Xây dựng và đánh giá quy trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------

VÕ THỊ MINH THƢƠNG

XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

C
C
R
UT.L

D

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Mã số : 60.54.01.01

TÓM TẮT LUẬN VĂN
THẠC SĨ KỸ THUẬT

Đà Nẵng, Năm 2020


Cơng trình đƣợc hồn thành tại

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Mạc Thị Hà Thanh

Phản biện 1: TS. Nguyễn Thị Đông Phương
Phản biện 2: TS. Đỗ Chí Thịnh

C
C
R
UT.L

D

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt
nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, họp tại Đại
học Bách khoa vào ngày 26 tháng 12 năm 2020

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm Học liệu và Truyền thông trường Đại học Bách khoa Đại học Đà Nẵng
- Thư viện Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa
- Đại học Đà Nẵng


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Trên thị trường hiện nay, thực phẩm có sử dụng phụ gia làm chất
bảo quản chiếm tỷ lệ lớn, việc sử dụng chất bảo quản có thể ngồi
danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lượng quy định. Tác hại do
sử dụng chất bảo quản sai quy định có thể ảnh hưởng đối với sức
khỏe con người. Những tác động này thường khơng xảy ra cấp tính,

rầm rộ và nguy kịch mà diễn biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Có
rất nhiều loại hợp chất bảo quản được sử dụng như axit benzoic; natri
benzoat và các loại benzoat thay thế (kali benzoatvà canxi benzoat);
kali sorbat; natri metabisulfite; natri sulfite....

C
C
R
UT.L

Trong số đó nhóm benzoat và sorbat là những chất bảo quản được
phép sử dụng rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm với một giới hạn

D

nhất định. Tuy nhiên, việc lạm dụng quá mức cho phép hai nhóm
chất bảo quản này sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Theo
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), liều lượng natri benzoat tối đa mà cơ
thể có thể xử lý được là 5 mg/kg thể trọng mỗi ngày.Liều lượng gây
độc ở người là 6 mg/kg thể trọng. Cơ quan An toàn Thực phẩm châu
Âu (EFSA) khuyến cáo lượng tiêu thụ kali sorbat an toàn với con
người là dưới 25 mg/kg trọng lượng mỗi ngày [1].
Hiện nay, việc kiểm tra các chất bảo quản trong thực phẩm là một
trong những nội dung của công tác kiểm tra, giám sát chất lượng vệ
sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam nói chung cũng như Quảng Ngãi
nói riêng.
Cho đến nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã
được triển khai và chuẩn hóa tại phịng thí nghiệm, bao gồm các

2
phương pháp xác định riêng từng chất bảo quản và các phương pháp
xác định đồng thời các chất bảo quản: phương pháp chuẩn độ [2],
phương pháp sắc ký lớp mỏng [3], phương pháp quang phổ [4], và
sắc ký lỏng hiệu năng cao [5, 6]. Do vậy, việc các phịng thí nghiệm
cần nghiên cứu xây dụng quy trình phân tích góp phần vào việc giám
sát chất lượng thực phẩm là rất cần thiết.
Việc kiểm tra các chất bảo quản nhóm benzoat và sorbat trong
thực phẩm thường được tiến hành bằng các phương pháp khác nhau.
Tuy nhiên, các phương pháp xác định đồng thời hai nhóm chất bảo
quản này chỉ là phương pháp nội bộ của một số phịng thí nghiệm.
Cho đến nay, hệ thống TCVN chỉ xây dựng và ban hành phương
pháp xác định đồng thời hai chất bảo quản này trong từng nền mẫu

C
C
R
UT.L

riêng lẻ. Bản thân những phương pháp này mới chỉ đáp ứng một
phần nhỏ yêu cầu về mặt kỹ thuật, nếu muốn triển khai áp dụng tại

D

đơn vị cần phải được đánh giá thực nghiệm về sự phù hợp của
phương pháp khi áp dụng trong toàn nền mẫu thực phẩm cũng như
điều kiện thực tế của đơn vị.
Vì vậy, lựa chọn một quy trình phân tích phù hợp với điều kiện
tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Quảng Ngãi
để xác định đồng thời các chất bảo quản nhóm benzoat và sorbat

trong thực phẩm lưu thông trên thị trường là yêu cầu xuất phát từ
thực tiễn.
Qua các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, để định lượng đồng
thời benzoat và sorbat trong thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao có nhiều ưu điểm vượt trội. Phương pháp này có độ
nhạy, độ chính xác cao, thao tác đơn giản. Trong đề tài này chúng tôi
lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để nghiên cứu.


3
Hơn nữa công tác quản lý, giám sát chất lượng vệ sinh an toàn
thực phẩm trên địa bàn tỉnh năm 2018 như sau:
- Công tác giám sát mối nguy và hậu kiểm: Số mẫu lấy kiểm tra là
186, trong đó 18 mẫu chả thịt, 08 mẫu chả cá, 02 mẫu bánh tráng
mỏng, 04 mẫu hủ tiếu sợi…. Kết quả 11 mẫu chả thịt có sử dụng chất
bảo quản nhưng khơng công bố chất lượng sản phẩm, 01 mẫu chả tự
công bố chất bảo quản Natri bezoat nhưng vượt quy định, 04 mẫu hủ
tiếu sợi sử sụng chất bảo quản nhưng chưa công bố sản phẩm [7].
- Năm 2018, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực
phẩm Quảng Ngãi,áp dụng quy trình định lượng riêng chất bảo quản
natri benzoat trong 50 mẫu thực phẩm trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi

C
C
R
UT.L

(gồm sản phẩm chả các loại, cá bống đã chế biến, thịt bị khơ, sợi hủ
tiếu), kết quả có 46/50 mẫu phát hiện có sử dụng chất bảo quản natri

D

benzoat (chiếm 92% ), trong đó 10/50 mẫu (chiếm 20%) có hàm
lượng vượt giới hạn cho phép.

Vấn đề đặt ra cần có những cơng cụ kỹ thuật thuận lợi góp phần
vào việc đánh giá tình trạng sử dụng benzoat và sorbat làm chất bảo
quản trong thực phẩm nhằm cung cấp số liệu cơ bản cho các cơ quan
chức năng để thực hiện tốt công tác giám sát chất lượng thực phẩm
trên địa bàn tỉnh nhà.
Vì lý do trên, tơi thực hiện đề tài “Xây dựng và đánh giá quy
trình phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng benzoat và sorbat trong
thực phẩm có độ chính xác cao


4
- Đánh giá quy trình phân tích đã được xây dựng (theo tiêu chuẩn
AOAC về thầm định phương pháp phân tích); từ đó, ứng dụng vào
việc xác định hàm lượng benzoat và sorbat trong một số sản phẩm
thực phẩm.
3. Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
 Đối tượng nghiên cứu
Các thông số đặc trưng của phương pháp HPLC: Hệ số đối xứng,
hệ số phân giải, cột phân tích, bước sóng, tốc độ dịng, thành phần và
tỷ lệ pha động.
- Các dung dịch chuẩn natri benzoat và kali sorbat được bảo quản
theo thời gian.

C
C
R
UT.L

- Mẫu thực phẩm phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm:

D

+ 5 nền mẫu tự tạo dùng để xây dựng và thẩm định quy trình phân
tích benzoat và sorbat trong thực phẩm (được đặt mua theo u cầu
và được kiểm chứng tại phịng thí nghiệm khơng có chất benzoat và
sorbat) được bổ sung chính xác 1 lượng chất chuẩn natri benzoat và
kali sorbat:
Thực phẩm nhóm lỏng (N1): Nước yến
Thực phẩm nhóm giàu đường (N2): Bánh
Thực phẩm nhóm giàu chất xơ (N3): Quả sấy khơ
Thực phẩm nhóm giàu protein, (N4): Chả thịt heo
Thực phẩm nhóm giàu béo, (N5): Phô mai


5
+ Các sản phẩm thực phẩm được mua tại các cơ sở buôn bán trên địa
bàn thành phố Quảng Ngãi (thông tin chi tiết về các mẫu thực phẩm
xem tại phụ lục 6).
 Phạm vi nghiên cứu
- Xây dựng quy trình phân tích được thực hiện tại phịng thí
nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm
tỉnh Quảng Ngãi.

- Phân tích một số thực phẩm được lấy tại thành phố Quảng
Ngãi từ tháng 1/2020 đến tháng 5/2020.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu

C
C
R
UT.L

- Xác định benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp
HPLC.

D

- Đánh giá năng lực của quy trình phân tích benzoat và sorbat trong
thực phẩm theo tiêu chuẩn ARL 05 và tiêu chuẩn AOAC.
- Xử lý số liệu thống kê bằng phần mềm xử lý số liệu modde 5.0,
minitab 17 (hãng Minitab Inc) và các bảng tính bằng excel 2010 (của
Microsoft).
5.

ngh


ho học và thực ti n c

đề tài nghiên cứu

nghĩa khoa học
- Đóng góp vào kho tài liệu thơng tin khoa học về cơng cụ

phân tích benzoat và sorbat trong thực phẩm.
- Xây dựng hướng dẫn nội bộ về quy trình phân tích các chất
bảo quản nhóm benzoat và sorbat trong thực phẩm áp dụng tại Trung
tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Quảng Ngãi.


6


nghĩa thực tiễn của đề tài
- Đối với cơ quan quản lý nhà nước, sản phẩm của đề tài là

cơ sở tham khảo để phục vụ công tác quản lý chất lượng vệ sinh an
toàn thực phẩm trên địa bàn tỉnh.
- Đưa ra được hạn dùng của các dung dịch chuẩn; từ đó
mang lại lợi ích kinh tế cho các đơn vị sử dụng quy trình phân tích đã
được xây dựng.
6. Bố cục c a luận văn
Luận văn gồm những chương mục sau:
Đặt vấn đề

C
C
R
UT.L

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

D

Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận
Kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


7

CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1. MỘT SỐ QUY ĐỊNH LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT BẢO
QUẢN THỰC PHẨM
Năm 2010, Bộ Y tế ban hành quy chuẩn quốc gia (QCVN 412:2010/BYT) về phụ gia thực phẩm – chất bảo quản, quy định các
yêu cầu kỹ thuật và quản lý về chất lượng, vệ sinh an toàn đối với
các chất bảo quản được sử dụng với mục đích làm phụ gia thực phẩm
[8].
Thơng tư 05/2018/TT-BYT ngày 05 tháng 04 năm 2018 của Bộ
trưởng Bộ Y tế ban hành danh mục thực phẩm, phụ gia thực phẩm,
chất hỗ trợ chế biến thực phẩm và dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa

C
C
R
UT.L

đựng thực phẩm được xác định mã số hàng hóa theo danh mục hàng
hóa xuất khẩu, nhập khẩu Việt Nam [10].

D

Thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 30/8/2019 của Bộ trưởng Bộ Y
tế quy định về quản lý và sử dụng phụ gia thực phẩm ban hành [11].

1.2. KHÁI QT VỀ NHĨM CHẤT BẢO QUẢN BENZOAT
VÀ SORBAT
1.2.1. Nhóm Benzoat
1.2.2. Nhóm Sorbat

1.3. MỘT SỐ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CHẤT
BẢO QUẢN NHÓM BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC
PHẨM
1.3.1. Một số quy trình xác định benzoat và sorbat ở nước ngồi
bằng kỹ thuật HPLC


8
1.3.2. Một số quy trình xác định benzoat và sorbat bằng kỹ thuật
HPLC thường được áp dụng tại Việt Nam

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
HPLC
1.4.1. Hệ thống bơm
1.4.2. Bộ phận tiêm mẫu
1.4.3. Cột phân tích (HPLC colum) chứa pha tĩnh
1.4.4. Pha động
1.4.5. Detector
1.4.6. Các thông số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

C
C
R
UT.L

1.5. TỔNG QUAN VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH

D

1.5.1. Tính tương thích của hệ thống
1.5.2. Tính đặc hiệu (Specifility)/Tính chọn lọc
1.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
1.5.4. Độ đúng (Trueness) hay còn gọi là độ thu hồi
1.5.5. Độ chính xác (Precision)
1.5.6. Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)
1.5.7. Giới hạn định lượng (Limit of Quatitation – LOQ)

1.5.8. Độ không đảm bảo


9

CHƢƠNG 2- ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, DUNG MƠI, HĨA CHẤT
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình phân tích định lượng benzoat và sorbat trong
thực phẩm:
+ Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình đã cơng bố
+ Lựa chọn, xây dựng điều kiện sắc ký
+ Xây dựng Quy trình xử lý mẫu

C
C
R
UT.L

- Đánh giá năng lực quy trình phân tích:

D

+ Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích
o

Tính tương thích hệ thống

o

Độ đặc hiệu

o

Tính tuyến tính

o

Độ chụm (độ lặp lại và độ tái lập)

o

Độ chính xác (độ thu hồi)

o

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

o

Ước lượng độ không đảm bảo đo

+ Đánh giá hạn dùng theo thời gian của dung dịch chuẩn natri
benzoat và kali sorbat được chuẩn bị theo quy trình xử lý mẫu đã
xây dựng.


10
+ Ứng dụng quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng
benzoat và sorbat trong thực phẩm.

2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Xây dựng quy trình phân tích định lượng benzoat và sorbat
trong thực phẩm
2.4.1.1. Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình xác định
benzoat và sorbat trong thực phẩm đã công bố
2.4.1.2. Phương pháp xử lý mẫu
2.4.1.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Xác định bƣớc sóng đo benzo t và sorb t

C
C
R
UT.L

Bảng 2.1. Ma trận bố trí thí nghiệm 1

D

Các yếu tố
Pha động

Điều kiện thí nghiệm

- Thành phần pha động

MeOH : Muối acetat

- Tỷ lệ pha động

10 : 90

Bước sóng

λ 1 = 227 nm; λ 1 = 250 nm

Tốc độ dòng

1 ml/phút

Nhiệt độ cột

300C

Thể tích tiêm

20 µl

Đánh giá kết quả: Dựa vào kết quả sắc ký đồ của phổ UV-VIS, chọn
bước sóng cho tín hiện rõ nhất, chiều cao tương đối lớn và có độ tinh
khiết của píc phù hợp.


11
Thí nghiệm 2: Lựa chọn cột sắc ký
Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm 2
Điều kiện thí nghiệm

Các yếu tố
Loại cột

Khảo sát trên 9 cột, bản chất cột chứa
Octadecyl Silane hoặc Octyl Silane, chiều dài
cột và các hãng sản xuất cột khác nhau

Pha động
- Thành phần

MeOH : Muối acetat

- Tỷ lệ (v/v)

10 : 90

Tốc độ dòng

1 ml/phút

Nhiệt độ cột

300C

Thể tích tiêm

C
C
R
UT.L

D

Bước sóng

20 µl

Chọn từ kết quả của thí nghiệm 1

Đánh giá kết quả: Đánh giá hệ số đối xứng và hệ số phân giải của

píc benzoat và sorbat, thời gian lưu của hai pic chính, lựa chọn cột
phân tích phù hợp.
Thí nghiệm 3: Xác định thành phần, nồng độ muối amoni acetat
trong ph động và tỷ lệ ph động
Bảng 2.3. Ma trận bố trí thí nghiệm 3
Các yếu tố
Thành phần pha động gồm
(MeOH – Dung dịch amoni

Điều kiện thí nghiệm


12
acetat xM)
- Nồng độ dung dịch amoni 0,005M; 0,01M; 0,02M; 0,03M
acetat xM
- Tỷ lệ pha động (v/v)

(20 : 80); (10 : 90); (7 : 93); (5 : 95)

Tốc độ dòng

1 ml/phút

Nhiệt độ cột

300C

Thể tích tiêm

20 µl

Bước sóng

Từ kết quả của thí nghiệm 1

Cột sắc ký

Từ kết quả của thí nghiệm 2

C
C
R
UT.L

Kết quả: Dựa vào kết quả sắc ký đồ để đánh giá hệ số đối xứng, hệ
số phân giải, thời gian lưu của hai pic chính benzoat và sorbat, lựa

D

chọn nồng độ muối của dung dịch và tỷ lệ thích hợp.
Thí nghiệm 4: Xác định tốc độ dịng

Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện xử lý mẫu thử thực phẩm
2.4.2. Đánh giá năng lực quy trình phân tích đã xây dựng
2.4.2.1. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích đã xây
dựng
2.4.2.2. Xác định hạn dùng của dung dịch chuẩn benzoat và sorbat

13
Điều kiện thí nghiệm

Các yếu tố
Nhóm số liệu 1:

Nồng độ benzoat: 9,4µg/ml;

Hàm lượng benzoat tính

18,96µg/ml; 28,45µg/ml; 37,93µg/ml;

theo chuẩn cũ

94,82µg/ml

Hàm lượng Sorbat tính

Nồng độ sorbat: 10,29 µg/ml; 20,58
µg/ml; 30,87 µg/ml; 41,16 µg/ml;

theo chuẩn cũ

102,9 µg/ml
Nhóm số liệu 2:
Hàm lượng benzoat tính
theo chuẩn mới

Nồng độ natri benzoat 50 µg/ml
Kali sorbat 97 µg/ml

C
C
R
UT.L

Hàm lượng Sorbat tính
theo chuẩn mới

D

Thời gian khảo sát

Quy trình xử lý mẫu

Tháng 4/2020 – 6/2020

Theo kết quả quy trình xử lý mẫu đã
được xây dựng

Điều kiện sắc ký

Theo kết quả điều kiện sắc ký đã được
xây dựng

Đánh giá kết quả:
- Dựa vào diện tích píc của dung dịch chuẩn và dung dịch thử xác
định hàm lượng natri benzoat và kali sorbat.
- Đánh giá sự khác biệt của hai phương pháp này có ý nghĩa hay
khơng, ở mức ý nghĩa α = 5% thông qua hai dãy số liệu về về hàm

lượng natri benzoat và kali sorbat.


14
2.4.2.3. Ứng dụng quy trình phân tích đã được xây dựng để phân tích
mẫu thực phẩm mua ngồi thị trường

2.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsolt Excell.
- Số liệu thực nghiệm trong nội dung xác định quy trình xử lý mẫu
được phân tích bằng phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm bằng phần
mềm Modde 5.0.
- Số liệu thực nghiệm tại kết quả xác định hạn dùng của các dung
dịch chuẩn benzoat và sorbat được xử lý bằng phần mềm thống kê
Minitab 17

C
C
R
UT.L

- Mức ý nghĩa α = 0,05

D


15

CHƢƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG

BENZOAT VÀ SORBAT TRONG THỰC PHẨM
3.1.1. Đánh giá khả năng tương thích của các quy trình xác định
benzoat và sorbat trong thực phẩm đã được công bố
Ba quy trình phân tích có điều kiện phân tích tương đối phù hợp
với phịng thí nghiệm của đơn vị để khảo sát.
Kết quả cho thấy:
- Thời gian xuất hiện các pic chính nhanh, cịn dính nhiều pic phụ
khi phân tích trên nền mẫu thực phẩm.

C
C
R
UT.L

- Tín hiệu pic khơng cân đối, chân píc bị kéo đi .
- Bên cạnh đó đánh giá kết quả hệ số đối xứng
Nhận xét

D

Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [25] và tiêu
chuẩn AOAC [26], phép thử đạt yêu cầu khi kết quả về số đĩa lý
thuyết ≥ 2000 và hệ số đối xứng (As) phải trong khoảng 0,8 ≤ As ≤
1,2.
Do vậy, ba quy trình phân tích trên chưa tương thích trong điều
kiện của đơn vị khi phân tích đồng thời benzoat và sorbat trên nền
mẫu thực phẩm.
3.1.2. Xây dựng các điều kiện sắc ký cho quy trình phân tích
benzoat và sorbat trong thực phẩm
3.1.2.1. Xác định bước sóng phát hiện cho các chất phân tích với

detector PDA


16

3.1.2.2. Ảnh hưởng cột sắc ký lỏng đến tín hiệu píc benzoat và
sorbat
Trong q trình nghiên cứu và thực nghiệm lâu dài, có thể kết
luận: Cột Purospher Star RP-8e (5μm; 250 x 4.6mm) thích hợp và
khả năng đáp ứng pic, khả năng tách của cột tốt và được sử dụng
trong các nghiên cứu tiếp theo trong quy trình định lượng benzoat và
sorbat trong thực phẩm.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối, tỷ lệ pha động đến hệ số đối
xứng và khả năng tách của píc benzoat và sorbat


Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4COOCH3 trong pha

C
C
R
UT.L

động đến sự cân đối và khả năng tách của píc benzoat và sorbat
Kết quả

D

- Thành phần pha động gồm muối CH3COONH4 0,02M – MeOH.
- Điều này phù hợp với tính chất phân cực của benzoat và sorbat.

- Muối CH3COONH4 0,02M có pH khoảng 7 nên rất ổn định khi
chạy trên máy sắc ký lỏng.
Kết luận: Pha động gồm dung dịch muối NH4COOCH3 0,02M MeOH là phù hợp để tiến hành phân tích định tính, định lượng
benzoat và sorbat trong thực phẩm.


Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trong pha động đến sự cân

đối và khả năng tách píc benzoat và sorbat


17
Kết luận: Thành phần pha động gồm NH4COOCH3 0,02M MeOH (93 : 7), (v/v) là phù hợp nhất để định tính, định lượng đồng
thời benzoat và sorbat trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC


Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến sự cân đối và khả năng

tách píc benzoat và sorbat
Kết quả lựa chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho quá trình nghiên
cứu tiếp theo. Ở tốc độ 1,0 ml/phút thì các píc benzoat và sorbat có
hệ số đối xứng 1,00 và 0,96 tốt nhất và đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn
Dược điển Việt Nam [25] và tiêu chuẩn AOAC [26]. Thời gian lưu
của các chất phân tích khơng q dài, áp suất bơm cũng phù hợp cho
quá trình chạy sắc ký.

C
C
R
UT.L

Kết luận chung:

Kết quả khảo sát và lựa chọn điều kiện cho quá trình chạy sắc ký

D

HPLC để định lượng đồng thời nhóm benzoat và sorbat với đầu dị
PDA như sau:
- Cột tách: Purospher RP-8e (5μm; 250 x 4,6mm)
- Hệ pha động: MeOH : NH4COOCH3 0,02M (7:93), (v/v)
- Bước sóng: 230nm đối với benzoat và 250nm đối với sorbat
- Thể tích tiêm: 20µl
- Tốc độ dịng: 1,0ml/phút
- Nhiệt độ cột: Lựa chọn 30oC
3.1.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm dùng trong phân
tích benzoat và sorbat


18
3.1.3.1. Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu của benzoat và sorbat trong
mẫu tự tạo
Kết quả điều kiện về tỷ lệ dung môi chiết xuất, thời gian và nhiệt
độ thủy phân nhằm chiết xuất hàm lượng natri benzoat thu cao nhất
- Tại giá trị X1 = 24,48 (Dung môi MeOH %) có nghĩa là dung mơi
chiết mẫu gồm MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v;
- Giá trị X2 = 53,74 (Nhiệt độ chiết) được xác định là nhiệt độ thủy
phân đạt 540C;
- Giá trị X3 = 45,22 (thời gian chiết) được hiểu là thời gian siêu âm:
45 phút.

C
C
R
UT.L

- Với các điều kiện trên hàm lượng natri benzoat được chiết xuất có
tỷ lệ thu hồi 100,3%. Hàm lượng axit sorbic được chiết xuất có tỷ lệ
thu hồi 100,0%.

D

Như vậy: Điều kiện phù hợp nhất để chiết xuất hàm lượng natri
benzoat và axit sorbic cao nhất là MeOH - Nước tỷ lệ (24 : 76), v/v;
Nhiệt độ siêu âm: 540C; Thời gian siêu âm: 45 phút.
3.1.3.2. Đánh giá quy trình xử lý mẫu được thiết lập
Tỷ lệ thu hồi hàm lượng chuẩn natri benzoat trong mẫu tự tạo từ
98,9% đến 100,2% và tỷ lệ thu hồi axit sorbic từ 99,5 % đến 100,9%;
điều này cho thấy hiệu suất chiết natri benzoat và axit sorbic trong
mẫu thực phẩm là rất cao, thu hồi gần như hoàn toàn hàm lượng natri
benzoat và axit sorbic chuẩn được thêm vào nễn mẫu thực phẩm.

3.2. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG
NHĨM BENZOAT VÀ SORBAT


19
3.2.1. Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích
3.2.1.1. Tính tương thích hệ thống
3.2.1.2. Đánh giá Độ đặc hiệu (Tính đặc hiệu)

3.2.1.3. Đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính
3.2.1.4. Đánh giá Độ chụm (Độ lặp lại, độ tái lặp nội bộ hay cịn gọi
độ chính xác trung gian)
3.2.1.5. Độ đúng (độ thu hồi)
Nồng độ phân tích
Thơng số
thẩm định

Mức thêm vào

Mức thêm vào

Mức thêm vào

50%

100%

200%

C
C
R
T.L

DU

Độ thu hồi:

96,7 -106,1%

96,4 – 103,6%

96,3-103,7%

- Benzoat:

95,0 – 103,6%

96,2 – 105,4%

96,4 – 105,1

- Sorbat:
Yêu cầu

Từ 90%-107%

Từ 95%-105%

- Tỷ lệ thu hồi trên 5 nền mẫu tại 3 mức nồng độ tương đối tốt.
Như vậy quy trình phân tích được xây dựng để định tính, định lượng
đồng thời benzoat và sorbat đã thể hiện độ lặp lại, độ đúng tốt.
3.2.1.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

3.2.1.7. Đánh giá độ không đảm bảo đo (KĐBĐ)
3.2.2. Xác định hạn dùng của dung dịch chuẩn (độ ổn định của
dung dịch chuẩn)

20
Các yếu tố

Hàm lƣợng %

Hàm lƣợng %

(Benzoat)

(Sorbat)

(a)

Hàm lượng tính theo

83,087 ± 0,299

(a)

99,369

± 0,24

chuẩn cũ
(a)

Hàm lượng tính theo

(a)

83,323 ± 0,216

99,459

± 0,242

P-Value = 0,093

P-Value = 0,468

chuẩn mới

Kết luận: Dung dịch chuẩn chứa natri benzoat và kali sorbat được ổn
định và khơng có hiện tượng thay đổi nồng độ trong thời gian nghiên

C
C
R
UT.L

cứu từ 31/3/2020 đến 2/6/2020.

D

Đây là một nội dung nghiên cứu có tính mới so với các nghiên
cứu đã cơng bố trước đây về quy trình định tính, định lượng benzoat
và sorbat trong thực phẩm.
3.2.3. Áp dụng quy trình phân tích benzoat và sorbat được xây
dựng để kiểm tra mẫu trên thị trường
Kết quả phân tích trên 20 lượt mẫu thực phẩm được lấy tại chợ

tỉnh Quảng Ngãi
- Phát hiện có 1 mẫu khảo sát khơng đạt hàm lượng benzoat
- Có 7/20 mẫu thực phẩm có sử dụng cả hai nhóm chất bảo quản
benzoat và sorbat.
- Có 5/20 mẫu thực phẩm có sử dụng chất bảo quản nhóm
benzoat.


21
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã đạt được như sau:
Xây dựng quy trình phân tích
- Điều kiện phân tích sắc ký
+ Cột: Purospher RP - 8e (5μm; 250 x 4,6mm)
+ Hệ pha động: MeOH - NH4COOCH3 0,02M (7:93), (v/v)
+ Bước sóng: 230nm đối với benzoat và 250nm đối với sorbat
+ Thể tích tiêm: 20µl
+ Tốc độ dịng: 1,0ml/phút

C
C
R
UT.L

+ Nhiệt độ cột: 30oC

D

- Đề xuất quy trình xử lý mẫu thực phẩm để định lượng benzoat và
sorbat gồm các thông số ký thuật sau:

+ Dung môi chiết mẫu gồm MeOH - H2O (24:76), (v/v)
+ Thời gian chiết mẫu (thời gian chiết siêu âm): 45 phút
+ Nhiệt độ chiết mẫu: 540C
Đánh giá quy trình phân tích
- Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình phân tích


22
Thơng số đánh giá

Benzoat

Sorbat

- Thời gian lưu (%RSD)

0,30

0,34

- Diện tích pic (%RSD)

0,34

0,23

- Hệ số đối xứng

1,01

0,97

Tính tương thích hệ thống
(n=6):

- Độ phân giải
Tính đặc hiệu

8,77

-

Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng

không xuất hiện pic ở trong khoảng thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu

C
C
R
UT.L
của chất chuẩn.

D

- Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn xuất
hiện pic rõ ràng, thời gian lưu 6,873
phút đối với benzoat và 9,190 phút đối
với sorbat.

-

Sắc ký đồ của nền mẫu trắng thêm

chuẩn xuất hiện pic rõ ràng có thời gian
lưu của
benzoat và sorbat lần lượt là 6,871 phút
và 9,088 phút.
Khoảng tuyến tính

0,83 - 166,25

0,52 - 207,00

(µg/ml)

(µg/ml)

R2 = 1

R2 = 0,9995


23
Thông số đánh giá

Benzoat

Sorbat

Độ lặp lại

%RSDMax: 1,08%

Độ tái lập

%PRSDMax: 2,0% %PRSDMax: 1,2%

Độ đúng (độ thu hồi)

96% - 106%

95% - 105%

Giới hạn phát hiện

LOD: 0,88 µg/ml

LOD: 0,40 µg/ml

LOQ: 1,10 µg/ml

LOQ: 0,60µg/ml

%RSDMax: 0,41%

(LOD),
giới hạn định lượng
(LOQ)

Độ không đảm bảo đo mở U% (k=2; P=95%): U% (k=2; P=95%):
rộng

C
C
R
.L
1,2 – 2,0

1,5 – 3,1

DUT

Xác định hạn dùng c a dung dịch chuẩn

Kết quả nghiên cứu đã có cơ sở ban đầu khẳng định được thời gian
ổn định và không thay đổi nồng độ của dung dịch chuẩn trong thời
gian 2 tháng. Điều này mang lại nhiều lợi ích về mặt kinh tế và thời
gian cho người sử dụng. Có thể nói nội dung nghiên cứu này thể hiện
một điểm mới so với các nghiên cứu đã cơng bố trước đây.
Ứng dụng quy trình để xác định hàm lƣợng benzoat và sorbat
trong thực phẩm đƣợc mua tại chợ tỉnh Quảng Ngãi
Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng nhóm benzoat và
nhóm sorbat trong sản phẩm thực phẩm lấy trên thị trường, phát hiện
01 mẫu khơng đạt về giới hạn benzoat (tính theo hàm lượng acid
benzoic được quy định tại thông tư 24/2019/TT-BYT ngày
16/10/2019).