KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol a alisol b 23 acetat trong dược liệu

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Phƣơng
(Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và Ths. Nguyễn Thúc
Thu Hƣơng (Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược,
ĐHQGHN) là những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo, góp ý và đưa ra
những ý kiến quý báu để em hồn thiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.TS.
Phƣơng Thiện Thƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để
em hồn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích –
Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và anh Lê
Ngọc Duy – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong suốt
quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Y – Dược đã
dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Sau cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã
luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên em trong suốt q trình học tập, nghiên
cứu và hồn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018
Sinh viên


MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................2
1.1. Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.)..................2
1.1.1. Tên khoa học.....................................................................................2

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố...........................................................2
1.1.3. Bộ phận dùng.................................................................................... 3
1.1.4. Thành phần hóa học.......................................................................... 3
1.1.5. Một số tác dụng dược lý....................................................................7
1.2. Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat.........................................9
1.2.1. Tổng quan về alisol A....................................................................... 9
1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat................................................... 11
1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lượng AA và AB23 trong Trạch tả...13
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới............................................................13
1.3.2. Các nghiên cứu trong nước............................................................. 14
1.3.3. Tiêu chuẩn về dược liệu Trạch tả trong một số Dược điển.............14
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu..................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................16
2.1.2. Hóa chất và dung mơi..................................................................... 17
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu.......................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................17
2.2.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng...............................17
2.2.2. Định lượng AA bằng HPLC............................................................17
2.2.3. Phân tích mẫu thực..........................................................................18
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................18
2.3.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng................................18
2.3.2. Định lượng AA bằng HPLC............................................................19


2.3.3. Phân tích mẫu thực..........................................................................................22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................23
3.1. Định tính AA và AB23 bằng TLC...................................................................23
3.1.1.
Định tính AB23...............................................................................23

3.1.2. Định tính AA...................................................................................24
3.1.3. Định tính AA và AB23 trên một số mẫu Trạch tả bằng sắc ký lớp mỏng.
25
3.2. Định lượng AA bằng HPLC............................................................................27
3.2.1. Lựa chọn pha tĩnh............................................................................27
3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................................... 28
3.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng............................................................... 30
3.3. Ứng dụng phương pháp...................................................................................35
3.4. Bàn luận...........................................................................................................35
3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Trạch tả ở Việt Nam 35
3.4.2. Xây dựng phương pháp định tính....................................................36
3.4.4. Phương pháp định lượng................................................................. 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết
Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học
tắt
AA
Alisol A
ACN
Acetonitrile
AB23
Alisol B 23 - acetate

Tên tiếng Việt
Alisol A

Acetonitril
Alisol B 23 - acetat

AOAC

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội
phân tích

EtOH

Ethanol

Ethanol

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

kl/kl

các

nhà

Hóa

Khối lượng/ khối lượng

LOD

Limid of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limid of Qualification

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

Methanol

MS

Mass Spectrometry

Phổ khối

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

S/N

Signal/Noise

Tín hiệu/nhiễu đường nền

STT
TLC
UVVIS
v/v

Số thứ tự
Thin layer chromatography

Sắc ký bản mỏng

Ultraviolet Visible

Phổ tử ngoại - khả kiến

Volume/volume

Thể tích/thể tích

DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định
lượng AA và AB23 trong Trạch tả

13

2

Bảng 1.2 Chương trình dung mơi theo Dược điển
Hồng Kơng

14

3

Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả

16

4

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết

28

5

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

29

6

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát thời gian chiết

29

7

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống

31

8

Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của AA

32

9

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại

33

10

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp

34

11

Bảng 3.8 Kết quả định lượng AA trên một số mẫu
Trạch tả

35


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên hình vẽ

Trang

1

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả

2

2

Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả

3

3

Hình 1.3 Cơng thức một số triterpenoid trong thân
rễ Trạch tả

4

4

Hình 1.4 Cơng thức một số diterpenoid trong thân
rễ Trạch tả

5

5

Hình 1. 5 Cơng thức một số sequiterpenoid trong
thân rễ Trạch tả

6

6

Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo của AA

9

7

Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo của AB23

11

8

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại
Viện Dược liệu

16

9

Hình 3.1. Khảo sát định tính AB23

23

10

Hình 3.2 Khảo sát định tính AA

24

11

26

12

Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính AA trên một số mẫu
Trạch tả
Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính AB23 trên một số
mẫu Trạch tả

13

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động

28

14

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được lựa chọn

30

15

Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của
phương pháp HPLC - UV

31

16

Hình 3.8 Sắc ký đồ nền mẫu thử tại LOD

32

17

Hình 3.9 Đường chuẩn của AA

33

26


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., tên đồng
danh (Alisma plantago – aquatica). Thuộc họ Trạch tả Alismataceae. Bộ phận
dùng làm thuốc là thân rễ khôn đã cạo sạch vỏ. Trạch tả là một trong những vị
thuốc quý đã được sử dụng lâu đời trong nền Y học cổ truyền Việt Nam và
Trung Hoa với các tác dụng: lợi tiểu, hạ mỡ máu, tăng cường miễn dịch,
kháng viêm, giảm đường huyết…
Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong Trạch tả là các hợp chất
triterpenoids, trong đó có alisol A và alisol B 23 - acetat. AB23 đã được
chứng minh có tác dụng lợi tiểu, chống viêm gan nhiễm mỡ không do rượu,
giảm ung thư buồng trứng, chống dị ứng… Alisol A ngoài hướng tác dụng
chủ yếu trên tế bào viêm gan cịn có tác dụng khác như kháng khuẩn, tăng
cường miễn dịch…
Ở Việt Nam, việc đánh giá chất lượng dược liệu Trạch tả thường được
sử dụng theo Dược điển Việt Nam IV, tuy nhiên các tiêu chuẩn còn hạn chế,

chưa đáp ứng được yêu cầu đánh giá nên chất lượng dược liệu Trạch tả trên
thị trường chưa được đảm bảo. Các nghiên cứu về phân tích thành phần hóa
học trên thế giới hầu hết đều sử dụng alisol B 23 - acetat làm tiêu chí đánh giá
chất lượng dược liệu Trạch tả. Tuy nhiên, ngồi alisol B 23 - acetat thì alisol
A cũng chiếm hàm lượng lớn, có nhiều tác dụng quý với tiềm năng nghiên
cứu, phát triển để ứng dụng trong điều trị. Vì vậy, alisol A cũng là một thành
phần quan trọng, có thể sử dụng làm ―maker‖ trong kiểm nghiệm chất lượng
dược liệu Trạch tả.
Từ những thực tiễn trên, nhằm xây dựng một phương pháp đánh giá
chất lượng dược liệu Trạch tả, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng
phƣơng pháp định tính và định lƣợng alisol A và alisol B 23 - acetat
trong dƣợc liệu Trạch tả (Alisma plantago – aquatica) trồng tại Việt
Nam” với mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định tính và định lượng alisol A và alisol B 23
– acetat trong dược liệu Trạch tả trồng tại Việt Nam.
- Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu Trạch tả.
7


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về cây Trạch tả (Alisma orientale (Sam.) Juzep.)

1.1.1. Tên khoa học
Trạch tả có tên khoa học là Alisma orientale (Sam.) Juzep., thuộc họ
Alismataceae, chi Alisma, có tên khoa học đồng nghĩa khác là Alisma plantago
– aquatica. Ở Việt Nam, Trạch tả còn được gọi là thủy đề, mã đề nước [4].
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo, cao 40-50 cm. Thân rễ hình cầu hoặc hình con quay, nạc,

màu trắng, lá có cuống dài, bẹ to mọc ốp vào nhau, xòe ra như hình hoa thị,
phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, mép ngun lượn sóng, gân lá 5-7 hình
cung.
Cụm hoa mọc trên một cán thẳng dài có khi đến 1m thành chùy có
nhiều vịng hoa xếp thành tầng nhỏ dần về phía ngọn, mỗi tầng phân nhánh
thành những chùy nhỏ; hoa lưỡng tính, màu trắng hay hồng, đài có 3 răng
màu lục, tồn tại đến khi thành quả; tràng hoa 3 cánh có 1 cựa màu vàng nhạt
rất mỏng và rụng sớm; nhị 6 – 9, dẹt, bầu nhiều ô xếp thành một vịng, mỗi ơ
có một nỗn, vịi nhụy mảnh dễ rụng.
Quả bế dẹp, dạng màng, có đài tồn tại.
Mùa hoa quả: tháng 10 – 12.
Chi Alisma L. có khoảng 10 loài, phân bố rải rác từ vùng nhiệt đới đến
vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm. Trạch tả có nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên, Việt Nam... Hiện đã biết có hai lồi được dùng làm thuốc là Trạch
tả (A. plantago – aquatica L.) và loài A. canaliculatum. Ở Việt Nam, Trạch tả
chỉ thấy trồng ở các tỉnh như Thái Bình, Hà Nam, Hải Dương, Hưng Yên [4].

Hình 1.1 Hình ảnh cây và hoa Trạch tả [57,58]


1.1.3. Bộ phận dùng
Dược liệu Trạch tả là thân rễ của cây Trạch tả: Thân rễ thu hoạch vào
tháng 4-5 khi cây chuyển sang màu vàng. Loại bỏ rễ con, cạo vỏ ngồi và rửa
sạch, phơi hay sấy khơ.
Khi dùng, ủ thân rễ cho mềm, thái lát, phơi khô (dùng sống) hoặc tẩm
muối (100 g Trạch tả với 2 g muối ăn hịa trong 60 ml nước), sao vàng [4].

and
Hình 1.2 Thân rễ và thân rễ thái lát Trạch tả [56]
1.1.4. Thành phần hóa học.

Ở Trạch tả, thân rễ là bộ phận truyền thống được sử dụng trong Y học
cổ truyền nên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các thành phần hóa
học ở thân rễ.
Theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây, các terpenoid được
coi là thành phần chính trong Trạch tả [17]. Với hợp chất đặc trưng là
triterpenoid protostane (alisol A – F và dẫn xuất) và sesquiterpenoid guaiane
(alismol, alismoxide, orientalols A – F và orientalols sulfat). Ngoài ra, Trạch
tả cũng chứa một lượng nhỏ diterpenoid, flavonoid, alkaloid, asparagine,
phytosterol, acid béo và nhựa.
Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học trong thân rễ Trạch tả
cịn ít. Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006)
với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc
ký kết hợp đã phân lập được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol, octadeca 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester, AA, AA
24 – acetat và alisol G [2].


1.1.4.1. Các triterpenoid
Các triterpenoid được coi là thành phần chính có hoạt tính sinh học
trong rễ Trạch tả. Đến nay, 55 triterpenoid đã được phân lập và xác định cấu
trúc.
Ngay từ năm 1968, Murata và cộng sự đã phân lập được AA (1), alisol
A 24 – acetat (2), alisol B (3), AB23 (4) và alisol E (5) từ thân rễ Trạch tả
[30]. Sau đó, 4 hợp chất đã biết và hợp chất mới là alisol C 23 – acetat (6)
được tách ra từ chiết xuất methanol của thân rễ [31]. Alisol O (7) và alisol P
(8) được phân lập năm 2008 [53]. Gần đây, năm 2012 Jin và cộng sự đã phân
lập được một triterpenoid mới là alisol Q 23 – acetat (9) [18].

(1)
(2)
(5)

Hợp chất
AA
alisol A 24 – acetat
alisol E

(3)
(4)
(6)

R1
OH
OH
OH

R2
OH
OH
OH

R3
OH
OH
OH

R4
OH
OH
OH

R5
H
O
H

R6
O
O
O

Hợp chất

R1

R2

R3

R4

R5

R6

alisol B
AB23
alisol C 23 – acetat

O
O

O

H
H
H

OH
OH
OH

H
H
H

H
H
O

OH
OAc
OAc

(7) alisol O
(8) alisol P
(9) alisol Q 23 – acetat
Hình 1.3 Cơng thức một số triterpenoid trong thân rễ Trạch tả
1.1.4.2. Các diterpenoid


Cho đến nay, mới chỉ có 3 diterpenoid được phân lập và xác định. Năm

1994, kaurane-2,12-dione (10) được phân lập từ thân rễ Trạch tả bởi
Nakajima và cộng sự [32]. Sau đó, Peng và cộng sự phân lập được hai
diterpenoid mới là oriediterpenol (11) và oriediterpenoside (12) từ thân rễ
Trạch tả [13].

(10) kaurane-2,12-dione

(11) oriediterpenol

(12) oriediterpenoside
Hình 1.4 Cơng thức một số diterpenoid trong thân rễ Trạch tả
1.1.4.3. Các sequiterpenoid
Có khoảng 36 sequiterpenoid đã được xác định, chia thành 4 nhóm:
guaiane, germaraerane, eudesmane và oplopanane.
Alismol (13) và alismoxide (14) thuộc nhóm guaiane là các
sequiterpenoid đầu tiên được phân lập, bởi Yoshiteru và cộng sự (1983) [33].
Hai germaraerane sequiterpenes (germaraerane C (15) và germaraerane D
(16)) và dẫn chất của alismol (orientalol A (17), B, C và sulfoorientalol A, B
(18), C, D) [45] [46]. Năm 1994, Nakajima và cộng sự đã phân lập được hai
sesquiterpenes là 10-O-methyl-alismoxit (19) và eudesma-4(14)-en-1,6-diol
(20) trong Trạch tả đã qua chế biến [32]. Năm 2001, orientalol E (21) thuộc
nhóm oplopanane được phân lập bởi Peng và cộng sự [34].


(13) alismol

(14,17,18,19)

Hợp chất

R1

R2

R3

R4

(14)

Alismoxide

CH3

OH

OH

CH3

(17)

Orientalol A

OH

OH

OH

CH3

(18)

Sulfoorientalol B

HSO3

OH

OH

CH3

(19)

10-O-methyl-alismoxit

OCH3

OH

OH

OCH3

Hợp chất
(15) Germaraerane C
(16) Germaraerane D

(20) eudesma-4(14)-en-1,6-diol

(21) orientalol E

Hình 1. 5 Cơng thức một số sequiterpenoid trong thân rễ Trạch tả
1.1.4.4. Các hợp chất khác
Có khoảng 9 flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Trạch
tả: robustaflavon, amentoflavon, 2,20,4 – trihydroxylchalcone, daidzein,
calycosin, 7 – hydroxyl – coumarin, apigene, luteolin, emodin [15,24].
Năm 1993, Tomoda và cộng sự phân lập được alisman PIIIF thuộc dẫn
chất polysaccharides [39]. Sau đó, 2 polysacchrides khác được phân lập là
alisman PII và alisman SI [37,40].
Ngoài ra, trong Trạch tả còn xác định được một số chất khác như:
dulcitol, daucosterol [44], alismin [36].


1.1.5. Một số tác dụng dƣợc lý
 Lợi tiểu
Trạch tả đã được sử dụng lâu đời trong Y học cổ truyền Trung Hoa với
mục đích điều trị thiểu niệu. Nghiên cứu trên chuột cho thấy dịch chiết EtOH
Trạch tả và alisol A 24-acetat ở liều 20 mg/kg làm tăng đáng kể lượng nước
tiểu nhưng thấp hơn hydroclothiazid [40,41]. Nghiên cứu trên chuột SpragueDawley cho thấy dịch chiết ethanol Trạch tả có tác dụng lợi tiểu ở liều thấp
(2,5 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg) nhưng ở liều cao (20, 40 và 80 mg/kg) lại
làm giảm đáng kể lượng nước tiểu [9].
Tương tự, khi khảo sát với các dịch chiết khác, cho thấy: Dịch chiết nbutanol (12,5; 25 và 50 mg/kg) và ethyl acetat (100; 400 mg/kg) làm tăng
lượng nước tiểu. Dịch chiết n-butanol (75; 100 mg/kg) và ethyl acetat (800
mg/kg) làm giảm lượng nước tiểu [7].
Điều đó cho thấy tác động sinh học trên thận của các dịch chiết Trạch
tả ở các hàm lượng khác nhau là khác nhau, nên liều lượng sử dụng cần được
chú ý nhiều hơn trong các ứng dụng lâm sàng.

Gần đây, nghiên cứu bởi Zhang và cộng sự (2017) nhằm đánh giá tính
tương thích giữa năm triterpen chính trong Trạch tả với tác dụng lợi tiểu. Kết
quả cho thấy tỷ lệ thành phần thích hợp nhất trong hoạt động lợi tiểu là: AB23
: alisol B : alisol A 24-acetate : AA : alisol C 23-acetate (7.2: 0.6: 2.8: 3.0:
6.4) [52].
 Hạ Lipid máu.
Từ năm 1970, các thí nghiệm trên chuột Sprague-Dawley cho thấy tác
dụng hạ lipid máu khi dùng alisol A 24-acetat liều 425 mg/kg [16]. Nghiên
cứu gần đây trên chuột tăng lipid máu cho thấy Trạch tả liều 2,26 g/kg/ngày
làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride trong huyết thanh và gan, nhưng
làm tăng nồng độ HDL huyết thanh. Từ đó, người ta cho rằng Trạch tả làm
giảm sự tổng hợp cholesterol ở gan thay vì làm tăng q trình chuyển hóa
cholesterol [10].
Một nghiên cứu khác trên chuột gây đột biến gen apoE và làm tăng sự
biểu hiện heparan sulfate proteoglycan ở gan cho thấy Trạch tả và simvastatin


ở liều 10 lần so với liều sử dụng trên người có ý nghĩa điều trị với chứng xơ
vữa động mạch, khi làm giảm đồng thời cholesterol toàn phần và LDL [35].
Nhìn chung, Trạch tả có thể làm giảm cholesterol trên chuột để dự
phòng tăng lipid máu. Tuy nhiên các nghiên cứu còn hạn chế để ứng dụng
trong điều trị lâm sàng.
 Hạ đƣờng huyết.
Từ lâu đời, Trạch tả đã được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung
Quốc để điều trị tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy các triterpenes loại
protostane có hoạt tính hạ đường huyết thơng qua cơ chế ức chế hoạt động αglucosidase và thúc đẩy sự hấp thu glucose, mà không làm tăng adipogenesis
như thiazolidinediones [23]. Tuy nhiên, các thử nghiệm mới được thực hiện
trên in vitro và cần được nghiên cứu sâu hơn trên cơ thể người để ứng dụng
trong lâm sàng.
 Ức chế hình thành sỏi thận

Tác dụng ức chế sự hình thành sỏi thận đã được chứng minh bằng
các nghiên cứu dược lý hiện đại trên chuột. Nghiên cứu cho thấy khi cho một
nhóm chuột được điều trị trong 4 tuần với 0,5 mL/kg triterpenoids thì hàm
lượng canxi trong mơ thận, lượng canxi bài tiết trong nước tiểu 24h, creatinin
huyết thanh và nồng độ ure trong máu giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng
[6,29]. Nghiên cứu bởi Cao và cộng sự cũng cho thấy, khi sử dụng 1
mL/ngày các thành phần có hoạt tính của Trạch tả trong 28 ngày có thể làm
giảm sự hình thành canxi oxalate ở thận [5].
 Tăng cƣờng miễn dịch
Tác động của Trạch tả trên hệ miễn dịch đã được đánh giá trên chuột
bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol
Trạch tả liều 50 mg/kg, 200 mg/kg có tác động tích cực trên bệnh nhân có
hiện tượng arthus. Những kết quả chỉ ra rằng dịch chiết Trạch tả có ảnh
hưởng trên các phản ứng dị ứng khác nhau, đặc biệt là dị ứng loại III [20].
Nghiên cứu bởi Lee và cộng sự (2012) cho thấy dịch chiết EtOH 70%
của Trạch tả ức chế đáng kể 5 – lipoxygenase, chất xúc tác quá trình sản xuất
leukotriene từ bạch cầu ưa base ở chuột và sự giải phóng β-hexosaminidase


bởi các tế bào kháng nguyên RBL-2H3. Nó cũng làm suy yếu phản ứng quá
mẫn muộn ở chuột [21].
 Chống viêm
Hoạt động chống viêm của Trạch tả mới được nghiên cứu trong thời
gian gần đây. Khi cho chuột uống dịch chiết Trạch tả liều 0,3 g/kg hoặc 1,2
g/kg trong 14 ngày, sau đó gây tồn thương phổi bằng cách tiêm
lipopolysaccharide (0,01 g/kg). Nhận thấy có sự cải thiện tổn thương phổi cấp
đáng kể do tác động ức chế sự xâm nhập của bạch cầu trung tính, ức chế sự
biểu hiện gen COX – 2, IL – 1B [14]. Nghiên cứu khác bởi Kim và cộng sự
(2013) cũng cho kết quả, chiết xuất Trạch tả giúp tăng tỷ lệ sống sót ở chuột
ngay cả với liều độc lipopolysaccharide [19].

 Chống khối u
Trong nghiên cứu của Fong và cộng sự (2007) cho thấy tác dụng ức
chế hiệp đồng tăng lên khi kết hợp dịch chiết Trạch tả 25 mg/mL với thuốc
chống ung thư: actinomycin D, puromycin, paclitaxel, vinblastine và
doxorubicin, trên quá trình biểu hiện P-glycoprotein [12]. AB23 được coi
như ứng cử viên tiềm năng cho việc đảo ngược hiện tượng đa kháng thuốc
trên bệnh nhân ung thư [41].
1.2.

Tổng quan về alisol A và alisol B 23 – acetat

1.2.1. Tổng quan về alisol A
1.2.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất

Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo của AA
Công thức phân tử: C30H50O5
Tên khoa học (IUPAC): (5R, 8S, 9S,10S, 11S, 14R) – 11 – hydroxy –
4,4,8,10,14 – pentamethyl – 17 – [(2R, 4S, 5R) – 4,5,6 – trihydroxy – 6 –


methylheptan – 2 – yl] – 1,2,5,6,7,9,11,12,15,16 – decahydrocyclopentan [a]
phenathren – 3 – one.
Tên thơng thường: alisol A
Tính chất:

0

- Dạng bột, màu trắng, khơng mùi, nóng chảy ở 90 - 91 C.
- Trọng lượng phân tử: 490,725 g/mol.

1.2.1.2. Tác dụng dược lý.
 Chống virus viêm gan B.
Nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh rằng những thay đổi đơn giản trong
cấu trúc gốc AA có thể tạo ra một số dẫn xuất tiềm năng chống lại HBV. 40
dẫn xuất của AA được tổng hợp và khảo sát trong ảnh hưởng chống virus
viêm gan B in vitro. Và thu được 14 chất tiềm năng [50]. Hợp chất 6a cho
hoạt tính cao chống lại sự biểu hiện của kháng nguyên HBV bề mặt (IC50=
0,024 mM), kháng nguyên HBV e (IC50=0,028 mM) (SIHBsAg >108,
SIHBeAg > 93) [49].

AA

6a

Thử nghiệm khác trên 32 dẫn xuất tetra-acyl hóa của AA cho thấy các
hợp chất A1, A23, A24 có hoạt tính cao chống lại sự tiết kháng ngun bề
mặt HBV với giá trị IC50 tương ứng là 0,0048, 0,0044, 0,014 mM, kháng
nguyên HBV e với giá trị IC50 tương ứng 0,011, 0,012, 0,018 mM; SIHBsAg
> 333, SIHBeAg > 145; SIHBsAg = 209, SIHBeAg = 77; SIHBsAg > 200,
SIHBeAg > 156. Nghiên cứu bổ sung trên chuột cho thấy hợp chất A1 có lợi
ích về dược động học (t1/2=1,63h) (F=40,9%) [51].

10


A1: R = Ac

A23: R =

A24: R =

 Kháng khuẩn.
Nghiên cứu gần đây bởi Ma và cộng sự (2016) cho thấy AA có hoạt
tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương Bacillus subtilis và
Staphylococcus aureus với giá trị MIC là 12,5-100mg/mL [25].
 Tăng cƣờng miễn dịch.
Nghiên cứu đánh giá trên chuột bởi Kubo và cộng sự từ năm 1997 cho
thấy AA hàm lượng 0,05mmol/kg, 0,2mmol/kg có tác động tích cực trên bệnh
nhân có hiện tượng arthus [20].
1.2.2. Tổng quan về alisol B 23 – acetat
1.2.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất

Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo của AB23
Cơng thức phân tử: C32H50O5
Tên khoa học (IUPAC): [(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3[(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]
acetate.
Tên thông thường: alisol B 23 - acetat
Tính chất: Dạng bột, màu trắng. Trọng lượng phân tử: 514,747 g/mol.
17


1.2.2.2. Một số tác dụng dƣợc lý.
 Trên thận.
Nghiên cứu bởi Chen và cộng sự cho thấy trên những bệnh nhân thận
mãn tính có sự kích hoạt các trục RAS/Wnt/ -catein dẫn đến tổn thương các
tế bào biểu mô ống thận, đã được cải thiện khi sử dụng AB23 [8].
 Chống viêm gan.
Năm 2017, một nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá tác động bảo vệ
của AB23 với bệnh viêm gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) ở chuột.
NASH được gây ra bằng cách cho chuột ăn chế độ thiếu methionine và
choline trong 4 tuần. Sau đó mẫu máu và gan được thu thập. Kết quả chỉ ra

khi điều trị với AB23 làm giảm đáng kể sự tích lũy triglycerid ở gan, từ đó
làm giảm nguy cơ viêm, xơ gan [28].
Một nghiên cứu khác chứng minh tác dụng bảo vệ của AB23 chống lại
độc tính gan và ứ mật gây ra bởi 17α-ethinylestradiol (EE). AB23 làm giảm
tổng hợp acid mật thông qua việc ức chế biểu hiện gen Cyp7a1 và Cyp8b1,
làm tăng chuyển hóa acid mật qua việc kích thích biểu hiện gen Sult2a1 [26].
AB23 cũng giúp tăng sinh tế bào gan, có tiềm năng trở thành lựa chọn điều trị
mới ở những bệnh nhân cắt gan [27], kháng virus viêm gan B [17].
 Kháng tế bào ung thƣ buồng trứng.
Năm 2016, Zhang và cộng sự đã tiến hành xét nghiệm MTT cùng với
việc phân tích chu trình tế bào để đánh giá khả năng tồn tại của tế bào ung thư
buồng trứng sau khi điều trị với AB23. Kết quả cho thấy AB23 ức chế đáng
kể biểu hiện của cả ba dòng tế bào ung thư buồng trứng, giảm mức độ biểu
hiện của các protein CDK4, CDK6 và cyclin D, ngăn chặn chu trình tế bào ở
pha G1. AB23 ức chế quá trình tăng sinh, di căn và xâm lấn của các tế bào
ung thư buồng trứng [48].
 Các tác dụng khác:
Ngồi ra, AB23 cịn có tác dụng kháng khuẩn [18], chống dị ứng [21],
ức chế miễn dịch [47], ức chế quá trình kháng thuốc qua trung gian Pglycoprotein [41]…


1.3. Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng AA và AB23 trong Trạch tả
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về định lượng AA và AB23 trong
Trạch tả
TLTK
[55]

Đối tƣợng phân tích

Điều kiện phân tích

AA, alisol A 24-- Dung mơi chiết: MeOH
- Phương pháp chiết: Siêu âm
acetate và AB23
- Điều kiện sắc ký
+ Pha tnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm )
+ Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 210 nm và 254 nm
+ Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
O

+ Nhiệt độ cột: 35 C
+ Thể tích tiêm mẫu: 10µL
[54]

Alisol A 24-acetate- Dung môi chiết: ACN
và AB23
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kin sc ký
+ Pha tnh: C18 (4,6 ì 250mm; 5àm )
+ Pha động: ACN:W (65:35)
+ Bước sóng phát hiện: 208 nm
+ Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
O

+ Nhiệt độ cột: 25 C
[22]

AB23

- Dung môi chiết: ACN
- Phương pháp chiết: Siêu âm
- Điều kiện sắc ký
+ Pha tĩnh: C18 (4,6 × 250mm; 5µm )
+ Pha động: ACN:W (75:25)
+ Bước sóng phát hiện: 215 nm
+ Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút


1.3.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về định tính, định lượng các hoạt
chất chính trong dược liệu Trạch tả cịn rất ít.
Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Văn Kiệm và cộng sự (2006)
với mẫu Trạch tả thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, bằng các phương pháp sắc
ký kết hợp đã phân lập và xác định được bảy chất: alismoxid, (+) pinoresinol,
octadeca - 9,12 – dienoic acid và octadeca – 9,12 – dienoic acid methyl ester,
AA, AA 24 – acetat và alisol G [2].
1.3.3. Tiêu chuẩn về dƣợc liệu Trạch tả trong một số Dƣợc điển
Hiện nay, đã có nhiều quốc gia đưa chuyên luận dược liệu Trạch tả vào
quy định trong Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông, Việt Nam…
Dược điển Trung Quốc (2015) quy định sử dụng HPLC để định lượng
AB23 trong thân rễ Trạch tả. Quy trình xử lý mẫu như sau: 0,5 g mẫu dược
liệu được chiết siêu âm với 25 ml ACN trong 30 phút. Hệ dung môi pha động
sử dụng là ACN:W (73:27, v/v), detector UV ở bước sóng 208nm, cột C18.
Dược điển Trung Quốc quy định, mẫu thử phải có chứa ít nhất 0,050% AB23
tính theo mẫu khơ kiệt [9].
Dược điển Hồng Kơng cũng sử dụng HPLC để định lượng alisol B
monoacetate: 1 g mẫu dược liệu được chiết siêu âm với 20 mL MeOH trong
30 phút. Detector UV ở bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Pha

động được lựa chọn là ACN:W với chương trình rửa giải:
Bảng 1.2 Chương trình dung môi theo Dược điển Hồng Kông
Thời gian

W

ACN

0-10

100

0

10-45

100 - 0

0 - 100

45-60

0

100

Dược điển Hồng Kơng cũng quy định, mẫu phải có chứa ít nhất 0,082%
alisol B monoacetat [38].

Trong chuyên luận Trạch tả (DĐVN IV), chưa có quy định về chỉ tiêu
định lượng hoạt chất chính, chỉ có các quy định về các tiêu chí thơng thường:
độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan trong acid. Vì vậy, chuyên luận Trạch tả
(DĐVN IV) chưa đánh giá chính xác được chất lượng dược liệu Trạch tả Việt
Nam cũng như mẫu nhập khẩu.


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu là mẫu dược liệu Trạch tả được thu hái tại Ninh
Bình và lưu trữ tại Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu từ tháng
3/2018. Ngồi ra, chúng tơi cịn tiến hành thu thập các mẫu dược liệu Trạch tả
tại một số cơ sở trên thị trường Hà Nội để tiến hành áp dụng phương pháp đã
xây dựng.

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Trạch tả lưu trữ tại Viện Dược liệu
Bảng 2.1 Mẫu Trạch tả
STT

Kí hiệu mẫu

Nguồn gốc mẫu

1

M1

Vũ Thị Bình 30 Lãn Ơng

2

M2

Nguyễn Thị Ban 32 Lãn Ông

3

M3

Nguyễn Thị Sáu 54 Lãn Ông

4

M4

Tú Anh 60 Lãn Ơng

5

M5

Phan Thị Tý 63A Lãn Ơng

6

M6

Hịa Hưng 69A Lãn Ơng

7

M7

Ninh Bình


2.1.2. Hóa chất và dung mơi
Chất chuẩn AA do hãng Biopurify Phytochemicals Ltd cung cấp, độ
tinh khiết đạt 98%.
Chất chuẩn AB23 do hãng Sigma – Aldrich cung cấp, độ tinh khiết đạt
98%
Các dung mơi hóa chất dùng cho phân tích HPLC đều đạt tiêu chuẩn
.
hóa chất tinh khiết của hãng Merck.
Các dung mơi hóa chất dùng cho xử lý mẫu đều đạt chuẩn tinh khiết
phân tích.
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Cân phân tích (Sartorius, BP-221S).
Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M).
Tủ sấy (Memmert, ULM 500).
Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45).
Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15LC).
Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5).
Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Shimadzu): Bơm LC20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Shimadzu.
Các dụng cụ thông thường ở phịng thí nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng.
- Khảo sát hệ dung môi pha động.

2.2.2. Định lƣợng AA bằng HPLC.
2.2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng.
- Khảo sát pha động.
- Khảo sát quy trình xử lý mẫu.


+ Dung môi chiết
+ Tỷ lệ dung môi chiết.
+ Thời gian chiết.
2.2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.
-

Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp.
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn.
Tính thích hợp hệ thống.
Độ lặp lại.
Độ đúng.

2.2.3. Phân tích mẫu thực
Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính AA và AB23; định
lượng AA trong một số mẫu Trạch tả trên thị trường.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Định tính AA và AB23 bằng sắc ký lớp mỏng.
 Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g dược liệu đã tán nhỏ, chiết siêu âm với
30 ml MeOH trong 30 phút, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, cô cạn
dung môi và hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, thu được dịch dùng để chấm sắc
ký lớp mỏng [38].
Dung dịch đối chiếu:

- Cân khoảng 1 mg chuẩn AA, hòa tan trong khoảng 2 ml MeOH.
- Cân khoảng 1 mg chuẩn AB23, hòa tan trong khoảng 2 ml
MeOH.
 Điều kiện sắc ký:
- Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254.
- Pha động:
Để tìm được hệ dung mơi phù hợp, cho các vết tách biệt nhau trên bản
mỏng và Rf của AA và AB23 trong khoảng 0,2 – 0,8. Chúng tôi tiến
hành khảo sát trên các hệ sau:


+ Định tính AA:
Hệ dung mơi A’: hexan: aceton (1:1)
Hệ dung môi B’: hexan: aceton (1,5:1)
Hệ dung môi C’: hexan: aceton (2:1)
+ Định tính AB23:
Hệ dung mơi A: petroleum ete : ethyl acetat (8:9)
Hệ dung môi B: petroleum ete : ethyl acetat (2,5:1)
Hệ dung môi C: hexan : aceton (1,5:1)
- Thuốc thử: acid sulfuric 10% trong ethanol.
2.3.2. Định lƣợng AA bằng HPLC
2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử:
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu Trạch tả cho
vào ống ly tâm 50 ml, thêm chính xác khoảng 25 ml EtOH. Đem siêu âm
trong 30 phút. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm.
Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc AA bằng cách cân chính
xác khoảng 5 mg chuẩn AA, hịa tan trong chính xác khoảng 5 ml MeOH
được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha lỗng thành dãy các
dung dịch chuẩn trung gian có khoảng nồng độ thích hợp.
2.3.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa
giải với pha động gồm ACN (kênh A) phối hợp với H2O (kênh B) theo các tỷ
lệ khác nhau.
Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời
gian lưu (tR) của AA, độ phân giải (RS) và hệ số kéo đuôi của pic (AS). RS ≥
1,5; AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; tR của các chất phân tích khơng q dài
nhưng phải đảm bảo tách xa nhau.
2.3.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.
- Khảo sát dung môi chiết: Khảo sát các dung môi chiết là EtOH, hỗn
hợp MeOH : H2O với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi
cho hiệu suất chiết cao nhất.