làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt từ 5% lên
69,7% (± 3,13%) trong điều kiện tự nhiên. Đường kính của củ (thân rễ) thường
đạt 11,5 cm sau 180 ngày kể từ khi gieo (Niu J and Wang Z, 2016).

8


Thời gian bảo quản của hạt bạch cập có tương quan nghịch với tỷ lệ nảy
mầm và sinh trưởng của cây con. Vì vậy, hạt bạch cập trưởng thành dùng để sản

xuất cây giống chỉ nên bảo quản trong một thời gian ngắn (Yang P et al., 2016).
Theo Huang (2013), hạt bạch cập hoang dã sau khi được xử lý bằng ethylene đạt
tỷ lệ nảy mầm là 35,2%, lần lượt cao hơn 13,6% và 19,8% so với việc xử lý bằng
nước ấm (50°C) và ở nhiệt độ bình thường (Huang Y, 2013).
2.2.2. Bằng củ (thân rễ)
Hạt giống bạch cập khó nảy mầm với tỷ lệ nói chung là thấp, nên việc trồng
trọt truyền thống chủ yếu dựa vào việc nhân giống bằng củ. Củ bạch cập 1 năm
tuổi thường được thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 11, có kích thước tương tự
nhau, có nhiều chồi ngủ, khơng có bệnh hoặc côn trùng gây hại và không bị hư
hại được chọn làm vật liệu trồng. Củ được cắt thành các lát nhỏ, mỗi lát chứa ít
nhất 1 - 2 mầm. Khi mặt cắt se lại hoặc sau khi được chấm vào tro bếp, các lát
cắt được đem trồng sao cho vỏ ngồi và mầm khơng bị sây sát. Bạch cập là cây
dược liệu có rễ ăn nơng, được trồng tốt nhất ở đất thịt pha cát với lớp đất dày
màu mỡ, thống khí, thốt nước tốt nhưng giữ ẩm. Mật độ trồng thông thường là
20 x 30 cm, ở độ sâu 8 - 10 cm (Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Institute of Flowers, 2015). Phương pháp nhân giống này đơn giản, thuận tiện và
dễ thực hiện, nhưng có nhược điểm là hệ số nhân giống thấp và cần thời gian dài
để tạo ra số lượng lớn cây giống khiến nó khơng phù hợp để trồng trên quy mô
lớn (Ren FM et al., 2016).
2.3. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY BẠCH CẬP
2.3.1. Ngoài nước
Năm 2009, Shi YunPing và cs đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây bạch
cập, tác giả đã sử dụng chồi bên và củ làm vật liệu ban đầu. Kết quả nghiên cứu
cho thấy: Chồi bên là vật liệu thích hợp hơn để vào mẫu so với củ. Môi trường
MS + 1,5 mg/L BA + 0,1 mg/L α-NAA thích hợp cho việc tạo cụm chồi đối với
các chồi bên. MS + 2 mg/L BA + 0,2 mg/L α-NAA thích hợp để nhân cụm chồi
với hệ số nhân là 5, cứ sau 30 ngày. Mơi trường ½ MS + 1 mg/L α-NAA + 0,1
mg/L BA cho tỷ lệ ra rễ cao nhất (83,3%), tỷ lệ sống của cây đạt 87,5% trên giá
thể cát sau 3 tháng (Shi YunPing et al., 2009).

9


Sự nảy mầm của hạt và hình thái cây con bạch cập trên các môi trường khác
nhau trong điều kiện vơ trùng cũng đã được nghiên cứu bởi nhóm tác giả Zhang
et al. (2009). Trong quá trình nảy mầm của hạt, phơi phá vỡ lớp vỏ hạt ở một đầu
hình thành nên protocorm. Một mầm lá được tạo ra ở đỉnh của protocorm, sau đó
mọc thành lá. Rễ mọc ở phần đối diện với lá. Môi trường tối ưu cho hạt nảy mầm
là ½ MS + 1 mg/L α-NAA. Bổ sung một lượng nhỏ cytokinin (BA hoặc Kin) vào
môi trường nuôi cấy đã ức chế sự nảy mầm của hạt cũng như sự phát triển của
cây con. Môi trường tối ưu cho sự phát triển của rễ là ½ MS + 1 mg/L α-NAA +
2 g/L AC + 1 mg/L GA3. Than hoạt tính và GA3 làm cho rễ dài và khỏe, cây con
phát triển tốt hơn. Tỷ lệ sống của cây đạt trên 90% trên giá thể đất mùn:
vermiculite (1:1) (Zhang et al., 2009).
Năm 2010, Ye và cs cũng đã nghiên cứu sự nảy mầm của hạt bạch cập
trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy môi trường ½ MS + 1 mg/L BA + 1%
AC là môi trường thích hợp cho hạt nảy mầm và mơi trường tạo cụm chồi tốt
nhất là MS + 1 mg/L BA + 0,15 mg/L α-NAA. Trong nghiên cứu này, nhóm tác
giả chỉ ra rằng mơi trường ½ MS + 0,5 mg/L α-NAA khơng thích hợp cho sự
phát triển của rễ như các nghiên cứu trước đây (Ye et al., 2010).
Theo Ding Zhishan (2012), môi trường tốt nhất cho hạt bạch cập nảy mầm
là ½ MS + 1 mg/L BA và mơi trường tốt nhất để nhân chồi là MS + 1 mg/L BA
+ 0,1 mg/L α-NAA. Mơi trường ½ MS + 1 mg/L α-NAA + 7,5% dịch chuối vào
môi trường tái sinh chồi có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của rễ và MS + 0,1
mg/L α-NAA + 1 mg/L BA + 7,5% dịch chuối có tác dụng kích thích sinh trưởng
của củ và rễ. Kết quả này gần tương tự như kết quả của nhóm tác giả Yuan Ning
với mơi trường tốt nhất cho hạt nảy mầm là ½ MS + 1 mg/L BA, môi trường tái
sinh chồi là MS + 1 mg/L BA + 0,15 mg/L α-NAA (với hệ số nhân chồi là 2,88)
và môi trường ra rễ là ½ MS + 0,5 mg/L α-NAA + 75 g/L chuối. Ngồi ra, trong

nghiên cứu này nhóm tác giả cũng chỉ ra mối quan hệ giữa tuổi phôi với tỷ lệ nảy
mầm của hạt (Yuan Ning et al., 2009).
Năm 2016, kết quả ngiên cứu nhân giống in vitro bạch cập bằng hạt của
nhóm Zhang Doudou và cs cho thấy mơi trường MS + 1mg/L BA thúc đẩy
sự nảy mầm của hạt. MS + 0,5 mg/L BA + 2 mg/L 2,4 - D thúc đẩy hình
thành mơ sẹo một cách hiệu quả với tỷ lệ tạo callus cao nhất đạt 85%. Môi
trường MS + 1 mg/L BA + 0,15 mg/L α-NAA giúp nhân nhanh chồi và mơi
trường ½ MS + 0,5 mg/L α-NAA + 70 g/L chuối kích thích sự phát triển của
rễ (Zhang Doudou et al., 2016).

10


Theo Ding và Zheng, cũng trong năm 2016 thì tỷ lệ nảy mầm của hạt bạch
cập đạt cao nhất ở mơi trường ½ MS + 1 mg/L α-NAA, nhiều protocorm cũng
được tạo ra và phát triển tốt nhất thành cây. Ngược lại, trong mơi trường ½ MS +
1 mg/L BA + 1 mg/L α-NAA, tỷ lệ nảy mầm đạt thấp nhất, tạo ra ít protocorm và
cây con phát triển chậm (Ding and Zheng, 2016).
Có thể thấy số lượng các cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro bạch
cập sử dụng hạt làm vật liệu khởi đầu nhiều hơn hẳn so với các cơng trình xuất
phát từ các bộ phận sinh dưỡng (vegetative) của cây như thân rễ, lá… Kết quả
của các cơng trình này cũng rất khác nhau. Ngun nhân có thể là các nghiên cứu
trên đây chủ yếu phục vụ mục đích nhân bạch cập làm cây cảnh và cũng phản
ánh tính đa dạng về giống (variety) của cây bạch cập. Thực tế có rất nhiều giống
bạch cập trong tự nhiên cũng như được lai tạo trong tiến trình tiến hóa lâu dài;
mỗi giống có thể có những phản ứng và yêu cầu khác nhau đối với các điều kiện
của môi trường nuôi cấy. Trong nhân giống làm cây cảnh, việc xuất hiện các đặc
tính mới (như màu sắc hoa, kích thước cây…) nếu khơng phải là mục tiêu thì
cũng là những hệ quả ngẫu nhiên lý thú. Nhưng nhân giống để làm dược liệu thì
khác, với yêu cầu phải bảo tồn hoặc nâng cao được các đặc tính có lợi về mặt

dược học và nơng học. Vì vậy, sử dụng các bộ phận sinh dưỡng làm vật liệu khởi
đầu vẫn được ưu tiên hàng đầu.
2.3.2. Trong nước
Ở Việt Nam, chưa có cơng bố nào về nhân giống in vitro trên cây bạch cập.
2.4. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO
2.4.1. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật (tính tồn năng của tế bào)
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan niệm cho rằng mỗi tế bào
bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế
bào riêng rẽ đã phân hố đều mang trong mình tồn bộ lượng thơng tin di truyền
cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Nhờ đó, khi gặp điều kiện thích hợp,
mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh. Khả năng này được
gọi là tính tồn năng (totipotence) của tế bào (Haberlandt, 1902).
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hoàn
toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế
bào đơn.

11


2.4.2. Các bước cơ bản của quá trình nhân giống in vitro
Quá trình nhân giống in vitro được chia làm 5 giai đoạn (George, 1993)
Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc
tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Khả
năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý khử trùng mẫu.
Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, sạch bệnh, trên cây mẹ tiến hành chọn cơ
quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá
non…, cây ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.

Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ
chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ
mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu ni cấy.
Tái sinh mẫu ni cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng các mơ ni cấy. Q
trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin
ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Cân bằng hormone nghiêng về phía auxin
sẽ kích thích ra rễ và mơ sẹo, nếu nghiêng về phía cytokinin sẽ kích thích sự hình
thành chồi. Bên cạnh đó, cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mơ
non, chưa phân hố có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành.
Nhân nhanh
Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nhân giống. Để
tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất
điều tiết sinh trưởng khác nhau sao cho cân bằng hormone nghiêng về phía
cytokynin, cũng như các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết hoa quả,
nấm men… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào
từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình
thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi
nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phơi vơ tính. Cây nhân giống
in vitro là cây ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.
Tạo cây hồn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được tách riêng khỏi cụm chồi
và chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau 2 - 3
tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này,

12


người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất auxin có chức năng
tạo rễ. Tuy nhiên, trong một số trường hợp chồi có thể ra rễ ngay sau khi chuyển

từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều
tiết sinh trưởng. Các phôi vơ tính thường chỉ cần gieo trên mơi trường khơng có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc mơi trường có nồng độ cytokinin thấp để phơi
phát triển thành cây hồn chỉnh.
Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và trồng ở nơi
râm, mát, độ ẩm cao. Sau khoảng 2 tuần, khi cây đã thích nghi với điều kiện bên
ngồi, có thể tăng dần cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất
quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro vì cây con thường bị chết do sự
khác biệt về điều kiện sống in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong
điều kiện dị dưỡng, ổn định về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi được chuyển ra
đất với điều kiện tự dưỡng tự nhiên cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo
chết. Để tránh hiện tượng này, vườn ươm phải được đặt ở nơi mát mẻ, cường độ
chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm có giá
thể tơi xốp, dễ thốt nước nhưng giữ ẩm. Trong 7 - 10 ngày đầu tiên, cây cần
được che phủ để giảm sự thoát hơi nước ở lá. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi
cấy mô sẽ dần dần lụi đi và mọc ra rễ mới. Có thể dùng dung dịch chất kích thích
ra rễ với nồng độ thấp để phun lên lá hoặc nhúng gốc cây con nhằm rút ngắn thời
gian ra rễ. Giá thể ra cây cũng phải được xử lý bằng một chế phẩm phù hợp để
loại bỏ nấm bệnh gây hại trước vài ngày.
2.4.3. Ảnh hưởng của một số nhân tố đến nhân giống in vitro
Các chất điều tiết sinh trưởng
Bên cạnh việc cung cấp các chất dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung
một hoặc nhiều chất điều tiết sinh trưởng thuộc các nhóm auxin và cytokinin là
rất cần thiết để kích thích q trình phản biệt hóa của tế bào trong các mô, dẫn
đến việc tái biệt hóa để hình thành các cơ quan mới. Nhu cầu đối với những chất
này thay đổi tuỳ thuộc nhiều yếu tố, như lồi thực vật, loại mơ, tuổi mơ, một cách
tổng quát là phụ thuộc vào hàm lượng chất điều tiết sinh trưởng nội sinh của mô.
Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:
Cytokinin là nhóm dẫn xuất của adenine. Các cytokinin tự nhiên được sinh

tổng hợp ở ngọn thân và vận chuyển hướng gốc, vì vậy liên quan chủ yếu đến sự
phân chia tế bào, quyết định ưu thế ngọn và phân hóa chồi. Trong ni cấy mơ tế

13


bào thực vật, người ta thường sử dụng các cytokinin BAP/BA, TDZ (tổng hợp)
và kinetin (tự nhiên) để kích thích ra chồi.
Auxin là nhóm hormone kích thích sinh trưởng được sinh tổng hợp ở mô
phân sinh đầu rễ và vận chuyển hướng ngọn. Auxin có tác dụng kích thích sự
trương giãn tế bào, tác động đến tính hướng đất, làm cho rễ chính sinh trưởng
mạnh, ức chế sinh trưởng chồi bên, kích thích sự ra quả và tạo quả khơng hạt, ức
chế quá trình rụng quả. Các auxin tổng hợp (như α-NAA, IBA) và auxin tự nhiên
(IAA) đều được dùng trong ni cấy mơ thực vật để kích thích q trình tạo rễ.
Tuy nhiên, các auxin tổng hợp có hoạt tính mạnh hơn, bền hơn và rẻ hơn so với
auxin tự nhiên nên được dùng thường xuyên hơn.
Tỷ lệ auxin/cytokinin có tầm quan trọng quyết định đối với chiều hướng
phát sinh hình thái trong các hệ thống ni cấy. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao dẫn
đến sự hình thành rễ và phát sinh callus để tạo phôi, trong khi trường hợp ngược
lại sẽ dẫn đến sự hình thành chồi.
Nói chung, các chất điều tiết sinh trưởng là các yếu tố không thể thiếu đối
với quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Tác dụng của nguồn cacbon đến sự hình thành củ in vitro
Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do khơng
quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngồi. Vì vậy, cần
cung cấp đường (phổ biến nhất là saccharose) để mô, tế bào thực vật tổng hợp
các chất hữu cơ cần thiết giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối.
Sự hình thành củ là một quá trình sinh lý phức tạp, liên quan mật thiết đến
trạng thái ngủ nghỉ và năng lượng dự trữ (đường) của mô nuôi cấy. Do đó, để tạo
củ thì vấn đề quan trọng nhất là xác định được các yếu tố cảm ứng để q trình

ngủ nghỉ xảy ra. Ngồi việc cảm ứng ngủ nghỉ bằng các chất điều tiết sinh trưởng
(các chất ức chế sinh trưởng - retardants), đường cũng có vai trị quan trọng trong
q trình tạo củ in itro. Nó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của mơi trường, tức là
tác động vào áp lực nước đối với mô tế bào đang biệt hóa và kích thích chúng
phát triển (Kumar S. et al., 2005). Nồng độ đường khi tạo củ thông thường dao
động từ 4 đến 6% (Hoque, 2010), tùy thuộc lồi và loại mơ ni cấy. Tuy nhiên,
một số lồi có thể cần nồng độ đường cao hơn, đến 9 - 12%, thí dụ đối với Lilium
(Mei-Lan L et al., 2003; Staikidou I et al., 2005).

14