KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (DL và DLS) ứng dụng phương pháp docking phân tử trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ thể interleukin, 6 hướng điều trị VKDT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện:

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING
PHÂN TỬ TRONG SÀNG LỌC TÌM KIẾM
HỢP CHẤT ỨC CHẾ THỤ THỂ
INTERLEUKIN - 6 HƯỚNG ĐIỀU TRỊ
VIÊM KHỚP DẠNG THẤP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Khóa:
Người hướng dẫn: 1.
2.

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành
tới TS. Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ
truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tình
chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tơi hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại
học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tơi từ những bước đi ban đầu khi
nhận đề tài.
Bên cạnh đó, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi được làm
khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua.

Sau cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và
bạn bè ln sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong q tình học tập,
nghiên cứu hồn thành luận văn.
Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện cịn
hạn hẹp, tơi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tơi rất mong nhận được những ý
kiến đóng góp của các thầy cơ để khóa luận của tơi được hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, Ngày 30 tháng 4 năm 2018
Sinh Viên


DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Tên viết tắt

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

CRP

C-reactive protein

Protein phản ứng C

CSDL

Cơ sở dữ liệu

FDA

Food and Drug Administation

Cơ quan Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa
Kỳ

GA

Genetic Algorithm

Thuật giải di truyền

HBA

Hydro bond acceptor

Trung tâm nhận liên kết
hydro

HBD

Hydro bond donor

Trung tâm cho liên liên
kết hydro

HTS

High throughput screening

Sàng lọc thông lượng cao

IL-6

Interleukin 6

Interleukin 6

IL-6R

Interleukin 6 receptor

Thụ thể Interleukin 6

MIL-6R

membrane-bound Interleukin
6 receptor

Thụ thể Interleukin 6 bám
màng tế bào

MW

Molecular weight

Khối lượng phân tử

RA

Rheumatoid Arthritis

Viêm khớp dạng thấp


SIL-6R

soluble Interleukin-6 receptor

Thụ thể Interleukin 6 dạng
hòa tan

SVBVS

Structure-Based Virtual
Screening

Sàng lọc ảo dựa trên cấu
trúc

VEGF

Vascular Endothelial Growth
Factor

Yếu tố phát triển nội mạc
mạch máu

VNPD

Vietnamese natural product
Database

Cơ sở dữ liệu hợp chất
thiên nhiên Việt Nam


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp..........................................................4
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6.....................................5
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó. Hai IL6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp với vùng
màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng).........................................5
Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc................................................7
Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh
qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu ( />Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU........................................................................13
Hình 3.1: Minh họa kết quả sàng lọc...................................................................................16
Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong trung tâm
hoạt động của IL-6....................................................................................................................... 17
Hình 3.3: Minh họa 2 chiều tương tác của (-)-Hydnocarpin trong trung tâm
hoạt động của IL-6....................................................................................................................... 24
Hình 3.4: Minh họa 2 chiều tương tác của 24-methylene cycloartane-3β,21diol trong trung tâm hoạt động của IL-6............................................................................25
Hình 3.5: Minh họa 2 chiều tương tác của 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta7,24-dien-26-oic acid trong trung tâm hoạt động của Il-6.........................................26
Hình 3.6: Minh họa 2 chiều tương tác của 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-mangostin
trong trung tâm hoạt động của Il-6....................................................................................... 27
Hình 3.8: Minh họa 2 chiều tương tác của 3-epibartogenic acid trong trung
tâm hoạt động của IL-6.............................................................................................................. 29
Hình 3.9: Minh họa 2 chiều tương tác của 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic
acid trong trung tâm hoạt động của IL-6........................................................................... 30
Hình 3.10: Minh họa 2 chiều tương tác của 6-O-benzoyl-α-mangostin trong

trung tâm hoạt động của Il-6................................................................................................... 31
Hình 3.11: Minh họa 2 chiều tương tác của 9-hydroxycanthin-6-Oglucopyranoside trong trung tâm hoạt động của IL-6..................................................32
Hình 3.12: Minh họa 2 chiều tương tác của apigenin 7-O-β-D-glucosid trong
trung tâm hoạt động của IL-6.................................................................................................. 33


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả phân tích dữ liệu docking phân tử..................................................18
Bảng 3.2 Tính tốn các thơng số hố lý trong quy tắc 5 Lipinski của 10 hợp
chất được chọn............................................................................................................................... 22


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp....................................................3
1.2 Tổng quan về Interleukin-6..........................................................................4
1.2.1Sợ lược về IL-6............................................................................................4
1.2.2Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp....................................5
1.2.3Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6.................................. 7
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc.................................................... 7
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc.......................................................................8
1.5 Phương pháp Docking.................................................................................9
1.5.1Đại cương về phương pháp Protein docking............................................... 9

1.5.2Quy trình Docking.....................................................................................10
CHƯƠNG 2- NGUYÊN
NGHIÊN CỨU

LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP
12

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu............................................................12
2.2 Nội dung nghiên cứu:................................................................................ 13
2.3 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................14
2.3.1Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski........................................................14
2.3.2Sàng lọc bằng Docking..............................................................................14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ............................................................................... 16
3.1......................................Kết quả sàng lọc bằng quy tắc số 5 của Lipinski 16
3.2 Sàng lọc docking....................................................................................... 16
3.3 Chọn 10 hợp chất tốt nhất từ kết quả Docking..........................................18
3.4 . Đặc điểm hoá lý của các hợp chất được chọn......................................... 22
3.5 Đặc điểm chi tiết từng chất theo tương tác với Interleukin-6 và thông tin
về cây dược liệu..............................................................................................23


CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 35
4.1.Về kết quả.................................................................................................... 35
4.2.Về phương pháp........................................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................39

ĐẶT VẤN ĐỀ
Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng điều chỉnh đáp ứng
miễn dịch và gây ra các phản ứng cấp tính. Mặc dù có vai trị quan trọng với các
hoạt động sinh lý nhưng việc sản sinh không kiểm soát IL-6 lại liên quan đến các
bệnh viêm miễn dịch IMID bao gồm cả bệnh viêm khớp dạng thấp (rheumatoid
arthritis, RA) [25], do đó ức chế IL-6 có thể được xem là một hướng đi đầy tiềm
năng trong điều trị bệnh RA. Madindoline A là hợp chất tự nhiên có tác dụng ức
chế chọn lọc IL-6, nhưng khó phát triển thành thuốc do sự khan hiếm nguồn
nguyên liệu cùng với quá trình sản xuất phức tạp, tốn kém [17]. Thuốc điều trị
RA hiện nay nhiều tác dụng phụ và đắt tiền, đó là lý do giới nghiên cứu hiện rất
quan tâm đến các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cho điều trị RA.
Nguồn thực vật phong phú và cây thuốc Việt Nam được xác định có chứa
các hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý và cũng là nguồn nguyên liệu quý
để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế IL-6. Do số lượng các hợp chất tự
nhiên rất lớn, nhằm tiết kiệm và nâng cao hiệu quả tìm kiếm, các phương pháp
sàng lọc hiệu năng cao sử dụng máy tính đã trở thành một cơng cụ rất hữu ích hỗ
trợ q trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Trong đó, docking là một trong
những phương pháp phổ biến nhất. Phương pháp này dựa trên cấu trúc đích phân
tử để dự đốn, với độ chính xác khá cao, sự hình thành liên kết của cấu tử (các
chất cần sàng lọc) với đích phân tử của nó (thường có bản chất là protein). Nhờ
đó, chúng ta tìm được vị trí và cấu hình phù hợp nhất để cơ chất gắn kết với
protein.
Từ các phân tích nêu trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu khóa luận “Ứng
dụng phương pháp docking phân từ trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ
thể Interleukin-6 hướng điều trị viêm khớp dạng thấp” với 2 mục tiêu chính:
1. Sàng lọc và tìm kiếm hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế IL-6 bằng phương
pháp docking.

9

2. Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu được sau q
trình sàng lọc, thơng qua chỉ số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dược
liệu.


CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp
Rheumatoid arthritis (RA) là bệnh viêm khớp mạn tính phổ biến với đặc
trưng là viêm đa khớp, gây tê cứng khớp, đau và sưng và có thể tổn thương cơ
quan khác. Theo thống kê, hàng năm ở nước ta có khoảng 750 – 800 người mới
mắc bệnh viêm đa khớp dạng thấp trên một triệu dân từ 15 tuổi trở lên. Tỷ lệ
mắc bệnh là 0,5% dân số, trong đó 80% là nữ giới. Mặc dù ta khơng xác định
được nguyên nhân chính xác gây ra bệnh viêm khớp dạng thấp, bệnh được coi là
có tính chất di truyền [18].

Bệnh viêm khớp dạng thấp hiện nay được cho là bệnh tự miễn []. Khi kháng nguyên xâm

and
tương bào và sản xuất ra các globulin miễn dịch là các thể tự kháng.
Tại màng hoạt dịch khớp có tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch
kháng nguyên – kháng thể, do đó có thực bào xuất hiện với sự hiện diện của các bạch cầu

of

cùng sự xâm nhập một loạt các tế bào viêm khác hình thành nên màng mạch
(mảng pannus). Mảng pannus xâm lấn vào đầu xương, sụn khớp và các enzym tiêu huỷ

©

thực hiện phản ứng viêm và phá hủy khớp), trong đó lympho T đóng vai trị


trung tâm. Dựa trên sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh này, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra các thuốc kí

Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp
1.2 Tổng quan về Interleukin-6
1.2.1 Sợ lược về IL-6
IL-6 là một glycopeptide 26 kDa có gen mã hóa được tìm thấy trên nhiễm
sắc thể số 7, gồm có 212 axit amin được bố trí trong bốn chuỗi α. Nó được tạo ra
bởi nhiều loại tế bào khác nhau, như tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân,
nguyên bào sợi, tế bào nội mô và một số tế bào khối u [27].
IL-6 được tìm thấy nhiều ở dịch ổ khớp của bệnh nhân RA và là nguyên
nhân chính cho nhiều tác dụng tại chỗ và tồn thân ở bệnh này. IL-6 kết hợp trưc
tiếp với phức hợp thụ thể màng IL-6 (membrane-bound Interleukin 6 receptor –
MIL-6R) và glycoprotein-130 dẫn tới hoạt hóa tế bào viêm như đại thực bào và
bạch cầu trung tính từ đó kích hoạt các phản ứng viêm, gây hủy hoại sụn khớp,
xương. IL-6 cũng có khả năng hoạt hóa các tế bào khơng có thụ thể màng IL-6
miễn có chứa phổ biến thụ thể gp-130. Cơ chế này liên quan tới thụ thể dạng hòa
tan của IL-6 (soluble Interleukin-6 receptor – SIL-6R). Sự gia tăng nồng độ IL-6


cũng như nồng độ thụ thể IL-6 dạng hòa tan có liên quan đến mức độ trầm trọng
và sự tiến triển của bệnh [2, 11].

Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6
Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phản ứng viêm của IL-6: Truyền tín
hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trị của MIL-6R.
Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thơng qua SIL-6R [27]

Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó.
Hai IL-6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp
với vùng màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng)
1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp.
RA được đặc trưng bởi sự gia tăng yếu tố dạng thấp (kháng thể IgM và
IgG RF) trong cả huyết thanh và khớp. Tế bào B có vai trị trong việc tạo ra các


kháng thể này chứng tỏ ức chế tế bào B là một phương hướng điều trị bệnh RA.
IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến q
trình phát triển của nó [2].
Trong pha viêm cấp tính trong của bệnh RA, bạch cầu đơn nhân, đại thực
bào và các tế bào nội mơ giải phóng IL-6, kèm theo tăng bạch cầu trung tính tại
dịch khớp. Bạch cầu trung tính có khả năng giải phóng các enzym phân giải
protein và chất trung gian nên có vai trị quan trọng trong hiện tượng viêm và
phá hủy khớp ở bệnh RA. IL-6 tác động trực tiếp trên bạch cầu trung tính qua
thụ thể của IL-6 tại màng tế bào. Đã có bằng chứng ghi nhận, việc ức chế IL-6 sẽ
ngăn chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính. Khi bệnh tiến triển, sự chuyển từ
viêm cấp tính sang viêm mạn tính có ảnh hưởng do IL-6 tác động lên bạch cầu
trung tính [2].
Nồng độ IL-6 tăng cao trong màng hoạt dịch của bệnh nhân RA có liên
quan đến mức độ tăng lên của phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp.Tổn
thương khớp trong RA được đặc trưng bởi tổn thương bào mòn xương tại vị trí
bám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp. Trong nghiên cứu trên người và động
vật, tổn thương này được xác định là do hủy cốt bào gây ra. IL-6 gây tăng số
lượng hủy cốt bào bằng cách tác động vào các tế bào gốc tạo máu từ các bạch
cầu hạt, đại thực bào dòng hạt [2].
Các phản ứng ở giai đoạn cấp tính, bao gồm sự phóng thích các cytokine
tiền viêm và tăng protein pha viêm cấp tính. Protein pha viêm cấp tính được sản
xuất trong gan (ví dụ như CRP) và IL-6 là một yếu tố chính kích thích gan thực

hiện q trình này. Ở bệnh nhân RA, nồng độ IL-6 huyết thanh tương quan với
nồng độ CRP và hiện nay IL-6 dễ dàng định lượng được nhờ đánh giá nồng độ
CRP trong dịch sinh học. Nồng độ CRP được sử dụng như một dấu hiệu sinh học
của tình trạng viêm và đánh giá mức độ bệnh [2].
Từ những dẫn chứng trên, có thể thấy ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp,
các triệu chứng toàn thân hay tại chỗ trên các khớp xương có thể được giải thích
bởi tác động của IL-6. Do đó ức chế IL-6 là một mục tiêu hợp lý để điều trị RA
[2, 11].


1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6
Khi xuất hiện đột biến mất đoạn với những protein IL-6 thử nghiệm, tất cả
các protein khơng có hoạt động về mặt sinh học. Sau đó tiến hành phản ứng miễn
dịch với một bộ kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng IL-6, cho thấy chỉ có đột
biến mất đoạn ở các trình tự 177, 178 và 179 là khơng gây ra sự thay đổi đáng kể
trong cấu trúc nếp gấp. Tức là các đột biến mất đoạn này không làm mất đi cấu
trúc không gian 3 chiều của protein IL-6. Khi IL-6 có đột biến mất đoạn tại trình
tự 177, 178, 179 thì nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3
chiều của protein. Cùng với đó, quan sát thấy rằng protein IL-6 có đột biến mất
đoạn ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 khơng thể cạnh tranh với protein IL-6
(cịn đủ trình tự polypeptide) để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, điều này gợi
ý rằng có 1,2 hoặc cả 3 acid amin trên có thể tham gia vào vị trí liên kết giữa IL6 với thụ thể hòa tan SIL-6R. Bằng cách tạo ra nhiều đột biến thay thế acid amin
ở từng vị trí 177, 178 và 179 kết quả cho thấy Arg179 đóng vai trị quan trọng
đối với hoạt động ở tế bào chuột. Sự thay thế duy nhất mà giữ nguyên hoạt tính ở
vị trí 179 là từ Arg thành Lys chứng tỏ vai trò quan trọng của điện tích dương ở
vị trí 179 cho sự liên kết của IL-6 với thụ thể của nó [12]. Từ đây có thể kết luận,
Arginine ở vị trí 179 đóng vai trị quan trọng, nhắm vào vị trí đặc biệt này trong
cấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 sẽ làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6
[32].
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc.

Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công
nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:
Xác định và tối ưu hợp chất Lead
Lựa chọn chất ứng Thử
cử làm
nghiệm
thuốclâm sàng pha I,II,III
Lựa chọn mục tiêuXác định hợp chất Hit

Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc


Lựa chọn mục tiêu là chọn một mục tiêu cụ thể, được giả thuyết là có vai
trị quan trọng với mục đích điều trị bệnh đã được nhắm đến cho chương trình
phát triển thuốc. Các mục tiêu phân tử thường là một thụ thể, một enzyme hoặc
một phân tử tương tự như vậy [14].
Xác định hợp chất Hit là việc tìm ra các phân tử có tác dụng mong muốn
trong một hoặc nhiều thử nghiệm ban đầu. Những thử nghiệm này sẽ giúp dự
đoán được các tác dụng dược lý đang mong đợi. Xác định hợp chất Hit thường
được tiến hành bằng sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening HTS), với các thư viện hợp chất lớn, 105-106 phân tử, được kiểm tra bằng thực
nghiệm. Các hợp chất Hit có tác dụng ở bước này tiếp tục trở thành hợp chất
khởi đầu cho các khám phá mở rộng hơn về hóa dược ở giai đoạn xác định và tối
ưu hóa hợp chất dẫn đường (Lead). Khi q trình này diễn ra, càng có nhiều
thơng tin về tính chất dược lực học và dược động học của các hợp chất được phát
hiện. Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu, cùng với đặt ra nghi vấn trong
giai đoạn lựa chọn mục tiêu, là hai quá trình tiến hành song song. Cuối cùng, ứng
cử viên làm thuốc là hợp chất duy nhất còn lại hội đủ các yêu cầu và được đưa đi
tiến hành các thử nghiệm lâm sàng [14].
Việc sử dụng mơ hình phân tử trong xác định hợp chất Hit được gọi là
sàng lọc ảo. Điều này được sử dụng cả cho thiết kế bộ hợp chất để sàng lọc trong

HTS và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để kiểm tra với các thử nghiệm với
thông lượng thấp hơn [10].
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-Based Virtual Screening - SVBS)
là dự đoán các hợp chất liên kết với protein đích thơng qua các phương pháp tính
tốn, sử dụng các hiểu biết về cấu trúc 3D của đích phân tử.
Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng
phân tử nhỏ trong thư viện dữ liệu (docking), và từ đó dự đốn năng lượng tự do
của phân tử đó khi liên kết (scoring). Các hợp chất Hit sau đó được dự đốn
bằng cách sắp xếp tất cả các hợp chất trong thư viện bằng cách tính điểm (score),


và quyết định một điểm ngưỡng. Hợp chất có điểm tốt hơn điểm ngưỡng được
coi là hợp chất Hit, sau đó sẽ đánh giá thêm [14].
1.5 Phương pháp Docking
1.5.1 Đại cương về phương pháp Protein docking
Docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất dùng trong quá
trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đốn với độ chính xác
khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với thụ thể trong túi liên kết. Ra đời từ
những năm 1980 [22], docking phân tử đã trở thành một công cụ thiết yếu trong
nghiên cứu và phát triển thuốc. Không những chỉ ra các liên kết có ý nghĩa,
docking cịn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm tính điểm, qua đó
phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử [22].
Docking trở thành một bài tốn tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất
của một cơ chất gắn kết lên protein. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính
của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất. Để
tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình khơng gian với các trị số đánh
giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật tốn
tìm kiếm [20].
Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật tốn tìm kiếm được

ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina,
GOLD [24, 30]. GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và
chọn lọc tự nhiên. Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc
ban đầu trong “một nhiễm sắc thế” - biểu diễn bằng một véc tơ. Từ “nhiễm sắc
thể” ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng.
Quần thể này được đánh giá và từ đó các “nhiễm sắc thể” thích nghi nhất (tức là
có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp
theo. Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của tồn bộ “nhiễm sắc thể”
bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một
quần thể khác. Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được
một “nhiễm sắc thể” (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [21].


Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để
ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor. Năng lượng
này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL), đơn vị
là kCal/mol. Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá
những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh
hưởng solvat và entropy [15]. Do đó, số lượng các tham số hố lý được đánh giá
càng lớn thì độ chính xác càng cao. Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng lớn thì
thời gian tính tốn sẽ lâu. Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng
giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ
dữ liệu lớn.
1.5.2 Quy trình Docking
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử,
chuẩn bị protein, mô phỏng docking.
Chuẩn bị cấu tử: cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu
có sẵn như Pubchem, Zinc [13, 19] Trong trường hợp khơng có sẵn, chúng ta có
thể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, Chemsketch…
Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tử

cho chương trình mơ phỏng docking, các bước chuẩn bị thường được tiến hành
gồm: gắn hydro, gắn trường lực, xây dựng file pdbqt.
Chuẩn bị protein: Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng
dữ liệu protein (protein data bank). Trong trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có
thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mơ phỏng tính tương đồng
(homology modeling) [31]. Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để
chuẩn bị protein cho chương trình mơ phỏng docking. Các bước chuẩn bị thường
gồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng
file pdbqt.
Mô phỏng docking: Trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu
dạng phù hợp của cấu tử, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật tốn.
Kích thước của vùng tìm kiếm khơng nên q lớn vì như thế sẽ tốn kém thời
gian và độ lặp lại khơng cao, cũng khơng nên q nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ


tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, khơng có ý nghĩa. Vị trí của vùng tìm kiếm
thơng thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Sau khi xác định vị
trí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra
cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất. Cấu dạng này cùng với các tương
tác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như:
MOE, Pymol, Discovery studio…


CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
Cấu trúc protein: Cấu trúc tinh thể tia X của protein IL-6 được lấy từ
ngân hàng dữ liệu Protein châu Âu, có mã là 1ALU (Độ phân giải 1.9Å), lần đầu
tiên được công bố bởi Somers và cộng sự (https:/www.rcsb.org/structure/1ALU).

Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6
phản ánh qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu
( />Mật độ electron ảnh hưởng đến dạng hình học của cấu trúc tinh thể tia X
vì từ mật độ electron có thể xác định tọa độ các nguyên tử. Từ đó có thể dựng
cấu trúc của protein. Theo như hình trên thì màu sắc phản ánh mối quan hệ giữa
mật độ electron và dạng hình học. Màu sắc thể hiện chỉ số tiêu chuẩn chất lượng
hình học bao gồm tối thiểu 1 acid amin ngoại lai hay sai lệch về cấu hình: vùng
xanh (số acid amin ngoại lai = 0), Vàng (số acid amin ngoại lai = 1), Cam (số
acid amin ngoại lai = 2), Đỏ (số acid amin ngoại lai = 3). Như vậy có thể thấy,
theo trình tự chuỗi acid amin, vị trí 177-179 (vùng hoạt động) có chất lượng tốt
(màu xanh) và được chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein.


Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU

-

Cơ sở dữ liệu để sàng lọc: Cơ sở dữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt
Nam (Vietnamese natural product Database – VNPD) gồm cấu trúc topo (2
chiều) của 1602 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và các thông tin như
nguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu… Do giới hạn về tài ngun
tính tốn), trong nghiên cứu này sử dụng nguồn dữ liệu là 500 chất đầu tiên của
VNPD.
Thiết bị sử dụng: Máy tình ACER Aspire V3 – Hệ điều hành Windows 8
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng được tải hoặc mua từ các
nhà phát triển (trang web) bao gồm:
- MarvinSketch ( />- MGLtools ( />- AutodockVina ( />Discovery
Studio
( />- PyMol ( />2.2 Nội dung nghiên cứu:
Bước 1. Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có

tác dụng ức chế IL-6 bằng phương pháp docking phân tử.


Bước 2. Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu
được sau khi đã thông qua sang lọc, bằng cách phân tích các thơng số hóa lý của
cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu có chứa chất đó.

-

2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski
Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không vi
phạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:
- Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons.
Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Số lượng các nhóm –
NH và –OH), HBD ≤ 5
Khơng nhiều hơn 10 nguyên tử có độ âm điện lớn có thể tham gia liên kết hydro
(bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ), HBA ≤ 10
- Hệ số phân bố octanol/nước MlogP ≤ 4,15
Sàng lọc bằng cơng cụ tính tốn phát triển bởi Daina và cộng sự, hiện có
thể tiến hành trực tuyến bằng trang web Tập hợp 500
hợp chất tự nhiên đầu tiên trong CSDL VNPD được sàng lọc bằng cách đưa
cơng thức SMILEs vào web để có các cấu trúc và thơng số, sau đó tiến hành
phân tích theo quy tắc 5. Mục tiêu nhằm tăng tỷ lệ thành công ở các giai đoạn
phát triển tiếp theo cho các hợp chất vượt qua yêu cầu ở quy trình này.
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking
Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ
ngân hàng dữ liệu protein ( sau đó tiến
hành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid). Thêm Hydro, gắn
trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt. Tất cả các bước này được tiến hành

trên phần mềm MGLtools.
Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để
vẽ cơng thức 2D sau đó xây dựng cơng thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch.
Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực
Gasteiger và xây dựng file pdbqt.


Dữ liệu là protein cũng như các cấu tử ở dạng file pdbqt. Dock bằng phần
mềm Autodock với Grid box đặt tâm ở Arg179, kích thước Grid box 15×15×15
Ǻ, vịng lặp là 8, mỗi chất được tiến hành dock 3 lần (n = 3).
Docking phân tử: Phần mềm Autodock được sử dụng để tìm ra cấu hình
liên kết tốt nhất bằng cách sử dụng các đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và
số lượng tương tác vật lý. Autodock tính tốn các giá trị năng lượng bằng đặc
tính năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và năng lượng giữa
các phân tử gồm năng lượng liên kết Van der Walls, năng lượng liên kết hydro,
năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện.
Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các
hợp chất với cấu trúc tinh thể của IL-6.


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

CSDL VNPD 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên
~ 18% hợp chất
tự nhiên

Quy tắc 5 Lipinski
412 hợp chất tự nhiên

~37% hợp chất tự

nhiên

Sàng lọc Docking
258 hợp chất tự nhiên

~96% hợp chất tự
nhiên

Lựa chọn hoạt chất
10 hợp chất tự nhiên

~96% hợp chất tự
nhiên
Hình 3.1: Minh họa kết quả sàng lọc
3.1 Kết quả sàng lọc bằng quy tắc số 5 của Lipinski
Sử dụng web sàng lọc và loại bỏ các chất vi
phạm quá một tiêu chuẩn của quy tắc số 5, từ 500 hợp chất ban đầu còn lại 412
chất để tiến hành phân tích sâu hơn (Loại được gần 20%).
3.2 Sàng lọc docking
Madindoline A được chứng minh có tác dụng ức chế chọn lọc cao IL-6 do
vậy chúng tôi sử dụng Mandindoline A làm chất đối chiếu tác dụng.
Mandindoline A lấy công thức 3D từ cơ sở dữ liệu Pubchem
( Tiến hành dock madindoline A có định


dạng file .pdbqt với file protein 1ALU định dạng .pdbqt bằng Autodock Vina
cho ra năng lượng liên kết ΔG = -7,0kCal/mol. Mandindoline A liên kết hydro
với Arg179 (2.01 Å), ngoài ra liên kết hydro với Gln175 (2.19 Å) và các tương
tác kỵ nước khác. Do vậy, chúng tôi sử dụng tiêu chí ΔG≤-7,0 kCal/mol và liên
kết hydro với Arg179 cho bước tiếp theo.

Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong
trung tâm hoạt động của IL-6
Bước tiến hành thu hẹp lại bộ dữ liệu cấu tử từ 412 hợp chất cịn 258 hợp
chất đạt tiêu chuẩn có tương tác với ARG179 đồng thời có năng lượng liên kết
ΔG = -5,0 kCal/mol (Loại bỏ được gần 40%).Tiếp tục dock 258 chất thu được ở
trên, sử dụng phần mềm Autodock với Grid box 30×30×30 Ǻ, tọa độ tại vị trí
Arg179. Phân tích kết quả docking bằng Discovery Studio thu được 10 hợp chất
có ΔG ≤ -7,0 kCal/mol, tạo liên kết hydro với Arg179 và có tương tác với các
acid amin khác.