Nghiên cứu quy trình tinh sạch và xác định hàm lượng enzyme superoxide dismutase chứa đồng, kẽm (cu, zn SOD) từ hồng cầu người hiến máu tại bệnh viện nhân dân gia định
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (867.21 KB, 105 trang )
Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
------------------------------
HỌC VIÊN : NGUYỄN THỊ THU THỦY
MÃ SỐ : CNTP 12 - 028
TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH
VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG
ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE
CHỨA ĐỒNG, KẼM (Cu,Zn-SOD)
TỪ HỒNG CẦU
NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÃ SỐ NGÀNH : 2 . 11 .00
LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP HỒ CHÍ MINH , Tháng 7 naêm 2003
CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học:
TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
Cán bộ chấm nhận xét 1:
PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯNG
Cán bộ chấm nhận xét 2:
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Luận văn thạc só được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, Ngày_____tháng _____ năm 2003
Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---------------------------------------------------
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Ngày tháng năm sinh:
09 – 08 – 1977
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM.
Giới tính: Nữ
Nơi sinh: Thanh Hóa
I - TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM
LƯNG ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE CHỨA ĐỒNG KẼM TỪ
TẾ BÀO HỒNG CẦU CỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BỆNH VIỆN NHÂN
DÂN GIA ĐỊNH.
II - NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM
LƯNG ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE CHỨA ĐỒNG KẼM TRONG TẾ
BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH.
III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
20- 2- 2003
IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
30- 7- 2003
V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO.
VI - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 1:
PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯNG
VII - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ CHẤM NHẬN XÉT 2:
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CÁN BỘ NHẬN XÉT 1
CÁN BỘ NHẬN XÉT 2
Nội dung và đề cương luận văn thạc só đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua
Ngày……..tháng…….năm 2003
TRƯỞNG PHÒNG QLKH- SĐH
CHỦ NHIỆM NGÀNH
LỜI CÁM ƠN
Để có được bài báo cáo này, chúng tôi đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ của rất nhiều đơn vị và cá nhân. Chính vì thế chúng tôi muốn gởi
nơi đây lòng chân thành cám ơn đến tất cả những người đã tân tình giúp đỡ
chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Chúng tôi xin chân thành cám ơn Cô giáo hướng dẫn của chúng tôi là
TS. Đống Thị Anh Đào người đã tận tâm hướng dẫn và trao cho chúng tôi
rất nhiều kiến thức về lónh vực nghiên cứu. Cô đã theo sát chúng tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu và cho chúng tôi nhiều lời khuyên bổ ích.
Chúng tôi chân thành cám ơn qúy Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực
Phẩm là những người đã trang bị cho chúng tôi những kiến thức cơ bản để
thực hiện nghiên cứu này.
Chúng tôi xin cám ơn Ban Lãnh Đạo cùng toàn thể cán bộ công chức
khoa Xét Nghiệm và khoa Vi Sinh BVND Gia Định đã giúp đỡ chúng tôi
rất nhiều trong việc thu thập và xử lý mẫu.
Chúng tôi cũng xin thành thật gởi lời cám ơn đến các đơn vị đã giúp
đỡ cho chúng tôi sử dụng những máy móc thiết bị thí nghiệm như Khoa Vi
Sinh BVND Gia Định, Khoa xét nghiệm thuộc Đội Vệ Sinh Phòng Dịch
Tân Bình, Phòng Thí Nghiệm Hóa Sinh Khoa Công Nghệ Thực Phẩm
Trường Đại Học Bách Khoa TP HCM.
Cuối cùng chúng tôi xin gởi lời cám ơn chân thành đến tất cả các bạn
đồng liêu đã tận tình góp ý, đây là một nguồn động viên tinh thần rất lớn
đối với chúng tôi trong quá trình nghiên cứu.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2003
Nguyễn Khánh Hoàng và Nguyễn Thị Thu Thủy
STUDY ON THE INDEX OF COPPER, ZINC - SUPEROXIDE DISMUTASE
OF THE VIETNAMESE BLOOD DONORS AT GIA DINH HOSPITAL
Dong Thi Anh Dao, Nguyen Khanh Hoang, Nguyen Thi Thu Thuy
Dept. Food Tech., Ho Chi Minh City National University, Technology University
Abstract
Cu, Zn-superoxide dismutase (Cu, Zn-SOD) is an enzyme that catalizes the
decomposition reaction of free radicals produced in the respiratory process of living cells. We
study the procedure to collect Cu, Zn-SOD from the red blood cells of blood donors at Gia
Dinh Hospital and introduce the content of Cu, Zn-SOD in the blood of healthy people.
Initially, we find that the average content is about 1,352 mg/mL of red blood cells or about
0,548 mg/mL of whole blood. Besides we also study a number of pathogenic cases with
positive diagnosis and find that in most cases, there is an increase in the content of Cu, ZnSOD.
Introduction
Equipments: Spectrophotometer,
Superoxide dismutase is an enzyme
Photometer 5010 and centrifugator Jouan.
which was firstly discovered in 1969 by
Assay methods:
J.McCord and I. Fridovich [2]. These
- Protein was measured by Biuret
enzymes catalyse the dismutation reaction:
method.
2 O2- + 2H+
H2O2 + O2
- The protein enzyme concentrations of
The superoxide free radicals are an
Cu, Zn-SOD were determined by method
important toxin by product of oxygen
UV-Vis (at 265nm) [4, 5].
metabolism in living cells. The scientists
- The metal content of enzyme was
have discovered three kind of SOD:
determined
by
atomic
absorption
Cu, Zn-containing superoxide dismutase
spectroscopy.
(Cu, Zn-SOD); Mn-containing superoxide
Experimental process [2]
dismutase (Mn-SOD); Iron-containing
The red cells were collected from
superoxide dismutase ( Fe-SOD).
whole blood by centrifugation, then
The human red cells human has
resuspended and washed in 0.9% NaCl
Cu, Zn-SOD. Our study has found out the
solution two times by centrifugation.
index of concentration Cu, Zn-SOD in red
Exactly 0.2 mL of packed cells were lysed
cells of the blood donors at Gia Dinh
by the addition of an equal volume of
hospital.
water. Hemoglobine was then precipitated
Materials and Methods
from hemolysate by an adaptation of the
Materials are blood of donors at
Cloroform-Ethanol. This mixture was
allowed to stir for 5 min, and became
Gia Dinh hospital. Copper, zinc superoxide
brown. Then the precipitate was removed
dismutase was collected from 511 blood
by centrifugation. The supernatant
samples of healthy human, blood samples
contained Cu, Zn-SOD. Exactly 0.1 mL of
has been mixed with EDTA solution,
supernatant diluted mixed in 2.9mL
stored in tube at 4oC .
phosphate buffer pH 7.8, was measured the
Chemicals: Cu, Zn-SOD;
absorbance at 265nm, and measured total
Mn-SOD; Cytocrom C; Xanthine oxydase;
protein concentration continuely. The
Xanthine purchased from Sigma Co.,
supernalant was purified by method cold
(Germany). Acetone; Ethanol; Cloroform;
Aceton. The supernatant was allowed to
KH2PO4; Na2HPO4 was purchased from
warm to room temperature, and solid of
Merck Co.,. Total protein TF was
KH2PO4 were added, resulting in the
purchased from Diagnostic Co.,.
separation of two liquid phase. A brownish
1
Group
precipitate was present in the lower phase.
The upper phase was collected and
centrifuged. The dilution was cooled to 4oC
and added with cold Aceton to precipitate
the superoxide dismutase. The blue
pricipitate was dissolved in water, then the
dilution was measured the absorbance at
265nm,
and
measured
protein
concentrations.
Result
- We found that protein enzyme
concentration of Cu, Zn-SOD in human
about 1.352 mg/mL red cells, or 0,548
mg/mL whole blood (Table 1 and Fig 1)
Sex
Male
A
1.3526
0.5485
AB
1.3561
0.5502
B
1.3559
0.5513
O
1.3341
0.5431
Table 2. Protein concentration of Cu, ZnSOD in different groups of blood
mg/mlRc
mg/mlWb
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
OD
mg/mL mg/mL
Rc*
Wb*
0,5029
1.352
0.5483
A
Female
0,5031
1,352
0.5480
Table 1. Protein concetrations SOD in red
cells and whole of blood
(*) Rc: Red cells; (*) Wb: whole blood.
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
mg/mL Rc* mg/mL Wb*
AB
B
O
Fig 2. Protein concentrations of Cu, ZnSOD in different groups of blood.
- The line of standard was found by
the relationship between the absorbances at
265nm and total proteins of dilutions. So
we gave out the standard line of
concentration of Cu, Zn-SOD. We chose
the step best purification to give out the
standard line. It has equation: (Fig 3)
Y= 23.618*X +0.1454
Male
Female
OD
mg/mlRc
2.5
2
1.5
1
mg/mlWb
Fig 1. Protein concentrations of Cu, ZnSOD in red cells and whole blood of male
and female donors.
- We found that the protein enzyme
concentrations of Cu, Zn-SOD in red cells
of female is larger than in male, but the
hematocrit of female is less than male, but
the concentrations in whole blood in both
sex are similar (Table 1 and Fig 1).
- Protein concentrations of Cu, Zn-SOD
are similar in different groups of blood
(Table 2 and Fig 2).
y = 23.618x + 0.1454
0.5
0
0
0.05
mg/mL
0.1
Fig 3. The standard line of protein
concentration of Cu, Zn-SOD.
- Besides, we also study a number
of pathogenic cases with positive
diagnostic and has found that in most
cases, there is an increase in the
concentration of Cu, Zn-SOD (Table 3 and
Fig 4)
2
Diagnostic
mg/mL Rc
mg/mL Wb
Tumour
1.4006902
0.549889
Cancer
1.4007517
0.549784
Digestive
1.3587029
0.528098
Pregnant
1.3995976
0.549534
Injured
1.3446054
0.517944
New born
1.345204
0.518786
Normal
1.35216
0.548184
- Our study gives out the ratio yield of
protein in each step purification (Table 4)
Hemolysate
Supernatant
Aceton
precipitate
disolved in
water
Table 3. Concentrations of Cu, Zn-SOD
with a number of diagnostic.
Digestive Injured
Normal
Fig 4. Concentrations of Cu, Zn-SOD with
a number of diagnostic
- We also found that the store time of
samples effects on protein enzyme
concentrate of materials.The concentrate
may be decrease greater than 50% when
the store time greater than 2 weeks. So we
must experience as soon as possible.
i i
1.5
Ne w
y = 5.2556x + 0.3072
1
Old
0 .5
2.26
The standard line of dilution acetone
2
1 .5
1
0.0238796
Discussion
- We saw that the concentrations of
Cu, Zn-SOD in most cases has pathogenic
possive are increased that, may be when
body has not balance (some injured) they
need more protection reagent to help them.
- Total protein concentration in
each step purification show that it has a
relation between concentration of protein
and purification level of Cu, Zn-SOD.
- We have charts of the relation
between the protein concentrations and the
absorbances of the dilution measured in
each step purification. We chose the best
purication step. The next chart showed that
low purification level of the dilution
acetone precipitate disolved in water noncentrifugation.
mg/mL Rc
Tumor
Yield
(%)
100
6.47
Table 4. The ratio yield of protein after
purification
mg/mL Rc
1.45
1.4
1.35
1.3
1.25
Protein
(mg/ mL)
10.5766667
0.06842299
0.5
0
0
mg /mlR c
0
mg /mlW b
0.05
0.1
0.15
0.2
(Fig 5)
Fig 6. The standard line of dilutied acetone
precipitate disolved in water with noncentrifugation
Fig 5. Protein concentrations of Cu, ZnSOD decrease with the stored time of
samples.
3
- Our study find out the concentration of
Cu, Zn-SOD which the method has many
step to purify, so it will be hard to apply in
hospital. We need reseach process more
simple than it to apply easily in hospital. In
addition, we known that there is a relation
between EC-SOD (Extracellular SOD)
[4, 5] and a number of diseases as cancer,
heart deseases, renal deseases, liver
deseases and diabetes. Those has a higher
level than in normal healthy people.
In next study we will use method of
T. Adachi [5] to find out the concentration
of EC-Cu, Zn-SOD to apply for hospital.
Reference
[1]. Nguyen Huu Chan NXB KH-KT 1999.
[2]. J.M.Mc.Cord andI.Fridovich
J.Biol.Chem.1969.244.6049-54
[3]. S.D.Ravidranath and I Fridovich
J.Biol.Chem.1975.250.6107-12
[4]. S.L.Markund
J.Biol.Chem.1976.251.7504-07
[5]. T. Adachi Clin.Chim.Acta
1994.229.123-131
4
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ..............................................................................................1
I .1.GIỚI THIỆU SUPEROXYDE DISMUTASE ......................................................... 1
I.1.1. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN .................................................................................... 1
I.1.2. CẤU TRÚC CỦA SOD...................................................................................... 1
I.1.2.1. Cu,Zn-SOD ............................................................................................... 3
EC-SOD ..................................................................................................... 3
Cu,Zn-SOD .............................................................................................. 4
I.1.2.2. Mn-SOD; Fe-SOD..................................................................................... 6
I.1.3. CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA SUPEROXYDE DISMUTASE................................ 7
I.1.3.1.ĐẶC TÍNH CỦA Cu,Zn-SOD.................................................................... 7
I.1.3.2. ĐẶC TÍNH CỦA Mn-SOD VÀ Fe-SOD................................................... 7
I.1.4. CƠ CHẤT O2- CỦA SOD .................................................................................. 7
I.1.4.1. SỰ HÌNH THÀNH DẠNG OXY HOẠT ĐỘNG....................................... 7
I.1.4.2. TÍNH TÍCH CỰC VÀ TIÊU CỰC CỦA O-2 ................................................................... 9
I.1.5. MỘT SỐ BỆNH LÝ LIÊN QUAN ĐẾN SOD VÀ O-2 ..................................... 9
I.1.6. NGUYÊN LIỆU MÁU .................................................................................... 10
I.1.6.1. TÍNH CHẤT VÀ CHỨC NĂNG CỦA MÁU .......................................... 10
I.1.6.2. HỒNG CẦU ............................................................................................ 12
I.1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PROTEIN .................. 19
I.1.7.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁ VỢ TẾ BÀO .............................................. 19
I.1.7.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH PROTEIN ..................................... 20
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................................27
II.1. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................. 27
II.1.1. NGUỒN THU NHẬN ............................................................................... 27
II.1.2. CÁC CHỈ SỐ YÊU CẦU CỦA NGUYÊN LIỆU ...................................... 28
II.2. HÓA CHẤT THÍ NGHIỆM ................................................................................ 31
II.3. THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM .................................................................................. 31
II.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................ 32
II.4.1. PHÂN TÍCH PROTEIN ............................................................................ 32
II.4.2. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC ................................................. 33
II.4.3.(4) PHÂN TÍCH KIM LOẠI, KHỐI LƯNG PHÂN TƯ .......................... Û37
II.4.5. XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG SOD.............................................................. 37
II.4. 6. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME........................................................... 38
II. 4. 7. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ................................................................... 40
THUYẾT MINH QUY TRÌNH ..................................................................................... 41
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................44
III. 1. KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH TINH SẠCH ............................................................ 44
III. 1. 1. ĐỘ HẤP THU CỦA DUNG DỊCH TẠI BƯỚC SÓNG 265nm ............ 45
III. 1. 2. HOẠT ĐỘ CỦA DUNG DỊCH TINH SẠCH ........................................ 47
III. 1. 3. TỈ LỆ THU NHẬN PROTEIN............................................................... 48
III. 1. 4. HÀM LƯNG KIM LOẠI .................................................................. 50
III. 1. 5. XÁC ĐỊNH KHỐI LƯNG .................................................................. 51
III. 1. 5. 1. SẮC KÝ ĐIỆN DI SDS............................................................... 51
III. 1 5. 2. SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ( LC-MS) ............................ 52
III. 2. XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG CHUẨN ......................................................................... 53
III. 3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG PROTEIN ENZYME .......................................... 57
III. 4. HÀM LƯNG SOD THEO CHẨN ĐOÁN BỆNH .......................................... 64
III. 5. HÀM LƯNG SOD THEO THỜI GIAN LƯU MẪU ...................................... 66
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC ( SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM)
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Trang
BẢNG 1: Một số tính chất của enzyme SOD .......................................................2
BẢNG 2: Thành phần acide amine trong những phân tử enzyme SOD được
phân lập từ những nguồn khác nhau .....................................................................2
BẢNG 3: Thành phần các chất có trong hồng cầu .............................................13
BẢNG 4: Hàm lượng các chất vô cơ có trong hồng cầu .....................................14
BẢNG 5, 7: Thành phần và số lượng mẫu máu người bình thường....................27
BẢNG 6, 8: Thành phần và số lượng mẫu máu theo chẩn đoán ........................27
BẢNG 9: Hoạt độ tổng và hoạt độ riêng của dung dịch bước 1 và 2..................47
BẢNG 10: Tỉ lệ thu hồi protein ở các bước tinh sạch.........................................49
BẢNG 11: Hàm lượng kim loại Cu ,Zn có trong dung dịch bước 1 và 2 ............50
BẢNG 12: Hàm lượng enzyme SOD trong máu và hồng cầu
của người bình thường........................................................................................57
BẢNG 13: Hàm lượng enzyme SOD theo giới tính............................................57
BẢNG 14: Hàm lượng SOD chung cho các nhóm máu ......................................58
BẢNG 15:Hàm lượng SOD của Nam giới theo nhóm máu ................................59
BẢNG 16: Hàm lượng SOD của Nữ giới theo nhóm máu ..................................59
BẢNG 17: Hàm lượng SOD trong máu của Nam giới độ tuổi từ 18-30 .............61
BẢNG 18: Hàm lượng SOD trong máu của Nam giới độ tuổi từ 30-60 .............61
BẢNG 19: Hàm lượng SOD trong máu của Nữ giới độ tuổi từ 18-30 ................61
BẢNG 20: Hàm lượng SOD trong máu của Nữ giới độ tuổi từ 30-60 ................62
BẢNG 21: Hàm lượng SOD theo chẩn đoán bệnh .............................................64
BẢNG 22: Hàm lượng SOD theo thời gian lưu mẫu ...........................................66
DANH MỤC HÌNH ẢNH
HÌNH 1: Cấu trúc cầu nối giữa phân tử Cu và Zn thông qua phân tử Histidine .. 4
HÌNH 2: Cấu trúc của Hemoglobin ....................................................................17
HÌNH 3: Quy trình công nghệ .............................................................................40
HÌNH 4: Độ hấp thu của dung dịch bước 1 tại bước sóng 265 nm......................45
HÌNH 5: Độ hấp thu của dung dịch bước 2 tại bước sóng 265 nm......................46
HÌNH 6: Hình ảnh kết hợp độ hấp thu của dung dịch bước 1&2 tại bước soùng
265 nm ................................................................................................................46
HÌNH 7: Hoạt độ dung dịch bước 1 ....................................................................47
HÌNH 8: Hoạt độ dung dịch bước 2 ....................................................................48
HÌNH 9: Hoạt độ dung dịch bước 1&2 ...............................................................48
HÌNH 10: Hình ảnh sắc ký điện di SDS của dung dịch bước 2...........................51
HÌNH 11: Hình ảnh sắc ký đồ LC-MS của dung dịch bước 2.............................52
HÌNH 12: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu A (không ly tâm) ...........................................54
HÌNH 13: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu B (không ly tâm) .......................................... 54
HÌNH 14: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu AB(khôngly tâm)........................................... 55
HÌNH 15: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 nhóm máu O (không ly tâm) ..........................................55
HÌNH 16: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 Chung các nhóm máu(không ly tâm) ...............................56
HÌNH 17: Đường chuẩn xác định hàm lượng SOD theo độ hấp thu của dung
dịch tinh sạch bước 2 (có ly tâm) .......................................................................56
HÌNH 18:Hàm lượng SOD trong hồng cầu chung cho các nhóm máu ...............58
HÌNH 19: Hàm lượng SOD trong hồng cầu của Nam và Nữ theo nhóm máu ....59
HÌNH 20: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần củaNam và Nữ theo nhóm
máu .....................................................................................................................60
HÌNH 21:Hàm lượng SOD trong hồng cầu Nam giới theo hai độ tuổi ...............62
HÌNH 22: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần Nam giới theo độ tuổi ...........62
HÌNH 23: Hàm lượng SOD trong hồng cầu Nữ giới theo độ tuổi .......................63
HÌNH 24: Hàm lượng SOD trong máu toàn phần Nữ giới theo độ tuổi .............63
HÌNH 25:Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và người có
chẩn đoán bướu , ung thư. .................................................................................. 65
HÌNH 26: Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và trẻ sơ sinh....65
HÌNH 27: Hàm lượng SOD trong hồng cầu người bình thường và
phụ nữ có thai......................................................................................................66
HÌNH 28:Hàm lượng SOD theo thời gian lưu mẫu............................................ 67
LỜI NÓI ĐẦU
Trong thế kỷ XX các ngành khoa học đã có những bước phát triển to
lớn. Hóa sinh là một trong những ngành khoa học đó, với những tiến bộ
khoa học kỹ thuật các nhà khoa học đã tiếp cận và tìm hiểu kỹ các đặc tính
của Enzyme đồng thời đã có nhiều ứng dụng của emzyme được áp dụng
vào thực tế nhằm mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
Ở những sinh vật có chuyển hoá oxy trong chuỗi hô hấp của tế bào
đều có quá trình tạo ra gốc tự do Superoxide( O-2) [1], [2], [3], [9],[17], [33]
đây là nhân tố tạo ra các dạng gốc tự do có tác hại cho tế bào như . OH, và 1
O2 ( gốc tự do OH và oxy đơn phân tử). Tế bào có một hệ thống Enzyme
nhằm loại trừ những tác hại này[24], [26]. Enzyme SOD xúc tác phản ứng
tạo H2O2 , sau đó H2O2 lại được xúc tác bởi enzyme Catalase để tạo thành
H2O và O2. Phản ứng xảy ra như sau:
2 O-2 + 2 H+ SOD
H2O2 + O2 (1).
2 H2 O2
Catalase
H 2O
+ O2 (2).
Bằng nghiên cứu của mình J. McCord và I. Fridovich lần đầu tiên đã
cho chúng ta biết tường tận về Enzyme Superoxide Dismutase[44]. Từ đó
đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về enzyme này với mục đích ứng dụng
vào cuộc sống nhất là ứng dụng trong lónh vực Y học[28], [29], [46]. Những
nghiên cứu còn cho thấy Enzyme SOD còn được phát hiện trong tế bào thực
vật[45], và vi sinh vật[36].
Dựa trên những thành tựu khoa học đã công bố, chúng tôi mạnh dạn
tiến hành đề tài: "Nghiên cứu quy trình tinh sạch và xác định hàm lượng
enzyme Superoxide Dismutase từ tế bào hồng cầu từ những người hiến
máu tại Bệnh viện nhân dân Gia Định TP HCM".
Với nghiên cứu này chúng tôi mong muốn bước đầu có những thông
số kỹ thuật về quy trình công nghệ và các chỉ số về hàm lượng SOD trong
máu của một bộ phận người Việt Nam, nhằm mục đích áp dụng vào thực tế
để giúp công tác lâm sàng chẩn đoán bệnh tốt hơn.
Chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý của những nhà khoa học
chuyên môn với mục đích hoàn thiện nghiên cứu này. Xin thành thật cảm
ơn.
Thành Phố Hồ Chí Minh,tháng 7 năm 2003
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
CHƯƠNG I: TỔNG
QUAN
I. GIỚI THIỆU ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE (SOD):
[40],[44]
I.1. Lịch sử và khái niệm về enzyme SOD:
Enzyme Superoxide Dismutase (được gọi tắt là SOD) là enzyme oxy
hóa khử (oxydoreductase), có chức năng xúc tác phản ứng oxy hóa khử, loại
trừ gốc điện tử tự do superoxide O2- là độc tố oxy được sinh ra trong tế bào
của cơ thể sống có chuyển hóa oxy.
Năm 1938, Mann và Keilin đã tách được một protein mang màu xanh
gần giống với màu của ion Cu2+, có phân tử lượng khoảng 32.000 Da, chứa
khoảng 0,38 % nguyên tố đồng, đã được gọi với những tên như hemocuprein
hoặc erythrocuprein (viết tắt của hemoglobin-cupric-protein hay erythrocytecupro-protein).
Năm 1962, khi O2- và đặc tính của nó được khám phá thì đặc tính xúc tác
của SOD cũng được phát hiện bởi Joe Mccord và Irwin Fridovich.
Đến năm 1968, J. McCord và I. Fridovich đã thực hiện lại thí nghiệm thu
nhận SOD từ hồng huyết cầu của bò và sau đó đã nghiên cứu xác lập được
phương pháp định lượng hoạt tính của SOD, từ đó SOD được khẳng định là
một enzyme.
SOD đã được khẳng định tồn tại trong tế bào sống của các loài sinh vật
hiếu khí, là tác nhân duy nhất có thể giải độc cho tế bào trong việc loại trừ
độc tố superoxide O2- sinh ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào
I.2. Cấu trúc và phân loại enzyme SOD:
SOD thuộc loại metalloprotein, phân tử SOD (holoenzym) bao
gồm trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại (cofactor) và apoenzym. Ion
kim loại gắn ở trung tâm hoạt động có thể là Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Fe2+.
Apoenzym của SOD là chuỗi polypeptid xoắn kép, mỗi chuỗi polypeptid đơn
nối với nhau bởi cầu nối disunfua (-S-S-), một nhóm sulhydryl và một sản
phẩm amino acetyl hóa cuối cùng. Số acid amin và vị trí các acid amin trong
chuỗi polypeptid khác nhau tùy theo nguồn nguyên liệu.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 1
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ÑAØO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
Đặc tính
Trọng lượng
phân tử (Da)
Cấu trúc chuỗi
protein và trọng
lượng phân tử
Hoạt tính riêng
(UI/mg ptotein)
Chất kìm
Hãm enzym
Cu,Zn - SOD
Mn-SOD
y32.000
y135.000 (gian ∼42.000÷85.000
bào)
Fe-SOD
∼42.000 ÷ 85.000
α2
(16.000)
α2 hay α1
(21.000)
α2 hay α1
(21.000)
∼ 3.800
∼ 3.000
∼ 3.000
Cyanua, Azit,
Anions
halogen,
Azit
Diethyldithiocar
ba-mate,
Hydroperoxide
Azit,
Fluor,
Dithizone,
Hydroperoxyde
Bảng 1 : Một số đặc tính của SOD [44]
Teân
acide
Amine
His
Arg
Thr
Ser
Glx
Pro
Gly
Ala
Val
Trp
Ile
Leu
Tyr
Phe
Cys
Met
Lys
Asp
C.fascic
ul-ata
MnSOD
12,5
6,4
19
30,6
36,2
4,1
31,2
55,2
18,2
3,3
13,3
26,7
17,4
17,3
4,1
15,2
27,2
50,4
C.fasc
iculata
FeSOD
9,6
7,6
19,6
28,0
35,1
4,4
28,0
47,6
21,7
5,6
14,4
31,1
17,8
15,7
4,1
14,4
28,6
49,7
mol acide amine/ mol enzyme
Desul E.Coli Chlorob Pecto Eugle
foFei-um
n-ema na Fevibrio SOD
FeFeSOD
FeSOD
SOD
SOD
10
11
12
10
13
8
8
5
3
19
24
26
20
20
23
14
20
19
18
11
36
32
42
32
44
16
18
18
20
25
38
32
33
29
40
44
52
45
48
52
16
22
25
21
22
4
0
5
3
5
14
16
9
5
13
30
29
26
33
32
16
13
18
10
14
24
20
16
25
21
4
2
3
2
9
12
8
12
11
16
32
20
22
24
8
54
45
57
47
39
Cu,Zn
-SOD
của
người
MnSOD
của
người
16
9
15
16
32
12
47
21
28
0
17
20
3
8
7
2
23
33
34
21
21
26
89
40
76
67
46
10
34
64
27
20
10
19
60
90
Bảng 2. Thành phần acide amine trong phân tử enzyme SOD từ các
nguồn gốc thu nhận khác nhau [47]
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 2
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ÑAØO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
Enzyme SOD được phân thành ba loại như sau:
+ Cu,Zn-SOD (copper, zinc-superoxide dismutase): có chứa ion Cu2+ và
ion Zn2+.
+ Mn-SOD (Mangan-superoxide dismutase): có chứa ion Mn2+ .
+ Fe-SOD (Ferri- superoxide dismutase): có chứa ion Fe2+ .
I.2.1. Superoxide Dismutase chứa đồng, kẽm ( Cu,Zn-SOD ). [26],
[29], [40], [44]
Hai loại Enzyme SOD chứa đồng, kẽm đó là EC-SOD và Cu, Zn-SOD:
I.2.1.1 EC-SOD ( Extracellular Superoxide Dismutase) là một Enzyme
chống lại các tác nhân oxy hoá như là các gốc tự do sinh ra trong quá trình hô
hấp của tế bào. Đây là enzyme được thu nhận từ dịch ngoại bào và trong gian
bào. Loại Cu, Zn-SOD tồn tại trong bào tương( EC-SOD) có MR= 135kDa, sẽ
bao gồm hai chuỗi polypeptit xoắn kép (4 chuỗi đơn) và chứa 2÷4 nguyên tử
gam của mỗi loại ion Cu2+ và Zn2+.[40],
Bằng kỹ thuật Elisa( Enzyme Link Immuno Sorbent Assay) các nhà
khoa học ở c, Nhật, Thụy Điển[28], [46] đã đưa ra được các chỉ số EC-SOD
trong người bình thường và trong những người có vấn đề về sức khoẻ. Họ
cũng đã xác định được có sự đột biến điểm trên gene của phân tử EC-SOD
dẫn đến việc biến đổi từ Arg213
Gly. Những trường hợp có đột biến gene
đều cho mức độ EC-SOD > 400ng/ml. Như vậy trong người bình thường được
chia ra thành 2 nhóm :
− Nhóm I có hàm lượng EC thấp EC-SOD < 120ng/ml (55.8 ±18.8ng/ml)
− Nhóm II có hàm lượng EC cao EC-SOD > 400ng/ml
Ngoài ra các nhà khoa học còn thấy rằng EC-SOD còn có các mức độ ái
lực với Heparine khác nhau.
− Type A không có ái lực với Heparine.
− Type B có ái lực yếu với Heparine.
− Type C có ái lực mạnh với Heparine.
Nhóm I có chứa cả 3 Type nhưng nhóm II chủ yếu chứa type C.
Trong các nghiên cứu chúng ta thấy rằng mức độ EC-SOD ở nam (86,6
± 5,1ng/ml) thấp hơn nữ (113,6 ± 13,2ng/ml). Ở người hút thuốc (75,0 ±
9,3ng/ml)thấp hơn người không hút thuốc( 111,7 ± 8,2ng/ml). Bên cạnh đó họ
cũng thấy mức độ EC-SOD sẽ cao hơn so với những người bình thường trong
những người có bệnh như : tiểu đường, tim mạch, gan, …
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 3
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
I.2.1.2. Cu,Zn-SOD (Cytosolic Cu,Zn-SOD) [ 26],[34], [43], [44], [48]
Cu,Zn-SOD có trong tế bào chất của động vật có chuyển hoá oxy.
Cu,Zn-SOD là 2 chuỗi polypeptid liên kết nhau theo cầu nối Histidin 61. Cu
và Zn trong chuỗi polypeptid cũng liên kết bởi cầu nối Histidin 61. Trọng
lượng phân tử của Cu,Zn-SOD khoảng 32.400 Da.
Hình 1. Cấu trúc Cu,Zn-SOD.
− Enzyme Cu, Zn – SOD có MR=31,7 ÷ 32,7 kDa, trung tâm hoạt động
chứa 1÷2 nguyên tử gram Cu2+ và một lượng nguyên tử gram Zn2+ tương tự,
liên kết với chuỗi polypeptid xoắn kép. Do đó, tùy nguồn nguyên liệu mà có
thể tồn tại 2 hoặc 4 nguyên tử gam Cu2+ và của Zn2+ trong chuỗi polypeptit.
Các thí nghiệm khảo sát về cấu trúc không gian của SOD cho thấy:
− Mỗi ion Cu2+ liên kết với nitơ imidazol của 4 histidin, và mỗi ion Zn2+
liên kết với nhóm imidazol của 3 histidin và một gốc COO- của acid aspartic.
− Ion Cu2+ giữ vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác trao đổi điện tử
của enzym, Zn2+ chỉ giữ vai trò phụ trợ cho sự bền vững của trung tâm hoạt
động.
− Ion Cu2+ và ion Zn2+ liên kết chặt chẽ với chuỗi polypeptit bằng cầu
nối disulfua, vị trí của chúng gần nhau nhưng độc lập nhau.
− Cả 2 ion Cu2+ và Zn2+ có thể chuyển đổi thuận nghịch vị trí cho nhau
trong trung tâm hoạt động của enzym.
− Trình tự sắp xếp các acid amine trong chuỗi polypeptit của SOD là
nguyên nhân của sự khác nhau về độ bền cũng như một số đặc tính của SOD,
được chiết xuất từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 4
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
− Một số acid amin của Cu, Zn-SOD bị biến đổi nhóm chức (gốc) tự
nhiên khi SOD bị biến tính bởi các tác nhân hóa lý, sự biến đổi acid amin phụ
thuộc tính bền của SOD từ các nguyên liệu khác nhau.
− Các nghiên cứu đã cho thấy: SOD có khả năng thoái hóa chậm phù
hợp với cấu trúc bền vững của phân tử SOD, để thực hiện vai trò quan trọng
đối với sự sống hiếu khí. Sự thay thế một số acid amin đã diễn ra trong suốt
quá trình tồn tại của SOD.
Đặc tính Cu,Zn-SOD (Cytosolic Cu,Zn-SOD) [28], [29], [34], [40]
Enzym Cu, Zn-SOD có những đặc tính như sau:
− Ion Cu2+ không bền ở pH<4,5, đưa đến sự giảm hoạt độ enzym trong
môi trường pH acid.
− Enzym Cu,Zn-SOD bị vô hoạt trong dung dịch KCN nồng độ 1÷5mM,
ở nhiệt độ phòng, do mất đi các ion Cu2+ và Zn2+. Hoạt độ Cu,Zn-SOD bị tổn
thất 90,5% trong dung dịch 1mM KCN.
− Hoạt độ Cu,Zn-SOD bị giảm 90% trong dung dịch EDTA nồng độ 10-3
M ở pH = 3,8 do dung dịch EDTA cạnh tranh kim loại Cu2+ của tâm hoạt động
gây biến đổi không thuận nghịch cấu trúc enzym, khiến enzym bị giảm hoạt
độ.
− Hoạt độ Cu,Zn-SOD giảm 40% trong môi trường pH10,2 và 0,2M
guanidin ở 250C, và sẽ bị bất hoạt hoàn toàn khi nồng độ guanidin tăng đến
1,2M.
− Hoạt tính của Cu,Zn-SOD không bị ảnh hưởng bởi acid tio-binitrobenzoic, chỉ bị giảm hoạt tính khi bị bổ sung muối guanidium clorua với nồng
độ 8M, nhưng riêng guanidium clorua ở nồng độ thấp cũng có thể cản trở sự
hoạt động của enzym SOD.
− Enzym Cu,Zn-SOD có thể kết tinh được trong các dung môi clorofom,
etanol, aceton và nước, nhưng hoạt tính enzym có thể bị ảnh hưởng.
− Hoạt tính Cu,Zn-SOD chỉ bị giảm đi 10% sau 3 giờ giữ trong môi
trường 86% metanol ở 240C.
− Enzym Cu,Zn-SOD không bền, dễ dàng bị thủy phân bởi proteaza và
tác động của nhiệt độ cao.
− Hoạt độ Cu,Zn-SOD không bị ảnh hưởng bởi môi trường ure nồng độ
8,0 ÷ 9,5M.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 5
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ÑAØO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
− Chuỗi polypeptid của Cu,Zn-SOD không chứa tryptophan.
− Các nhóm thuốc thử đặc trưng như xanh methylen được sử dụng để
nhận dạng nhóm acid amin của chuỗi polypeptid , mà các nhóm acid này
thường bị cản trở bởi Cu2+ hoặc Zn2+.
− Chỉ riêng histidin bị biến đổi bởi nhóm thuốc thử hoạt quang. Một số
trường hợp enzym bị vô hoạt, biến tính hoàn toàn là do sự mất đi 3 gốc
histidin trong một chuỗi xoắn kép.
− Acid di-azo-sunfanilic dễ dàng liên kết với gốc histidin làm biến tính
chuỗi polypeptid, nhưng không ảnh hưởng đến enzym.
− Tác động của kim loại đồng đến hoạt độ SOD: khi cơ thể bị thiếu
lượng Cu2+, thì hoạt độ cũng như hàm lượng sinh phẩm enzyme Cu,Zn-SOD
trong tế bào giảm, dẫn đến sự lão hóa hư hoại tế bào. Ion Cu2+ tác động tăng
hoạt độ SOD trong tế bào của những cơ thể thiếu Cu2+, và không có tác dụng
đối với cơ thểcó đầy đủ lượng Cu2+.
Những nghiên cứu về ảnh hưởng của Cu2+ đến hoạt độ của SOD trong
hồng cầu của chuột đã cho thấy: hoạt độ SOD trong hồng cầu của chuột bị
thiếu lượng Cu2+ trong khẩu phần ăn (4,9UI/mg hồng cầu), chỉ bằng 38% so
với chuột được cung cấp đầy đủ lượng Cu2+ (12,6UI/mg hồng cầu). Sau khi
được tiêm một lượng khoảng 15% Cu2+ trong huyết thanh, thì hoạt độ SOD
tăng lên đến 83% của trường hợp chuột được cung cấp đầy đủ lượng Cu2+.
Hoạt độ SOD của tế bào hồng cầu trẻ cao hơn tế bào già 22%; trong trường
hợp thiếu hàm lượng Cu2+, thì hoạt độ SOD như nhau trong cả hai loại tế bào
(4,4UI/mg hồng cầu), khi được cung cấp Cu2+ thì hoạt độ SOD của chúng tăng
lên như nhau đạt 56%. Thí nghiệm trên chuột cũng có khả năng cho kết luận
gần tương tự đối với người.
I.2.2. Mn-SOD và Fe-SOD[40], [47]
− Mn-SOD có thể tìm thấy trong mitochondria của tế bào động vật bậc
cao. Mn-SOD và Fe-SOD đã được phát hiện trong nguyên sinh chất của tế
bào nhân sơ. Riêng Fe-SOD còn được phát hiện trong nguyên sinh chất của tế
bào sinh vật yếm khí.
Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng SOD còn được phát
hiện tồn tại trong tế bào của các loài vi sinh vật; thực vật nhất là các cây họ
đậu; tế bào của các loài tảo như tảo đỏ; trong hồng cầu và trong tế bào nội
tạng của động vật như tim, gan.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 6
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
Đặc tính của Mn-SOD và Fe-SOD : [44], [47]
Trong quá trình xúc tác phản ứng loại trừ O2-, trung tâm hoạt động xúc
tác Mn2+ của Mn-SOD chuyển thành Mn3+ và ngược lại, ion Fe2+ ở trung tâm
hoạt động của Fe-SOD cũng chuyển thành Fe3+ và ngược lại. Tính chất chức
năng của Mn-SOD và Fe-SOD đều tương tự với Cu,Zn-SOD. Ngoài ra còn
một số đặc trưng riêng:
− Nhóm enzym Mn-SOD và Fe-SOD đều bị vô hoạt bởi quang phổ EPR,
và cũng bị vô hoạt bởi pH acid và kiềm.
− Nhóm enzym Mn-SOD và Fe-SOD đều không bị vô hoạt bởi muối
Cyanua.
− Chuỗi polypeptid tetrame của Mn-SOD thu nhận từ ty thể tế bào động
vật hoặc từ nguyên sinh chất của tế bào nhân sơ có thể ở dạng dime, nhưng
không ảnh hưởng đến hoạt độ enzym.
I.3. Cơ chế xúc tác của SOD:[44]
Enzym SOD luôn tồn tại trong tế bào sinh vật, là nhân tố quan trọng
thực hiện nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử loại trừ gốc superoxide
O2-.
Cơ chế phản ứng xảy ra như sau:
2O2- + 2H+ SOD
H2O2 + O2 (1)
Vì O2 liên tục được sinh ra và liên tục bị phân hủy như (1) nên SOD
có hoạt tính càng cao thì nồng độ O2- càng nhỏ. Do vậy, SOD là một chất
chống oxy hóa rất cơ bản (làm hạ thấp nồng độ O2- ), bởi vì từ O2- sẽ sản sinh
ra các dạng oxy hoạt động khác có hại cho tế bào cơ thể.
I.4. Cơ chất superoxide O2- của SOD:
I.4.1. Sự hình thành các dạng oxy hoạt động trong tế bào: [8],[9],
[32]
Thuyết lão hóa do gốc tự do của oxy quan niệm rằng quá trình già là
sự tích lũy dần dần các sai lệch trong cấu trúc tế bào. Nguyên nhân của sự sai
lệch đó là do các dạng oxy hoạt động sinh ra từng giờ, từng phút trong hô hấp
tế bào.
Các phản ứng oxy hóa khử trong cơ thể chỉ có thể trao đổi một điện
tử. Do đó oxy ở chuỗi hô hấp tế bào cũng chỉ nhận từng điện tử một. Vì vậy,
quá trình nhận bốn điện tử của oxy tạo ra nước:
O2 + 4H+ + 4e
2H2O
(2)
buộc phải qua bốn đoạn như sau :
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 7
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
O2 + e
O2(3)
+
O2 + 2H + e
H2O2
(4)
+
.
H 2O 2 + H + e
HO + H2O (5)
.
+
H2O
(6)
HO + H + e
Phản ứng (4), (5), (6) có tốc độ chậm, cho nên quá trình thực tế dừng lại
ở phản ứng (3), tạo ra gốc anion superoxide O2-. Gốc này chuyển thành H2O
theo những phản ứng xúc tác enzym có tốc độ lớn hơn nhiều:
SOD
+ 2H+
H2O2 + O2 (7)
catalaza
2H2O2
2H2O + O2 (8)
Vậy sự chuyển hóa của oxy chủ yếu xảy ra theo ba phản ứng (3), (7),
2O2-
(8).
− Phản ứng (7) nếu không có enzym SOD xúc tác thì xảy ra như sau:
2O2- + 2H+
H2O2 + 1O2 (9)
1
O2 là oxy đơn bội, rất độc hại, có khả năng phản ứng cực kỳ mạnh mẽ.
− Phản ứng phụ khác là phản ứng Haber-Weiss:
1
O2 - + H2 O2
O2 + .OH + - OH (10)
Oxy đơn bội (1O2) và gốc hydroxyl (.OH) đều có khả năng phản ứng
mạnh và rất độc hại, chúng là thủ phạm chính trong quá trình peroxyd hóa các
chất.
RH
+ .OH
R. + H2O
R. + R' OH
R_R' + .OH
R.
+ O2
ROO.
ROO. + RH
ROOH + R.
(Với R, R' là các gốc hydrocacbon)
Các phản ứng dây chuyền trên chỉ được dập tắt khi gốc R. gặp một gốc
.
R' để tạo thành:
R.
+ .R'
R_ R'
Tóm lại, từ anion superoxide O2- được sinh ra đầu tiên sẽ sản sinh ra hàng
loạt các chất: H2O2, HO., 1O2, ROO., R.….Chúng đều được gọi là các dạng oxy
hoạt động, gây ra những sai lệch trong cấu trúc tế bào, dẫn đến quá trình già
và nhiều bệnh lý khác của con người.
I.4.2. Tính tích cực và tác hại của O2- đối với tế bào: [ 9]
I.4.2.1. Tính tích cực của O2- :
Đối với động vật cấp cao, O2- được sinh ra ở liều lượng rất nhỏ
dưới sự xúc tác của xanthineoxydase để thực hiện nhiệm vụ:
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 8
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
− Tiêu diệt các DNA (Dezoxyribonucleic acid) bị tổng hợp sai, các
protein có cấu trúc sai lệch hoặc đã lão hóa.
− Tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập tế bào, loại trừ những thành
phần không thích hợp, những thành phần không thể thực hiện đúng chức năng
của mình trong tế bào.
I.4.2.2. Tác hại của O2- đối với tế bào: [9]
Các kết quả nghiên cứu cho thấy O2- có tác động trực tiếp đến các
mạch protein, lipid, polysaccarit, acid nucleic và những hợp chất sinh học như
DNA.
− O2- là nguyên nhân khởi đầu sự phân cắt mạch DNA, acid
polysaccarit như acid alginic thành những gốc tự do và sự phân cắt vẫn tiếp
diễn gây ra sự thoái hóa mạch polymer.
− O2- cũng khởi đầu cho phản ứng peroxyd hóa chất béo không no,
cũng như gây nên sự tự oxy hóa của thiol và của epinephrine, bắt đầu cho
chuỗi phản ứng oxy hóa cystein.
− O2- được xem là nguyên nhân sinh ra sự tổn hại cho tế bào và mô.
Chính SOD là enzym duy nhất có khả năng xúc tác cho phản ứng loại trừ sự
tồn tại của O2-, ngăn chặn hiện tượng hư hoại xảy ra trong các tế bào hay các
mô của cơ thể sống.
− O2- dư thừa, ngoài việc làm tổn hại đến các mô, nó sẽ chuyển hóa
tạo thành các độc tố khác của oxy là: .OH, 1O2, H2O2.
I.5. Một số bệnh có liên quan đến O2- và SOD: [ 9]
I.5.1. Bệnh ung thư:
− Trong cơ thể người bình thường, những phần tử lạ được tổng hợp
từ gen gây bệnh ung thư đều bị ức chế tiêu diệt bởi O2-, do đó mầm mống ung
thư tự hoại. Khi gen này hoạt động mạnh thì O2- không thể làm tròn chức năng
và còn bị ức chế bởi lượng lớn phần tử lạ được tổng hợp. Nếu gen gây bệnh
ung thư đã kết gắn với mạch DNA thì phát sinh bệnh ung thư, hoạt tính SOD
trong tế bào ung thư giảm thấp.
− Phương pháp phóng xạ và hóa dược được sử dụng điều trị bệnh
ung thư, tạo các gốc tự do có khả năng gây hư hoại hầu như toàn bộ các phân
tử DNA gây chết tế bào ung thư. Xạ trị mang tính cách điều trị tại vùng kiểm
soát các ung thư còn khu trú, hạn chế tối đa sự tổn thương cho các vùng mô
lân cận. Còn phương pháp hóa dược điều trị có thể gây tổn thương cho nhiều
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 9
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
vùng mô lành khác. Vì vậy SOD được đưa vào tế bào để bảo vệ các mô lành
chống lại tổn thương bởi phương pháp hóa dược trị ung thư.
I.5.2. Bệnh tai biến mạch máu não:
Do phẫu thuật hoặc một dạng bệnh lý (như có những phần tử phân
giải từ ATP ) tích tụ lại trong huyết quản, đã khiến máu không thể lưu thông
một cách bình thường. Khi đó hàm lượng O2- trong tế bào giảm xuống đột ngột
do tế bào không được cung cấp đầy đủ O2. Để tạo lại sự cân bằng thì
xanthinedehydrogenase (XHD) sẽ biến đổi thành xanthineoxydase (XOD) để
tăng cường xúc tác phản ứng tạo O2- từ cơ chất hypoxanthine. Đến khi máu
lưu thông trở lại thì O2, hypoxanthine, XHD, XOD cùng tồn tại tạo ra một
lượng thừa O2- không thể được chuyển hóa kịp thời bởi SOD, do đó sinh ra
.
OH gây tổn hại tim mạch.
I.5.3. Bệnh Down:
Bệnh Down là do cặp nhiễm sắc thể thứ 21 của tế bào bào thai chứa số
lượng gen di truyền SOD gấp đôi so với cặp nhiễm sắc thể thứ 21 của tế bào
bình thường. Do đó lượng SOD được tổng hợp nên trong tế bào của bào thai
này lớn hơn nhiều so với các bào thai bình thường, khiến lượng O2- trong tế
bào bị chuyển hóa nhanh chóng thành H2O2 và tăng cao vượt bình thường
trong chu trình hô hấp. Do đó lượng H2O2 này gây tổn thương hệ thần kinh của
thai nhi, triệu chứng thường thấy ở bệnh Down là chứng tăng bạch cầu.
I.6. NGUYÊN LIỆU MÁU:
Máu là một thành phần tổ chức của cơ thể. Máu lưu thông trong các
động mạch, tónh mạch và các mao mạch của cơ thể, thực hiện nhiều chức
năng sinh lý quan trọng. Máu được luân chuyển đến mọi bộ phận và cơ quan
của cơ thể, vì vậy nó có ảnh hưởng tới tất cả các cơ quan và bộ phận đó.
I.6.1. Tính chất và chức năng của máu: [6],[15],[19]
I.6.1.1. Tính chất của máu:
− Máu là một loại mô liên kết đặc biệt gồm chất cơ bản là chất lỏng
(huyết tương) và phần tế bào (huyết cầu).
− Huyết tương chiếm 55-60% thể tích máu và huyết cầu chiếm 40-45%
thể tích máu.
− Huyết cầu gồm hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 10
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
Máu toàn phần
Huyết tương
Hồng cầu
Nước (%)
Chất khô(%)
75-85
90-93
57-68
15-25
7-10
32-43
Bảng 3: Thành phần nước và chất khô trong máu [ 3]
− Máu động mạch có màu đỏ tươi, máu tónh mạch có màu đỏ sẫm.
− Khối lượng máu trong cơ thể chiếm 7% - 9% tổng trọng lượng cơ thể.
Trung bình trong cơ thể người trưởng thành có khoảng 65 - 75 ml máu
trong 1 kg trọng lượng.
− Tỷ trọng:
Tỷ trọng
Máu toàn phần
Huyết tương
Huyết cầu
1,05-1,06
1,03
1,10
Bảng 4: Tỷ trọng của các chất trong máu [6]
− Độ nhớt của máu so với nước là: 3,8/1 đến 4,5/1
− Độ nhớt của huyết tương so với nước là: 1,6/1 đến 1,7/1
− Độ nhớt của máu phụ thuộc vào nồng độ protein và số lượng huyết
cầu.
Áp suất thẩm thấu của máu bằng 7,5 at. Áp suất thẩm thấu của máu phụ
thuộc vào tất cả các phân tử và ion có trong máu, chủ yếu là Na+, Cl−, HCO3−.
Các chất hữu cơ khác như ure, glucoza… tương đối ít ảnh hưởng vì nồng độ của
chúng trong máu thấp so với NaCl và không phân ly thành các ion.
Độ pH của máu bằng 7,39. Như vậy, máu có phản ứng kiềm yếu, nó
nghiêng về phía acid khi bị ngạt, bị sốc và nghiêng sang kiềm khi thở nhanh.
I.6.1.2. Chức năng của máu:
a. Chức năng hô hấp: máu chuyển oxy từ phổi tới các mô và CO2 từ
các mô tới phổi thải ra ngoài.
b. Chức năng dinh dưỡng: máu vận chuyển các chất như glucoza,
acid amin, acid béo, vitamin… đến cung cấp cho các tổ chức tế bào.
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 11
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG Cu,Zn-SOD TRONG
TẾ BÀO HỒNG CẦUCỦA NGƯỜI HIẾN MÁU TẠI BVND GIA ĐỊNH
c. Chức năng đào thải: máu lưu thông khắp cơ thể lấy những chất
cặn bã của chuyển hóa tế bào đưa đến những cơ quan bài xuất như thận, phổi,
tuyến mồ hôi…
d. Chức năng bảo vệ cơ thể: các loại bạch cầu của máu có khả năng
thực bào, khử độc, tiêu diệt vi trùng. Trong máu có các kháng thể, kháng độc
tố… tham gia vào cơ chế bảo vệ cơ thể.
e. Chức năng thống nhất và điều hòa hoạt động cơ thể:
- Máu mang các hormon, các loại khí O2 và CO2, các chất điện giải Ca2+,
K+, Na+… để điều hòa hoạt động các nhóm tế bào, các cơ quan khác nhau
trong cơ thể, nhằm đảm bảo sự hoạt động đồng bộ của các cơ quan trong cơ
thể.
- Máu còn có khả năng điều hòa nhiệt độ cơ thể một cách nhanh chóng,
làm cho các phần khác nhau trong cơ thể luôn có cùng một nhiệt độ tương
đương nhau.
I.6.2. Hồng cầu: [6],[12],[14],[19],[20]
I.6.2.1. Hình thể, thành phần cấu tạo và số lượng hồng cầu:
a. Hình thể:
− Hồng cầu là những tế bào không nhân, hình dóa, lõm hai mặt.
− Đường kính của hồng cầu: 7-8 μm
− Chiều dày tế bào ở trung tâm là 1 μm và ở ngoại vi là 2-3 μm
− Hình dóa lõm hai mặt thích hợp với khả năng vận chuyển khí của hồng
cầu vì:
− Tổng diện tích tiếp xúc của hồng cầu trong cơ thể là 3000 m2.
Hình dóa lõm làm tăng diện tích tiếp xúc của hồng cầu lên 30% so với hồng
cầu hình cầu.
− Làm tăng tốc độ khuếch tán khí.
− Làm cho hồng cầu có thể biến dạng dễ dàng khi nó xuyên qua
các mao mạch có đường kính rất nhỏ.
b. Thành phần cấu tạo:
− Hồng cầu có màng bán thấm bao quanh. Màng hồng cầu không cho
protid, lipid thấm qua; đối với các ion muối khoáng, tính thấm của màng cũng
không đều:
HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ THU THỦY
Trang 12
GVHD: TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
