Nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5 1 tái tổ hợp biểu hiệu trong escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

TRẦN THỊ NHÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5-1
TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2012

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Nhài

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH ĐÁP
ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN HA5-1 TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN TRONG
ESCHERICHIA COLI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2012

2


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 5
1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM ............................................................................. 5
1.1.1 Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm .................................. 5
1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ.................... 7
1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA................................................................... 9
1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A ..................................................... 11
1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 .......................................................................... 12
1.2 BIỂU HIỆN GEN .................................................................................................. 14
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli......................................................................................... 14
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21 ......................................................................... 15
1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin ................ 16
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 17
2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid ........................................................................ 17
2.1.2 Hóa chất và enzym .......................................................................................... 17
2.1.3 Máy móc và thiết bị ....................................................................................... 17
2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy........................................................................................ 17
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 20
2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn ............................................ 20
2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid .................................................. 21
2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 21
2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli ....................................................... 22
2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose ......................................................................... 23

2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose................................................................. 24
2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamide ........................................................... 25
2.2.8 Biểu hiện protein tái tổ hợp ............................................................................. 26
2.2.9 Tinh chế sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê ............................... 27
2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1 .................................................. 27
2.2.11 Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà ........................................ 28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 31
3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1 .......................................... 33
3.1.1. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx .......................................... 33
3.1.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn ............ 34
3.2. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E. COLI BL21 ............. 36
3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1
TRONG E. COLI........................................................................................................ 37
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l ................................. 38
3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l........................ 38
3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp ........................................................... 39
3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 ..................................... 40
3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP
HA5-1 ......................................................................................................................... 43
KẾT LUẬN..................................................................................................................... 45
ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 47
PHỤ LỤC

52


MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm
A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A có 16 phân type

hemagglutinin (HA) (từ H1 đến H16) và 9 phân type neuraminidase (NA) từ N1
đến N9) có khả năng tái tổ hợp để tạo nên rất nhiều phân type khác nhau về độc tính
và khả năng gây bệnh. Trong đó chủng virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI High Pathogenic Avian Influenza) là chủng gây ra dịch bệnh chủ yếu ở nhiều quốc
gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Virus cúm gia cầm A/H5N1 lần đầu tiên được phân lập từ người ở Hồng
Kông vào năm 1997 sau khi đã có một số vụ dịch bùng phát ở gia cầm. Cho tới nay,
chủng virus A/H5N1 thường xuyên thay đổi kháng nguyên bề mặt thông qua đột
biến và tái tổ hợp di truyền của những biến thể.
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã
(chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó
kiểm sốt. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá
trình lây truyền ở tự nhiên [20, 14]. Nhờ đặc tính ln thay đổi kháng ngun trong
tự nhiên, virus cúm A biến đổi để có thể xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian
khác nhau như gia cầm, một số lồi động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và
cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội lồi” như gà - gà, hay “ngoại
loài” như gà - lợn; gà - lợn - người.
Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 đã xuất hiện ở hơn 50 quốc gia khác
nhau ở châu Á, châu Âu, châu Phi và có nguy cơ lan rộng khắp thế giới. Theo thơng
báo của WHO, tính đến tháng 01/2012 đã có tới 583 trường hợp mắc cúm A/H5N1,
trong đó 344 trường hợp tử vong, 120 triệu gia cầm chết do nhiễm virus hoặc bị tiêu
hủy. Virus lây lan nhanh và có độc lực rất cao ở các vật chủ khác nhau.
Tiêm vaccine phòng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm được coi là một cách
phòng chống hiệu quả, đỡ tốn kém và không ảnh hưởng nguy hại tới môi trường.
Các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu sản xuất các loại vaccine
cúm khác nhau như: vaccine vô hoạt, vaccine nhược độc, vaccine dưới đơn vị,

3


vaccine DNA và vaccine tái tổ hợp [27]. Trong đó, vaccine vô hoạt và vaccine

nhược độc được sản xuất bằng cách nuôi cấy virus trong phôi gà. Các kết quả
nghiên cứu được công bố cho thấy phần lớn sự bảo hộ chống lại virus cúm A là kết
quả của đáp ứng miễn dịch kháng lại protein HA [13]. Do đó, việc dùng HA như thành
phần kháng nguyên chính của vaccine hứa hẹn đem lại các kết quả khả quan.
Hệ biểu hiện E. coli có nhiều ưu điểm như mơi trường nuôi cấy đơn giản, tốc
độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh. Hiệu
suất tổng hợp protein tái tổ hợp cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l. Cấu trúc bộ gene của
E. coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi
trong quá trình nghiên cứu và sản xuất.
Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành
đề tài:
“Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng
miễn dịch của protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli”
Với mục đích sử dụng protein tái tổ hợp để nghiên cứu đánh giá khả năng
phát triển vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị phịng cúm A/H5N1 cho gia cầm.
Cơng việc được tiến hành tại phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

4


Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM
1.1.1 Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm
Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus, đó là:
nhóm virus cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus
cúm C (Influenza C); và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các
kháng nguyên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA), ở virus
cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là
Glycoprotein (GP) [18, 25].

Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm
A gây nên. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA và 9 phân type NA, sự tái tổ
hợp giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác
nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan
trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA) hoặc trao đổi
các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền
giữa các lồi vật chủ.
Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là
hệ gen của chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là
ss(-) RNA (negative single stranded RNA).
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính
80 -120 nm, đơi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu
Da. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn
giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [25].

5


Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B) và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C)
của virus cúm A. A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B:
Mơ hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân
tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus). C:
Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,
bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc
hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô
ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm,
đó là những kháng ngun bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm:

HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [5, 44]. Trong đó tỷ lệ giữa các
phân tử NA và HA là 1/4, đây là hai loại protein kháng ngun có vai trị quan trọng
trong q trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [25]. Vật chất di truyền (còn
gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA,
NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ
virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2
protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS1 và NS2, phân đoạn
PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [18].
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm qua lớp biểu mơ đường hô hấp và
gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp. Ngồi ra, chúng cũng có thể gây tổn thương

6


nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó virus này cịn
được gọi là virus hướng đa phủ tạng [28, 38]. Khả năng gây bệnh của virus cúm A
phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus. Thơng
thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của
chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7 và H1,
H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch
cúm ở gia cầm và ở người [33, 43]. Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất
tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân
type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp
chưa được nhân lên nhiều và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang,
chuột Hamster, chồn đất [14, 17].
Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống
lại virus. Tuy nhiên đáp ứng miễn dịch này có thể khơng có tác dụng bảo vệ cho
những lần nhiễm sau, do virus cúm A ln có sự biến đổi kháng ngun trong q
trình lưu hành tự nhiên và khơng có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus
cúm A [38]. Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng

ngun khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ khơng hoặc ít có đáp
ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm
cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm và các đợt
dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới
[12]. Virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên
người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người [18]. Các chủng này vẫn
thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người và trong quá trình tồn tại,
chúng vẫn biến đổi kháng nguyên liên tục [16]. Đây là nguồn virus có khả năng trao
đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm
gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [10, 37, 38, 40].
1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, q trình xâm nhiễm và nhân lên
của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mơ đường hơ hấp, đường tiêu hóa của cơ
thể nhiễm [25, 28] và có những nét đặc trưng như sau:

7


Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA
và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mơ và cuối cùng là giải
phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.2).

Hình 1.2: Mơ hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ

Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào,
đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên
sinh chất) và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò
của enzyme NA. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus
mới trung bình là khoảng 6 giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào
nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi

vào q trình chết theo chương trình làm tổn thương mơ của cơ thể vật chủ [35, 38].
Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus
sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận
chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phức hợp protein –
RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [4].
Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ
khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ
gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này khơng được Adenine hóa

8


(gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein
(NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển
ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ
thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã
tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.2).
Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên
mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi”
của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với
RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng
“nảy chồi” tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết
giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải
phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [25, 26].
1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA
Hai protein HA và NA là các protein chính trên bề mặt capsid, đặc trưng cho
bản chất của từng chủng virus cúm A [21, 25].
Protein HA (hemagglutinin)
Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin),
có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với

HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết
hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody).
Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích
thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, được coi
là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là
đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể
nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [6, 17, 21, 24].
Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn
phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36

9


kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn
phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngồi capsid là dưới
đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa
đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [6, 36].
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề
mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho
virus xâm nhập, hịa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở
trong tế bào cảm nhiễm. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình
khơng gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này
trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các
loài vật chủ khác nhau [36, 38]. Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1
được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở
hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích
ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl
(4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mơ đường hơ hấp của chim
và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A).
Protein NA (neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là
một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm
A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [3, 36].
Protein NA có vai trị là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của
màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus
ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ,
và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham
gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hịa màng”, đẩy nhanh q trình cởi
áo giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình
nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [36]. Ngồi ra, NA cịn phân cắt các liên kết
glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan lỗng màng nhầy bề mặt biểu mô
đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mơ và thoát

10


khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3
khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus
cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế
virus khơng đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong
tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ
cơ thể [8].
Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích
thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA
[12]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích
chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở điều
chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch
cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [31, 42].
1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất
khó kiểm sốt.
Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [42].
Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các
phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A khơng có cơ chế “đọc và sửa bản
sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự
thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ
có thể “gài” thêm [1], làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide mà không
được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [25]. Tuỳ thuộc vị trí
xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino
acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính
của protein. Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện
một phân type virus mới có những đặc tính kháng ngun mới có thể bị sai lệch.

11


Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen
kháng nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia
cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn
gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm
trong một tế bào trao đổi cho nhau. Trong q trình kết hợp lại RNA hệ gen có thể
xảy ra sự hoà trộn hoặc trao đổi các phân đoạn gen của hai chủng virus đó tạo ra các
trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của
những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết
hợp và đơi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở lồi vật chủ mới hoặc gia
tăng độc lực gây bệnh [9, 16, 23].
1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược,
nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [32]. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia
cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những
ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của
loại virus nguy hiểm này sang người [17, 29]. Kháng thể đặc hiệu được cơ thể sinh
ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine và chủ yếu là các kháng thể kháng
HA, NA, MA góp phần vơ hiệu hóa virus cúm khi chúng xâm nhập vào cơ thể.
Kháng thể kháng HA có vai trị tiên quyết trong việc tạo miễn dịch bảo hộ cho vật
chủ bị nhiễm.
Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là:
- Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc): được tạo ra bằng cách vô hoạt
virus A/Turkey/England/N-28/73 (H5N2). Đây là loại vaccine dị chủng (là vaccine
sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa,
nhưng có kháng nguyên NA dị chủng) .
- Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vaccine đồng chủng, sử
dụng chủng virus A/Harbin/Re-1/2003 (H5N1).

12


- Vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): đây là loại vaccine dị chủng,
sử dụng chủng virus A/Chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2).
Vaccine vô hoạt được tạo ra bằng cách nuôi virus trong trứng và làm vơ hoạt
virus bằng hóa chất hoặc nhiệt độ cao. Chủng virus được chọn để sản xuất vaccine
vô hoạt thường là các chủng có độc lực thấp (LPAI) có chung kiểu protein HA với
chủng đang gây dịch [19]. Vaccine vơ hoạt thích hợp để bảo vệ gà trưởng thành, gà
tây và các loại chim khác trong các trường hợp cấp thiết như khi thiết lập vòng tròn
bảo hộ trong vùng có dịch. Tuy nhiên, khi dùng cho gà con, hiệu quả của vaccine
chỉ tối ưu với gà 2-3 tuần tuổi. Vaccine khơng thể kích thích miễn dịch bảo hộ tốt
cho gà một ngày tuổi. Các vấn đề khác thường gặp khi sử dụng vaccine vô hoạt là:

Gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, khơng hồn tồn và cần phải tiêm nhắc lại
nhiều lần;
Trên thị trường hiện giờ chưa có kỹ thuật kiểm tra để phân biệt gà đã nhiễm
bệnh với gà đã được gây miễn dịch với vaccine;
Phản ứng của gà một ngày tuổi với vaccine vô hoạt có thể làm ảnh hưởng xấu
tới thể trạng hoặc khả năng đẻ trứng sau này [7].
Tuy nhiên các loại vaccine trên chỉ đáp ứng miễn dịch với chủng virus cũ là
Clade 1 và Clade 2.3.4. Đối với nhánh virus mới là Clade 2.3.2 (gồm hai nhánh con là
Clade 2.3.2-A và Clade 2.3.2-B đang ngày càng có xu hướng bùng phát rộng, trải dài
từ các tỉnh phía Bắc vào các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt là nhánh 2.3.2A. Các cơ quan thú y vẫn chưa tìm ra loại vaccine nào có hiệu lực bảo hộ đạt yêu cầu.
Cụ thể: Vaccine H5N1 Re-1 chỉ có hiệu quả bảo hộ đạt 80% đối với nhánh virus 2.3.2A, còn đối với nhánh 2.3.2-B, nếu tiêm hai mũi thì hiệu quả bảo hộ vẫn chỉ đạt khoảng
50%; vaccine H5N1 Re-5, nếu tiêm một mũi thì chỉ có hiệu quả bảo hộ 70% đối với
nhánh virus 2.3.2-A và hồn tồn khơng có tác dụng bảo hộ đối với nhánh 2.3.2-B.
Hiện có 3 cơ sở đang nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh
cúm gia cầm H5N1 cho cả người và gia cầm như: Công ty Vắc xin và sinh phẩm số
1 (VABIOTECH) của Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung Ương; Viện Pasteur TP.HCM,
Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang.

13


Công ty Vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) với sự hợp tác của tiến sỹ
Yoshihiro Kawaoka, Trường Đại học Tổng hợp Tokyo Nhật Bản đã Sản xuất vắc
xin cúm A/ H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược trên tế bào thận khỉ.
Vaccine cúm A/H5N1 đã hoàn thành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I, II và
đang được tiến hành giai đoạn III. Kết quả giai đoạn I và II cho thấy vaccine cúm
A/H5N1 (FLUVAX) do VABIOTECH sản xuất an tồn trên người tình nguyện,
khơng gây ra các phản ứng trầm trọng, chủ yếu là chỉ là đau tại chỗ tiêm thoảng qua
và tự khỏi sau 24 giờ mà không cần điều trị
Năm 2005 Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang sản xuất vaccine

cúm A/ H5N1 dựa trên chủng NIBRG-14 của Vương quốc Anh sinh trưởng trên
phôi trứng sau đó bất hoạt dùng cho người. Viện đã sản xuất thử nghiệm thành công
5 lô vaccine thành phẩm cúm A/H5N1 hấp phụ (FLUVAC), gồm 5.000 liều. Đến
đầu năm 2007, Viện sản xuất thêm 5.000 liều nữa để đáp ứng cho việc kiểm định tại
các trung tâm quốc tế, nếu đạt yêu cầu sẽ đề xuất cho thử nghiệm trên người.
Viện Pasteur TP HCM đã chế tạo thành công vaccine cúm A/H5N1
PAVIFLU bằng công nghệ nuôi cấy trên tế bào Vero. Vaccine này đã chứng minh
hiệu quả bảo vệ 100% trên những thử nghiệm tiền lâm sàng với các chủng virus
cúm A/H5N1 độc lực cao lưu hành tại Việt Nam năm 2009.
Sản xuất vaccine phòng cúm A/H5N1 bằng kĩ thuật di truyền ngược cũng đã
đạt được một số thành tựu đáng kể, tuy nhiên mặt hạn chế về quy trình sản xuất
phức tạp, tốn kém và địi hỏi thời gian sản xuất dài. Vì vậy vaccine dưới đơn vị là
một trong những phương thức tiếp cận mới, cho phép sản xuất vaccine trong một
thời gian ngắn và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất.
1.2 BIỂU HIỆN GEN
1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli
Escherichia coli là vi sinh vật thường được sử dụng và tiêu biểu nhất để biểu
hiện các protein ngoại lai và các protein nội tại. Việc sử dụng rộng E. coli dựa vào
những ưu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền dễ, có thể biểu hiện các

14


protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lượng lớn protein ngoại
lai khi tốc độ tăng trưởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trường nuôi cấy
đơn giản và rẻ.
Bên cạnh những ưu điểm trên, hệ biểu hiện E. coli còn tồn tại những nhược
điểm sau: Thứ nhất, protein quan tâm không chứa methionine hoặc formyl methionine
ở tận cùng đầu N làm mất một số tính chất quan trọng của protein; Thứ hai, các protein
có nguồn gốc từ Eukaryote khơng bền, cấu trúc không gian không đúng so với dạng tự

nhiên, do hệ biểu hiện E. coli khơng có khả năng thực hiện q trình glycosyl hóa hay
phosphoryl hóa sau dịch mã.
Để đạt được mức độ biểu hiện cao, cần có hệ thống vector biểu hiện phù
hợp nhằm cung cấp các yếu tố di truyền cho sự kiểm soát quá trình phiên mã,
dịch mã, độ bền của protein và quá trình tiết protein khỏi tế bào vật chủ. Ngồi
ra, tùy mục đích, mà vector có thể chứa đoạn peptid tín hiệu để làm dấu hiệu cho
sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngồi tế bào chất hay đi Histidine tạo thuận lợi
cho quá trình tinh sạch sau này.
1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21
Trong quá trình biểu hiện, protein ngoại lai có thể bị phân giải bởi các
protease nội bào làm giảm mức độ biểu hiện của gen trong E. coli. Do đó, các
chủng biểu hiện mang các đột biến gen mã hóa cho protease thường được sử dụng
cho biểu hiện gen. Với chủng biểu hiện E. coli BL21, gen lon protease (một
protease nội bào) và ompT protease (một protease định khu ở màng ngồi) đã bị đột
biến. Vì vậy, protein ngoại lai sẽ ít bị phân cắt bởi protease của tế bào chủ.
Ngoài ra, DNA hệ gen của E. coli BL21 cịn chứa gen mã hóa cho T7-RNA
polymerase. Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa vào genom của
E.coli BL21 đặt dưới sự điều khiển của promoter lac. Với những thay đổi này,
chủng E. coli BL21 trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai,
đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector pET .

15


1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin
Vector pET22b(+) mang gen trx (pET22trx) có đầy đủ các thành phần của
một vector biểu hiện như điểm khởi đầu sao chép (Ori), gen qui định dấu chuẩn
chọn lọc (Amp), vùng khởi đầu phiên mã (promoter), vùng kết thúc phiên mã
(terminater), vùng đa nối (Multiple cloning site). Tuy nhiên, hệ vector này có một
số ưu điểm vượt trội hơn so với các hệ biểu hiện khác như:

Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7- đây là một promoter mạnh và
có tính đặc hiêu cao.
Q trình phiên mã được điều hịa bởi lac operator có cơ chế cảm ứng đơn
giản mà hiệu quả.
Vector pET22trx chứa trình tự trxA mã hóa cho thioredoxin. Thioredoxin
tham gia xúc tác cho phản ứng khử các protein khác thơng qua phản ứng trao đổi
nhóm thiol và disulfide của cystein. Protein ngoại lai biểu hiện trong tế bào dị vật
chủ thường không bền và bị các protease của tế bào vật chủ phân giải. Để giải quyết
vấn đề này, người ta ghép nối gen cần biểu hiện với một đoạn gen mã hóa cho một
protein của tế bào vật chủ chẳng hạn như gen trxA hay gen mã hóa cho βgalactosidase [22]. Trong trường hợp này, chúng tơi biểu hiện gen ha5-l (gen mã
hóa cho tiểu phần HA1 của virus cúm H5N1) cùng với gen trxA. TrxA là đoạn
peptide nhỏ 109 axit amin có khối lượng phân tử 11,675 kDa. Thioredoxin được
biết như là tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên khi gây miễn
dịch cho gia cầm. Ngoài ra, các peptide, protein dung hợp cũng được biết là có khả
năng giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease, đồng thời hình thành
cấu trúc bậc 3 chính xác hơn [15]. Giữa đoạn gen mã hóa thioredoxin và vùng đa
nối để nhận gen ngoại lai là đoạn DNA mã hóa enterokinase hay thrombin. Hai
enzyme này có thể được sử dụng để cắt bỏ thioredoxin dung hợp ra khỏi protein
ngoại lai khi cần thiết. Ngoài ra, đoạn peptide dung hợp Thioredoxin cịn chứa
DNA mã hóa 6 Histidine nằm ở hai đầu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh chế
protein ngoại lai [30].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pET22trx để biểu hiện gen
ha5-1 trong hệ biểu hiện E. coli BL21 .

16


Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid

- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 được sử dụng để biểu hiện gen ha5-1
- Plasmid pET22b(+) do hãng Novagen sản xuất, mang gen trx do phòng kĩ
thuật di truyền thiết kế;
- Plasmid pCR2.1 do hãng Invitrogen sản xuất, mang gen ha5-1 (pCRha5-l)
do phòng Kĩ thuật di truyền thiết kế.
2.1.2 Hóa chất và enzym
* Hóa chất:
SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol
isoamylalcohol, EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka,
Đức); d-NTP (Promega, Mỹ); ampicillin (Merk, Đức); agaroza (Gibco, Mỹ); MgS04
(BioLabs, Anh).
* Enzyme
Các enzyme hạn chế (BioLab, Anh); Taq-DNA polymeraza (BioLabs, Anh);
rionucleaza (Sigma, Mỹ); phosphataza kiềm, T4-DNA ligaza (BioLabs, Anh).
2.1.3 Máy móc và thiết bị
Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn
nhiệt (Mỹ); máy điện di, máy xác định DNA trên gel agaroza (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc
ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy ly tâm Eppendorf; Bộ tinh sạch DNA từ gel agarose.
2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy

17


2.1.4.1 Môi trƣờng và dung dịch sử dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế
bào E. coli DH5α
 Môi trường Luria-Bertani (LB): yeast extract (0,5%), peptone (1%), NaCl (0,5%)
 Môi trường chọn lọc LBA lỏng: thành phần gồm môi trường LB bổ sung

ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.

 Môi trường chọn lọc LBA đặc: thành phần như mơi trường LB có bổ sung

thêm 1,5% agar và ampicillin µg/ml.
 Dung dịch: CaCl2 0,1 M

2.1.4.2 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E.
coli DH5α
 Dung dịch I (Sol I): glucose (50 mM); Tris-HCl pH 8,0 (25 mM); EDTA pH

8,0 (10 mM).
 Dung dịch II (Sol II): NaOH (0,2 M); SDS (1%).
 Dung dịch III (Sol III): potassium acetate 3 M; acetic acid 11,5%.
 (Dung dịch I và III được giữ ở 4°C; dung dịch II được chuẩn bị trước khi sử dụng)
 TE: Tris-HCl 1 M, pH 8; EDTA 0,5 M, pH 8.
 Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol: 50 phenol : 49 chloroform : 1

isoamylalcohol.
 Gel agarose 0,8%: 0,8 g bột agarose pha trong TAE và dẫn đến 100 ml.

2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
 Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2% tris-base; 5,71 ml acetic acid;

10 ml EDTA 0,5 M (pH 8).
 Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen

cyanol FF; 30% glycerol.
 Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml.

18

2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS
 Bis-Acrylamide 30%: cân 29,2 g acrylamide và 0,8 g bis-acrylamide, hịa

trong nước cất vơ trùng ấm cho tan đều, sau đó dẫn đến 100 ml. Bảo quản ở 4°C.
 Đệm Tris 1,5 M (pH 8,8): 27 g Tris được hịa vào một ít nước, bổ sung

thêm 2 ml HCl đậm đặc sau đó điều chỉnh pH xuống 8,8 bằng HCl và dẫn
nước tới 150 ml.
 Đệm Tris 0,5 M (pH 6,8): 3 g Tris được hòa vào nước, điều chỉnh pH đến

6,8 bằng HCl và dẫn nước đến 50 ml.
 SDS 10% (100 ml): cân 1 0 g SDS hòa tan vào nước và dẫn nước tới 100 ml.
 Đệm chạy điện di: Tris 0,025 M pH8,3; glycine 0,192 M; SDS 0,1%.
 Dung dịch nhuộm gel: 0,025 g commassie brillian blue; 40 ml methanol; 10

ml acetic acid, bổ sung nước tới 100 ml.
 Dung dịch rửa gel 1: 40 ml methanol; 10 ml acetic acid; bổ sung nước cất tới

thể tích 100 ml.
 Dung dịch rửa gel 2: 0,5-2% glycerol, 35% ethanol.
 APS 10%: cân 1 0 mg ammonium persulfate dẫn đến 1 ml.
 TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ cơng ty hóa chất.
 Đệm xử lý mẫu 5X: 6,75 ml Tris-HCl 0 , 5 M (pH 6,8); 30 ml glycerol 100%;

10 g SDS; 5 ml 2-mercaptoethanol; 50 ml bromophenol blue 0,04%, dẫn nước
tới 100 ml.
 Thành phần của bản gel polyacrylamide:

19

Hóa chất

Gel tách (12%)

Gel cơ (4%)

l. ddH20

2,00 ml

0,8 ml

2. Tris-HCl 1,5 M

1,50 ml

0,5 ml

(1,5 M, pH8,8)

(0,5 M, pH6,8)

3. Glycerol 50%

0,06 ml

4. Acrylamide 30%

2,40 ml

0,2 ml

5. SDS 10%

60 µl

15 µl

6. APS

50 µl

20 µl

7. TEMED

2 µl

2 µl

2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
Cơ sở lý thuyết
Mỗi enzyme cắt giới hạn có một trình tự nhận biết xác định. Khi trong phân tử
DNA có chứa trình tự nhận biết của enzyme, ở điều kiện phản ứng thích hợp,
enzyme cắt giới hạn sẽ cắt phân tử tại các điểm nhận biết.
Quy trình
Phản ứng cắt của enzyme hạn chế thường được tiến hành trong tổng thể tích 20

àl bao gm cỏc thnh phn:
ơ

- Nc kh ion vụ trùng

: 15,8µl

- Dung dịch đệm thích hợp 10x (của enzyme

: 2 µl

- DNA plasmid (100 µg/ml)

: 2 µl

- Enzyme hạn chế (10 u/µl)

: 0,2 µl

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy vào
loại enzyme (thường là tại nhiệt độ 37°c trong 2 giờ). Sản phẩm của phản ứng được
tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

20


2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
Cơ sở lý thuyết
Các nucleotide nằm ở đầu dính của một sợi DNA đơn có khả năng hình thành
cầu nối hydro với các nucleotide nằm trên đầu dính của đoạn DNA khác. Nhờ sự

xúc tác của DNA ligase, cầu nối phosphodieste được hình thành giữa hai nucleotide
sát cạnh nhau của hai đoạn DNA này. Kết quả là một liên kết este hình thành giữa
gốc phosphate đầu 5' của đoạn DNA này với gốc hidroxyl đầu 3' của đoạn kia đồng
thời giải phóng ra một phân tử nước.
Quy trình
Đoạn DNA sau khi được cắt bằng enzyme cắt giới hạn được nối vào vector
cũng được xử lý bằng cùng một enzyme. Tùy thuộc vào nồng độ và chiều dài của
các đoạn DNA cần nối mà có tỷ lệ trộn vector và đoạn gen nối khác nhau.
Phản ứng nối ghép tiến hành với tổng thể tích là 10 µl. Thành phần phản ứng
như sau:
- H2 O

:

1 µl

- Đệm 10x của T4-ligase

:

1 µl

- Đoạn DNA cần ghép nối

:

6 µl

- Vector pET22Trx

:

1 µl

- T4- ligase (1 µl)

:

1 µl

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16oC trong 3 giờ.
2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp
sốc nhiệt
Tạo tế bào khả biến
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml mơi trường LB lỏng, lắc 200
vịng/phút ở 37oC qua đêm.
- Hút 0,5 ml dịch nuôi cấy chuyển sang 50 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy
lắc ở 200 vòng/phút ở 37°C cho tới khi OD600 đạt 0,5-0,6, sau đó lấy mẫu ra và đặt
lên đá khoảng 1 giờ. Từ bước này, tất cả các thao tác đều phải được tiến hành ở 4oC.

21


- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tế bào bằng 50 ml H 2O khử ion
vô trùng lạnh.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hòa tế bào thu được trong 50 ml CaCl2
100 mM (vô trùng), ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 5 phút.
- Hòa tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 1 giờ trên đá.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào và hòa lại trong 0,5 ml
CaCl2 100 mM. Bổ sung glycerol đến nồng độ cuối cùng là 15% và trộn đều.

- Hút 0,1 ml dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf và bảo quản ở - 80°C
Biến nạp bằng sốc nhiệt
- Tế bào khả biến được lấy ra từ - 80°C và được làm tan dần trên đá trong
khoảng 20 phút.
- Cho 2-5 µl sản phẩm lai, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế
bào khả biến. Sau đó, mẫu được giữ trên đá trong khoảng 30 phút.
- Đưa mẫu sang bể ổn nhiệt đã đặt trước nhiệt độ 42°C và ủ trong 1,5 phút.
- Lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt rồi đặt trên đá trong 2 phút.
- Bổ sung vào dịch mẫu khoảng 500 - 600 µl LB lỏng, lắc ở 37°C trong 45 - 50 phút.
- Hút 100 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa mơi trường LB đặc có bổ sung
Ampicillin 100 µg/ml. Ủ đĩa ở 37°C qua đêm.
2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli
Cơ sở lý thuyết
Các tế bào E. coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì được ly
tâm thu lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt
(SDS, NaOH). Sau đó DNA hệ gen và protein được tủa lại bằng muối potassium
acetate, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm. DNA
plasmid được tủa lại bằng ethanol và loại bỏ RNA bằng cách bổ sung RNase.
Quy trình
- Cấy chuyển một khuẩn lạc riêng rẽ vào ống nghiệm chứa 5 ml mơi trường
LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100 µg/ml), ni cấy lắc qua đêm ở
37°C, 200 vòng /phút.

22


- Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 5 phút, tốc
độ 5000 vòng/phút, thu tủa tế bào.
- Hòa tan tủa tế bào thu được vào 100 µl dung dịch I bằng máy Vortex. Từ lúc
này, các thao tác với mẫu được thực hiện ở nhiệt độ lạnh.

- Bổ sung 200 µl dung dịch II. Đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy DNA nhiễm
sắc thể, ủ trong đá 5 phút, hỗn dịch sẽ trở nên trong suốt và quánh.
- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, lắc nhẹ và ủ trong đá 20 phút, tủa protein
xuất hiện và có màu trắng đục.
- Hút 450 µl phenol/chloroform/isoamylalcohol cho vào mẫu và lắc nhẹ để
các protein nhỏ hịa tan vào dịch có phenol, sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong
15 phút. Lúc này mẫu hình thành 3 pha: pha trên cùng có chứa DNA plasmid, pha
giữa là protein lớn khơng có khả năng tan và pha cuối cùng là phenol/chloroform
có chứa protein tạp.
- Dùng pipet hút nhẹ nhàng dung dịch pha trên và chuyển chúng sang ống
Eppendorf loại 1,5 ml mới, sau đó dùng 2 lần thể tích cồn tuyệt đổi để tủa DNA
plasmid trong khoảng 20 phút.
- Ly tâm thu tủa ở 13000 vịng/phút trong 15 phút.
- Tủa được làm khơ bằng máy Speed Vac.
- Hòa tan DNA plasmid vào 30 - 40 µl dung dịch TE.
- RNA lẫn trong sản phẩm tách chiết DNA được loại bỏ bằng cách bổ sung
RNase (100 µg/ml), Ủ hỗn hợp trong 30 phút ở 37oC.
- DNA plasmid đã tách chiết được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel
agarose 0,8%.
2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose
Cơ sở lý thuyết
Trong mơi trường có pH trung tính, DNA mang điện tích âm. Do đó, khi đặt
trong một điện trường đều, DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Trên môi
trường chất giá là agarose, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với
tốc độ khác nhau (đoạn DNA có kích thước lớn di chuyển chậm hơn đoạn có kích
thước nhỏ) và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy.

23

Quy trình
Chuẩn bị gel agarose
- Cân bột agarose rồi hịa tan vào đệm TAE 1 X để đạt nồng độ cần thiết.
- Đun sôi cho tới khi tan hết, để dung dịch agarose nguội đến khoảng 50°C thì
đổ vào khn có cài sẵn lược.
- Để gel đơng và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút.
- Nhẹ nhàng rút lược ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1 X
tới khi ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA vào giếng
- Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng
độ DNA cao thấp khác nhau.
- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel. Mẫu
được trộn với loading dye 6X rồi được đưa vào giếng. Chạy điện di bằng dòng một
chiều với hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút. Quan sát sự di chuyển băng
màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di.
Nhuộm DNA bằng Ethidium Bromide
Khi băng màu bromophenol chạy được 2/3 bản gel agarose, ngừng chạy điện
di và nhẹ nhàng gỡ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5
µg/ml trong khoảng 10 phút, rửa lại bằng nước.
Quan sát và chụp ảnh
Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát và chụp lại dưới ánh sáng tử
ngoại λ=302 nm.
2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose
Cơ sở lý thuyết
Đây là phương pháp tinh sạch DNA dựa trên nguyên lý sử dụng một cột có
chứa mạng lưới các sợi thủy tinh để bắt giữ các phân tử DNA sợi kép đã được gắn
với các hạt ion trong đệm gắn. Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân tử DNA sẽ
bị gắn vào mạng lưới, còn các thành phần khác như protein, muối... sẽ bị rửa trôi.

24