LUẬN văn THẠC sĩ CÔNG NGHỆ SINH học (FULL) nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi streptomyces phân lập tại thái nguyên và định hướng ứng dụng

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan..............................................................................................................i
Lời cảm ơn................................................................................................................ii
Mục lục.................................................................................................................... iii
Danh mục các kí hiệu, viết tắt...................................................................................vi
Danh mục các bảng.................................................................................................vii
Danh mục các hình vẽ............................................................................................viii
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN..................................................................................3
1.1.1. rí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên..............................................3
1.1.2. ặc điểm sinh học của xạ khuẩn....................................................................................4
1.1.3. ặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces.................................................................................6
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN....................................................7
1.2.1. Phương pháp phân loại truyền thống...............................................................7
1.2.2. Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA....................9
1.3. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN...................................12
1.3.1. Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh.....................................................12
1.3.2. yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh.....................................13
1.3.3. chiết chất kháng sinh......................................................................................15
1.4. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT....................................16
1.4.1. ấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng.............................16
1.4.2. khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật..............................................................17
1.5. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG.......................19
iii


1.5.1. ển chọn xạ khuẩn sinh enzyme......................................................................19

1.5.2. số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường..................................20
Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU........................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................23
2.1.2. sinh vật kiểm định..........................................................................................23
2.2. HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MƠI TRƯỜNG................................................ 23
2.2.1. Hóa chất......................................................................................................... 23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị.........................................................................................24
2.2.3. trường nghiên cứu..........................................................................................24
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................. 26
2.3.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................26
2.3.2. Phương pháp đếm số lượng tế bào.................................................................26
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh...................................................27
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme.......................................................28
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme................................28
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn......................28
2.3.7. Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA....................................30
2.3.8. Nghiên cứu bước đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh................33
2.3.9. Phương pháp tách chiết chất kháng sinh........................................................33
2.3.10. Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt.......34
2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................34
Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................35
3.1. SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN.........35
3.1.1. phân bố của xạ khuẩn trong đất.....................................................................35
2


3.1.2. đa dạng sinh học của xạ khuẩn.......................................................................36
3. 2. Hoạt tính kháng sinh và chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao.....................37
3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập................................. 37

3.2.2. ển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao..............................41
3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 2 CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 ...44
3.3.1. Đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn HT 17.8 và HT19.1............................44
3.3.2. ểm ni cấy.................................................................................................... 45
3.3.3. ểm sinh lý, sinh hóa....................................................................................... 46
3.3.4. Phân loại 2 chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT19.1............................................ 51
3.4. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT
KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1......................................................... 59
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh.................................................... 59
3.4.2. chiết và xác định một số tính chất của chất kháng sinh chủng HT17.8.62
3.5. TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ENZYME.........................64
3.5.1. Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn..................................................................... 64
3.5.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme...................................................................66
3.6. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI
CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT.....68
KẾT LUẬN............................................................................................................. 71
KIẾN NGHỊ............................................................................................................ 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 73

3


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề
tài

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh
thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc
sương… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng,
chúng chiếm tới 83% trong số các bệnh ở cây

trồng [15]. Theo thống kê của Tổ chức Nông
Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong
nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6%
tổng sản lượng nơng nghiệp thế giới [46].Trong
khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ
thực vật từ lâu đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới
sức khỏe con người, làm mất cân bằng sinh thái
và gây ô nhiễm môi trường. Chính vì vậy, việc sử
dụng các loại VSV đối kháng, các chất sinh học
diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của
cây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa học
hướng đến, và xạ khuẩn sinh kháng sinh là đối
tượng trung tâm trong cuộc tìm kiếm này [22].
Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ
(Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở
nhiều vùng sinh thái khác nhau. Chúng ngày càng
được biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực
tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi
thứ cấp có giá trị sử dụng cao như CKS, chất
chống ung thư, chất kích thích sinh trưởng và
nhiều hợp chất y dược khác. Thêm vào đó, XK
còn khả năng sinh các enzyme ngoại bào nên
được sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học
4


có ý nghĩa đặc biệt quan

khai khống tới sự phát triển và đa dạng của các

trọng trong công nghệ xử

hệ động, thực vật nhưng lại chưa có

lý rác thải [9], [18].
Thái Nguyên là một
tỉnh rất giàu tiềm năng về
nông, lâm nghiệp nên có
khu hệ VSV khá phong
phú, trong số đó có khơng
ít lồi XK sinh CKS. Mặt
khác, Thái

Ngun lại

nằm

vùng

trong

sinh

khống, có nhiều loại hình
khống sản phân bố tập
trung. Điển hình là khu
vực núi Pháo thuộc xã Hà
Thượng, huyện Đại Từ và
khu vực thị trấn Trại Cau
thuộc huyện Đồng Hỷ, là

nơi đang diễn ra các hoạt
động khai thác khoáng
sản mạnh mẽ. Các hoạt
động khai thác khống
sản đã có những tác động
đáng kể đến mơi trường
đất, nước và qua đó, rất có
thể sẽ ảnh hưởng đến hệ
VSV. Trên thực tế đã có
những nghiên cứu về ảnh
hưởng

của

hoạt

động
5


nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt tính sinh
học đến hệ VSV đất tại những khu vực này.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt ra như trên, cũng như để góp phần khai thác
nguồn VSV vơ cùng phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của XK trong các mẫu đất thu tại các địa
điểm nghiên cứu.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng XK phân lập được để từ đó có thể

tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt là
trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường.
3. Nội dung nghiên cứu
- Lấy mẫu, phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất.
- Kiểm tra HTKS của các chủng đã phân lập được với các VSV kiểm định để
tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, ni cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loại một
số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đã được tuyển chọn.
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng XK lựa chọn.
- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào và nghiên cứu tuyển chọn ra một số
chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi
khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ
(Prokaryota).
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng hơn 1.000 lồi.
Trong đó có 478 lồi thuộc chi Streptomyces và hơn 500 lồi thuộc các chi cịn lại
được xếp vào nhóm XK hiếm [58], [5].
Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và
“mykes” (nấm) và ban đầu XK được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với
nấm. Tuy nhiên, đến nay, XK đã được chứng minh là thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có
tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA [60].
Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí,
hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước, khơng khí, xác thực vật... Nhưng chủ

yếu XK phân bố nhiều ở trong đất. Số lượng XK trong đất khơng chỉ phụ thuộc
vào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác
và khả năng che phủ của thảm thực vật. Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớp
đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khống. Số lượng
XK có thể đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU trong 1 gam đất [33].
Sự phân bố của XK trong đất còn phụ thuộc nhiều vào pH của đất. Xạ
khuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có
pH khoảng 6,8 – 7,5. Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp XK và càng hiếm gặp
hơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh. Nhìn chung, nhiệt độ ơn hịa 25 - 30ºC và
pH trung tính là điều kiện tối ưu cho XK phát triển. Mặc dù vậy, nhiều loài XK đã
được phân lập ở các mơi trường khắc nghiệt ví dụ như lồi Arthrobacter ardleyensis
ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [27] và


loài Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH
9,5 - 10 [32].
Xạ khuẩn là nhóm VSV đóng vai trị quan trọng trong tự nhiên. Chúng
tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp
trong đất mà nhiều VSV khác không hấp thu được. Các XK chi Streptomyces đặc
biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ
bằng các enzyme ngoại bào. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân
hủy như axit humic trong đất [5]. Nhiều chủng XK có khả năng hịa tan lignin bằng
cách sinh các enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan
trọng đối với cơng nghiệp và bảo vệ môi trường. Thực tế, mùi mốc đặc trưng của
nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có tên là
geosmin [57], [25], [44].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm nổi bật của XK là có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh
và khơng có vách ngăn. Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 µm

– 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm. Kích thước và khối lượng khuẩn ty
thường không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy.
Theo ISP, màu sắc KTKS của các chủng XK được chia thành 8 nhóm màu:
White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm
vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và
nhóm màu khơng xác định (X) [5], [40].
Khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể, XK tạo thành dạng bông, khi già tạo
thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt liti, đó là sản phẩm
phân hủy của màng nguyên sinh chất và vách tế bào [19].
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại.
Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề


mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng
chủ yếu là


sinh sản [41]. Nhiều loại XK, các KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành
nhiều vịng trịn đồng tâm. Bản chất của hiện tượng này vẫn chưa được giải thích
một cách thỏa đáng [19].
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của KTKS sẽ xuất hiện các cuống sinh
bào tử – là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK. Trên mỗi CSBT mang từ 30 ÷ 100
bào tử, đơi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử
hoặc hai bào tử. CSBT là một trong những đặc điểm rất quan trọng để phân loại
XK. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, đặc điểm này khơng được ổn định mà vẫn
có thể thay đổi theo mơi trường ni cấy.
Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, hình ovan, hình
cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ữ 0,9 ì 0,7 ữ 1,9 àm. B mt
bo tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty),
nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like. Nhìn chung, trong cùng một

lồi, hình dạng bào tử XK tương đối ổn định, vì vậy có thể xem đây là một trong
những đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47].
Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng
có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi. Khuẩn lạc thường có
đường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc
lớn hơn nữa. Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt hay trong suốt như của
vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thơ ráp, xù xì, có dạng vơi với nhiều
màu sắc khác nhau và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ.
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối
nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên khả năng hấp thụ các
chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ấm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích
0

hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 30 C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp


0

CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28 C. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao
động trong khoảng 40 - 50%, pH thích hợp trong khoảng 6,8 - 7,5 [9], [3], [10].
Xạ khuẩn có hệ enzyme vơ cùng phong phú. Chúng có khả năng phân hủy và
sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axit humic trong đất đến các hợp chất
hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin, cellulose… chứng tỏ rằng XK
phải có khả năng sinh những hệ enzyme tương ứng. Điều đó cho phép mở ra khả
năng tìm kiếm và chọn lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu
cầu công nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme khơng thể khai thác được từ
nguồn động vật và thực vật.

Ngoài ra, XK được đặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ
sinh có giá trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên do VSV sinh ra đã được
công bố sử dụng trên tồn thế giới thì 45% được sinh ra từ XK, 38% từ nấm và 17%
từ vi khuẩn đơn bào [48].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có khoảng 60 – 70% XK phân lập từ đất có
khả năng sinh CKS. Trong số 8.000 CKS đã được biết thì có tới hơn 80% là có
nguồn gốc từ XK mà phần lớn là XK thuộc chi Streptomyces [39]. Một số hợp
chất của XK đã được công bố như: aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, βlactam, macrolides, nucleoside, polyene, polyeste, actinomycin, tetracycline. Các
hợp chất này đã được sử dụng thành công làm thuốc diệt cỏ, thuốc chống ung thư,
các chất điều hòa miễn dịch, các chất chống ký sinh trùng [18], [42].
Ngoài ra, trong quá trình sống, XK cịn sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất
quan trọng như một số vitamin nhóm B, một số axit hữu cơ như các axit lactic,
axit axetic, axit sucxinic… các axit amin như axit glutamic, metionin, alanin,
valin... chất kích thích sinh trưởng và sắc tố melanin [52].
Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzyme… có thể
được tích lũy trong sinh khối tế bào hay được tiết ra môi trường nuôi cấy. KTCC có
thể tiết vào mơi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen…
có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [5], [53].
1.1.3. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces


Trong số hơn 1.000 lồi XK đã được mơ tả thì có tới 478 lồi thuộc chi
Streptomyces và hơn 500 lồi thuộc các chi cịn lại được xếp vào nhóm XK hiếm.
XK hiếm chia thành hơn 50 chi khác nhau và gồm nhiều lồi chưa cơng bố. Chúng
thường sinh trưởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khó bảo quản và ni
cấy trong mơi trường nhân tạo. Thêm vào đó, mật độ XK hiếm trong tự nhiên ít
hơn nhiều so với chi Streptomyces và phải sử dụng các phương pháp phân lập đặc
hiệu nên thường ít được quan tâm nghiên cứu hơn [47]. Trong khi đó, XK thuộc chi
Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tìm kiếm và sàng lọc CKS. Chúng đặc biệt
nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng

các enzyme ngoại bào.
Streptomyces là chi XK bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm
1943, có số lượng lồi được mô tả nhiều nhất. Các đại diện của chi này có hệ KTKS
và hệ KTCC rất phát triển và phân nhánh. Để phân loại chi Streptomyces đến loài,
các nhà phân loại đã phải sử dụng nhiều khoá phân loại khác nhau như:
Craxilnhicôp (1970), Gause và cộng sự (1983), Bergey (1989) ...
Các XK chi Streptomyces (lồi chuẩn Streptomyces albus) có cấu tạo giống
vi khuẩn G (+), tỷ lệ G + C trong DNA là 69 – 78%. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là
o

25 - 35 C, pH tối ưu là 6,5 - 8,0. Chúng có KTCC phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt
đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm. KTKS ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến
nhiều bào tử. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó KTKS sẽ phát
triển rất mạnh mẽ tạo khuẩn lạc gồ ghề, thô ráp. Chúng sinh nhiều loại sắc tố khác
nhau và có khả năng khuếch tán ra mơi trường [56], [60].
Chi Streptomyces được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh kháng sinh của
chúng và thường được gọi là “các nhà máy sản xuất kháng sinh”. Rất nhiều chủng
sản sinh ra một hoặc nhiều loại CKS. CKS do XK nói chung và từ Streptomyces nói
riêng thường có hoạt phổ rộng, có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệt
một số loại kháng sinh được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư [3].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN
1.2.1. Phương pháp phân loại truyền thống
1
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau được đưa ra nhằm mục đích
phân loại XK tới chi và lồi, như các khóa phân loại của Waksman (1916, 1919,
1961), của Craxilnhicop (1949, 1970), của Flaig - Kutzner (1954, 1960), của Gause
(1957), Pridham (1972), Bergey (1989), Goodfellow (2000)… [53]. Đồng thời để
thống nhất trong cách mơ tả XK, chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) đã đưa ra các
phương pháp chung và mơi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV này. Đánh giá
của ISP dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm ni cấy, các đặc điểm sinh lý,
sinh hóa của XK trên các mơi trường từ ISP1 đến ISP9 [47].
Ngày nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của một số ngành như: sinh học phân
tử, hóa sinh học, lý sinh học… những kiến thức về phân loại học XK đã có nhiều
thay đổi. Do số lượng các lồi XK mới được mơ tả ngày càng nhiều nên để cho việc
phân loại được nhanh và chính xác tới mức độ phân tử, ngoài các phương pháp
phân loại truyền thống, người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp phân
loại bằng sinh học phân tử.
 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất ni cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất ni cấy là những chỉ tiêu quan trọng được sử
dụng trong phân loại XK. Hầu hết các chi XK được mô tả hiện nay được phân loại
theo các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: màu sắc của hệ KTKS,
KTCC, màu sắc của sắc tố hịa tan, hình dạng và kết cấu bề mặt của bào tử, hình
dạng của CSBT, sự phân đốt của khuẩn ty.
Tuy nhiên, cũng như các VSV khác, XK rất không bền vững về mặt di truyền,
thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một lồi có thể
biểu hiện khác nhau về hình thái hay những lồi khác nhau có thể giống nhau về
hình thái. Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm
các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinh
học phân tử.
 Phân loại theo đặc điểm hóa phân loại
Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thơng qua việc định tính và định
lượng thành phần hóa học của tế bào VSV. Trong đó việc phân tích cấu trúc mạch
1

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




tetrapeptide của peptydoglycan được xem là tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu nhất
cho nhóm vi khuẩn G (+), trong đó có XK. Các đồng phân của diaminopimelic
(DAP) trong thành phần peptydoglycan là một trong những axit amin có ý nghĩa
quan trọng trong phương pháp phân loại này.

 Phân loại theo đặc điểm sinh lý – sinh hóa:
Người ta có thể nuôi cấy các chủng XK cần định loại trên các môi trường
dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định để nghiên cứu
các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường
được sử dụng như: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, khả năng phân
hủy các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme, nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt
độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của mơi trường, tính chất đối
kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi
chất đặc trưng khác của XK… [19].
Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm ni cấy
dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Do vậy, ngày nay những nguyên
tắc trong việc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại XK cũng có sự
thay đổi [17].
Tóm lại, có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau được sử dụng trong
nghiên cứu phân loại VSV nói chung và XK nói riêng nhưng khơng có phương
pháp nào tỏ ra vạn năng, thích hợp cho mọi đối tượng VSV. Vì vậy, để đảm bảo
tính chính xác cần phải kết hợp đồng thời nhiều phương pháp khác nhau, trong đó
đặc biệt quan tâm tới các phương pháp phân loại hiện đại khi phân loại VSV.

1.2.2. Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA
Trong một số trường hợp, phương pháp phân loại truyền thống gặp trở ngại
do một số các đặc tính dùng cho nhóm VSV này nhưng lại khơng có ý nghĩa với
nhóm VSV khác. Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại
của một số VSV. Mặt khác, đối với những lồi có độ tương đồng cao về mặt hình
thái thì phương pháp phân loại truyền thống sẽ khó có thể đạt được hiệu quả. Nhược
1
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




điểm này của phân loại truyền thống hồn tồn có thể bổ sung nhờ phân loại học
phân tử. Ngày nay, phần lớn các nhà khoa học đều thống nhất rằng, phân loại học
phải dựa vào rất nhiều tiêu chí phân loại kết hợp cả phương pháp phân loại truyền
thống và phương pháp phân loại hiện đại, trong đó nhấn mạnh vai trò của phương
pháp phân loại bằng sinh học phân tử [25]. Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học
đồng ý với quan niệm 2 chủng được coi là 2 loài riêng biệt nếu chúng giống nhau
dưới 70% khi tiến hành lai DNA. Keswani và cộng sự (2001) đã chứng minh rằng
nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rRNA 16S thấp hơn 98.6% thì xác suất để mức
độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tương
đồng 98.6% của trình tự rRNA 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai lồi khác
nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [36].
Trong những năm gần đây, với sự ra đời của nhiều kỹ thuật sinh học phân tử,
đã giúp việc phân loại các VSV trở nên dễ dàng và có tính chính xác cao hơn. Ngày
nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác
định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các VSV. Phân tử rRNA là thành phần cấu
tạo nên các tiểu phần ribosome có mặt ở tất cả các loại VSV, có chức năng xác định

và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm VSV.
Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh
chủng loại và phân loại các chủng VSV.
Khác với các VSV nhân chuẩn (eukaryotes), ribosome chứa 4 loại phân tử
rRNA là: 5S, 5,8S, 28S và 18S. Đối với các VSV nhân sơ (prokaryotes), ribosome
chỉ chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S, 16S, 23S. Trong đó, gene 16S rRNA mã hóa
cho phân tử rRNA loại 16S được xem là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân
loại các VSV nhân sơ, bao gồm cả XK. Gene mã hóa cho 5S rRNA có kích thước
khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt
một cách chi tiết giữa các chủng. Ngược lại, gene mã hóa cho 23S rRNA lại có kích
thước lớn, khoảng 3.000 nucleotide, do đó gây khó khăn cho việc tách dịng, đọc và
so sánh trình tự. Chỉ có gene 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa
đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng và cũng khơng gây khó khăn trong nghiên
cứu nên được ưu tiên lựa chọn trong phân loại prokaryotes. Thêm vào đó, trên gene
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semi conserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, lồi [27]. Do vậy,
gene 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và đã thiết lập được
rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gene này bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi
lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên các gene mã hóa 16S rRNA. Ngồi ra,
người ta còn sử dụng vùng đệm giữa gene 16S rRNA và 23S rRNA để nghiên cứu
đa dạng của prokaryotes [34], [37].
Theo Ludwing và Schleifer (2000) đã có tới 16.000 gene 16S rRNA từ các
chủng VSV được giải trình tự nucleotide. Vì vậy, khi phân lập được chủng mới,
bằng việc so sánh trình tự gene 16S rRNA của có thể cho chúng ta biết nó thuộc
lồi nào, có họ hàng như thế nào và vị trí phân loại của nó [44].

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu áp dụng cách phân loại này để định
tên các chủng VSV như: Kataoka và cộng sự (1997) đã ứng dụng vùng bất biến của
gene 16S rRNA tạo ra một chỉ thị so sánh để định loại các loài trong chi
Streptomyces [35]. Takeuchi và cộng sự (1996) đã phân tích sự phát sinh loài của 12
chủng XK thuộc chi Streptomyces gây bệnh nấm vẩy ở khoai tây dựa trên 16 trình
tự 16S rRNA [48].
Ở Việt Nam cũng có rất nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng trình tự gene 16S
rRNA để định tên VSV, nhất là các lồi có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính
sinh học như XK. Dựa vào trình tự gene 16S rRNA, Đỗ Thu Hà và cộng sự (2001) đã
định loại chủng XK Streptomyces ĐN – 05 sinh CKS có hoạt phổ rộng phân lập từ
đất Quảng Nam – Đà Nẵng [9]. Bùi Thị Việt Hà và cộng sự (2006) đã tiến hành xác
định các đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa kết hợp với việc phân tích trình tự
gene 16S rRNA định tên được 3 chủng XK: Streptomyces antimycoticus T-41,
Streptomyces diastatochromogenes D-42 và Streptomyces hygroscopicus TC-54 đều
có phổ kháng sinh rộng, có khả năng sinh CKS chống vi khuẩn G(+), vi khuẩn G(-)
và nấm gây bệnh thực vật [10]. Nghiên cứu về một số hoạt chất có khả năng kháng
VSV và kháng dòng tế bào ung thư từ XK, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




(2011) đã phân loại được 5 chủng XK hiếm đều thuộc chi Nonomuraea [18]. Trên cơ
sở kết hợp phương pháp phân loại truyền thống và phương pháp phân loại dựa vào
trình tự gene 16S rRNA, Vi Thị Đoan Chính và cộng sự (2011) đã định tên được
chủng XK Streptomyces kurssanovii K4 phân lập ở Thái Nguyên có khả năng đối
kháng với các chủng vi khuẩn Staphylococcucs aureus và Pseudomonas aeruginosa
gây nhiễm trùng bệnh viện [3].

1.3. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN
1.3.1. Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh
1.3.1.1. Con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh
Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp của VSV. Chúng khơng có
chức năng rõ ràng trong sự trao đổi chất của tế bào, nghĩa là tế bào vẫn có thể tồn
tại và phát triển bình thường khi khơng có hợp chất này. Mặc dù các CKS có cấu
trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng rất đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng
hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định. Các con đường này cũng chỉ là sự
cải biến các con đường sinh tổng hợp của tế bào dưới sự tham gia của các enzyme
hoặc hệ thống enzyme đặc biệt. Vì vậy, chỉ cần tác động làm thay đổi đường hướng
trao đổi chất là có thể cho hàng loạt các sản phẩm khác nhau. Các vật liệu ban đầu
của q trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp cũng chính là những sản phẩm trao
đổi sơ cấp. Demain đã mô tả con đường sinh tổng hợp CKS từ VSV có thể thực
hiện theo 3 con đường [28]:
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như: chloramphenicol,
các CKS nhóm nucleoside.
- CKS được tổng hợp từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau như:
lincomixin, novobioxin.
- CKS được tổng hợp bằng cách polime hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó có
thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Thuộc con đường này có
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nhiều loại kháng sinh đã được tổng hợp.
1.3.1.2. .2. Di truyền học của sự hình thành chất kháng sinh
Các gene mã hóa cho các enzyme đặc biệt trong sinh tổng hợp CKS thường
nằm trên nhiễm sắc thể, hoặc một số trường hợp trên plasmid như: gene mã hóa cho

sinh tổng hợp chloramphenicol ở Streptomyces venezuelae nằm trên plasmid, trong
khi đó gene mã hóa cho sinh tổng hợp tetracycline lại nằm trên nhiễm sắc thể.
Sinh tổng hợp CKS còn phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene. Không chỉ
gồm những gene chịu trách nhiệm trực tiếp tổng hợp CKS từ những đơn vị cơ bản,
mà cả những gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, coenzyme, cofactor
cũng như các gene phụ trách sản sinh năng lượng cho quá trình tổng hợp. Ước tính
số lượng gene có liên quan đế sinh tổng hợp chlotetracyclin lên tới hàng trăm gene.
Điều đó cũng giải thích vì sao so với các chất trao đổi bậc một, tổng hợp CKS phụ
thuộc nhiều hơn vào các điều kiện sinh lý như: thành phần môi trường, pH, nhiệt
độ, nồng độ ion, nồng độ phosphate vô cơ, độ thơng khí, thế oxy hóa khử [51].
Trong nghiên cứu sản xuất CKS, ngồi việc tìm kiếm ra các CKS mới phải
đồng thời với việc nghiên cứu nâng cao HTKS của các chủng. Các chủng hoang
dại thường có hoạt tính thấp, để đưa vào sản xuất cần phải tiến hành chọn lọc
chủng, sử dụng các biện pháp gây đột biến, các kỹ thuật di truyền hiện đại để chủ
động tạo ra được các chủng giống tốt. Điều quan trọng là các chủng mới được
tuyển chọn phải đảm bảo cho hiệu suất kháng sinh cao, an tồn và có hiệu quả về
mặt kinh tế.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
1.3.2.1. Thành phần môi trường lên men
Thực tế cho thấy, thành phần môi trường lên men có vai trị rất quan trọng,
khơng chỉ ảnh hưởng đến số lượng mà còn ảnh hưởng đến cả chất lượng của CKS tạo
thành. Vì vậy thành phần mơi trường lên men thích hợp cho việc sinh tổng hợp các
CKS khác nhau cũng sẽ khác nhau.
* Nguồn cacbon: Các chủng XK có khả năng đồng hóa được nhiều nguồn
cacbon khác nhau. Nhìn chung, nguồn thức ăn cacbon thường được sử
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

dụng làm môi trường lên men rất đa dạng bao gồm: các loại bột và hạt ngũ cốc,
cám mỳ, cám gạo, các loại đường đơn, đường đôi, dịch thủy phân gỗ… Thông
thường glucose là nguồn thức ăn cacbon tốt cho sự sinh trưởng của nhiều chủng
XK nhưng các oligosaccharide và polysaccharide lại thích hợp hơn cho sinh
tổng hợp CKS. Trong lên men CKS, nhiều trường hợp dư thừa glucose trong
môi trường sẽ ức chế quá trình này.
Một số nghiên cứu đã chứng minh chủng Streptomyces parvulus ATCC
12434 có khả năng sinh enzyme kynureninase (l-kynurenine hydrolase, EC 3.7.1.3)
khi có sự cảm ứng của tryptophan trong mơi trường. Đây là enzyme đóng vai trò
quan trọng trong hệ thống sinh tổng hợp CKS actinomycin. Tuy nhiên, khi môi
trường dư thừa lượng glucose cần thiết sẽ dẫn tới ức chế tổng hợp enzyme này [50].
* Nguồn nitơ: Nitơ là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trong quá trình
sinh trưởng và tổng hợp CKS của XK. Nguồn thức ăn nitơ thường được sử dụng
làm mơi trường lên men kháng sinh có thể là bột đậu tương, nước chiết ngô, cao
nấm men, pepton, các muối nitrat, muối amơn… Trong một số trường hợp, q
trình tổng hợp CKS lại đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi
trường.
* Nguồn photpho vô cơ: Photpho là yếu tố tham gia điều chỉnh sinh tổng hợp
CKS. Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rút
ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha dinh dưỡng hoặc ức chế tổng hợp enzyme.
* Các nguyên tố vi lượng: Là một trong các thành phần không thể thiếu được
trong môi trường lên men, góp phần thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS
của nhiều chủng XK [13].
1.3.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Cùng với thành phần môi trường lên men, điều kiện nuôi cấy cũng có ảnh
hưởng rất lớn đến q trình tổng hợp CKS của XK. Vì vậy, trong lên men CKS,
người ta thường tập trung khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố trong môi
trường như: nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, thế oxy hóa khử, cường độ sục khí… để
nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp CKS [17].

19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.3.3. Tách chiết chất kháng sinh
Phần lớn các chủng XK sinh kháng sinh và tiết ra môi trường xung quanh,
nhưng có một số chủng chỉ tiết một phần vào mơi trường còn chủ yếu là vẫn nằm
trong sinh khối. Để lựa chọn được phương pháp tách chiết CKS phù hợp phải dựa
vào bản chất hoá học của các CKS.
Khi tiến hành tách chiết CKS từ dịch lọc, cần lưu ý là pH của dịch ni cấy
có ảnh hưởng lớn đến việc CKS đi ra mơi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối
nhiều. Ví dụ, nếu pH của dịch ni cấy chủng Streptomyces rimosus thấp, kháng
sinh oxytetracyclin đi ra môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm thì kháng sinh lại
tích tụ trong sinh khối nhiều hơn [14]. Đối với các dịch lên men có độ nhớt cao
thường gây khó khăn cho quá trình lọc, vì vậy để khắc phục, người ta thường bổ
sung một số chất trợ lọc giúp cho q trình lọc diễn ra tốt hơn.
• Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối
Trước khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nước để loại bỏ các thành
phần của mơi trường. Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách chiết CKS ra
khỏi sinh khối tế bào. Hiệu quả tách chiết phụ thuộc vào khả năng hồ tan của CKS
trong dung mơi chiết. Các dung mơi hữu cơ dùng để tách chiết CKS có thể là:
butanol, metanol, etyl axetat, axeton… [3], [10].
• Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc
Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trường nuôi cấy, cần phải
loại sinh khối tế bào ra khỏi dịch nuôi bằng phương pháp lọc hay ly tâm. Phương
pháp ly tâm không những loại được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất khơng
có lợi ra khỏi dịch ni cấy. Tốc độ ly tâm được sử dụng với mục đích này thường
là 15.000 vịng/phút [10].

Các CKS có trọng lượng phân tử thấp thường hồ tan trong nước và trong
dung mơi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn các loại dung mơi có
khả năng hồ tan CKS [1].
Chất kháng sinh thô nhận được từ dịch lọc hay sinh khối được làm sạch bằng
cách cô đặc và loại bỏ tạp chất. Điểm đáng chú ý là các CKS thường bị mất hoạt tính
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và kiềm cao. Do vậy, khi tách chiết và tinh sạch,
phải nghiên cứu các điều kiện thích hợp sao cho CKS vẫn giữ được hoạt tính [2].
1.4. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT
1.4.1. nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng
Vi nấm là VSV có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do q trình phát
tán bào tử nhờ gió hoặc nước, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc hạt
giống và lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Ngồi ra
vi nấm cịn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông qua bộ rễ. Cây
có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm, có thể bao gồm cả những loại nấm ký
sinh không gây hại đến cây, nhưng phần lớn là các loại nấm gây hại cây trồng. Theo
số liệu của Tổ chức Nông – Lương của Liên Hợp Quốc (FAO), tổn thất hàng năm
về các sản phẩm nông nghiệp do các tác nhân gây hại khác nhau gây ra là 20% tổng
sản lượng tồn cầu, trong đó riêng tổn thất do nấm chiếm khoảng một nửa [29].
Việt Nam là nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm, vì vậy việc nhiễm nấm là
không thể tránh khỏi. Một lượng lớn cây lương thực, cây công nghiệp ngắn ngày bị
nhiễm các loại vi nấm gây bệnh tạo ra hàng loạt các dịch bệnh khác nhau ảnh hưởng
lớn đến năng suất cây trồng, đặc biệt những cây có giá trị như: lúa, ngơ, đậu, chè…
Tính từ năm 1957 đến nay, nước ta đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại cây trồng
như đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ… mà tác nhân gây bệnh chủ yếu nghiêm

trọng nhất là vi nấm, phổ biến là Fusarium oxysporum, Fusarium solani,
Rhizoctonia sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.… Hầu hết chúng là những loài bán
ký sinh và hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng, gây nhiều tổn thất lớn về
sản lượng thu hoạch và làm mất tính ổn định về năng suất của nhiều giống cây trồng
[24], [12].
Tình hình dịch hại do nấm qua các năm khơng hề giảm mà cịn có chiều
hướng tăng với các bệnh ngày càng phức tạp cùng với sự phịng vệ ngày càng cao
của chính các lồi nấm đó. Vì vậy việc nghiên cứu những chế phẩm nhằm hạn chế
những thiệt hại do nấm đang là mối quan tâm hàng đầu được các nhà khoa học đặt
ra hết sức cấp bách.
21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.4.2. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật
Trong thiên nhiên, các loại VSV đối kháng ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt
VSV gây bệnh chủ yếu bằng các CKS là các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Đây
chính là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của XK đối
kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Khi điều tra XK đối kháng
trong đất ở Nhật Bản cho thấy ở nơi có nhiều XK trong đất thì ở đó các dịng
Fusarium bị biến mất nhanh [53]. Thơng thường, một loại XK đối kháng có thể ức
chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những lồi hoạt phổ rộng có thể ức chế
nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất. Tuy nhiên, khi sử dụng các chủng có hoạt phổ
rộng phải chú ý để tránh XK ức chế ln cả khu hệ VSV có lợi cho vùng rễ.
Xạ khuẩn ngồi việc tiết ra các CKS, cịn tác động lên khu hệ VSV thông
qua các enzyme phân giải. Ngồi ra, nhiều XK cịn tiết ra các chất kích thích sinh
trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ. Nhiều
nghiên cứu cho thấy CKS do XK sinh ra không những không ảnh hưởng đến thực

vật mà ở nồng độ thấp cịn có khả năng kích thích sự sinh trưởng của thực vật [10].
Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được chủng Streptomyces. sp 5406 có khả
năng sinh ra CKS phịng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng bông
thu được những kết quả khả quan. Mới đây, Bryden và cộng sự (2005) cũng đã tách
chiết thành công CKS jingangmyxin được tách chiết từ một loài Streptomyces
hygromyxin, ứng dụng rất rộng rãi trong phòng chống bệnh thối rễ [26].
Cùng với sự phát triển của khoa học, ngày càng có nhiều CKS có nguồn gốc
XK được tinh chế và đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp được sử dụng trong
phòng trừ nấm gây bệnh thực vật.
Chất kháng sinh Blasticidin S được Takeuchi tinh chế từ dịch nuôi chủng
Streptomyces griseochromogenes, dùng để phịng chống bệnh đạo ơn do Pyricularia
oryzae gây ra. Blasticidin S có phổ tác dụng rộng, ngoài khả năng ức chế sự sinh
trưởng của P.oryzae chúng cịn có khả năng ức chế vi khuẩn, nấm và cịn có thể
chống khối u [43].


Polyoxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotide peptidylpyrimidin, được
tổng hợp bởi chủng XK Streptomyces cacaoi var.asoensis. Chất kháng sinh này
được coi là rất an toàn khi sử dụng trong phịng chống nấm bệnh, khơng độc cho vật
ni và cây trồng [43].
Validamycin A được tách chiết từ môi trường nuôi cấy của chủng
Streptomyces hygroscopicus var limoneus [31]. Validamycin A đặc biệt có hiệu quả
để phịng chống các bệnh nấm thực vật do Rhizoctonia solani gây ra như khô vằn,
thối thân, thối rễ, đốm đen trên nhiều loại hạt. Ngoài hoạt tính chống lại R.solani,
Validamycin A cịn có hoạt tính chống vi khuẩn và một số nấm khác nữa. Theo Cục
Bảo vệ mơi trường Mỹ (FPA), Validamycin A có độ độc thuộc nhóm IV, nghĩa là
chúng được sử dụng trong thực tiễn và khơng độc. Vì thế, Validamycin được coi là
một trong những sản phẩm kháng nấm lý tưởng có nguồn gốc VSV, có triển vọng
và an tồn cho mơi trường [31].
Ở Việt Nam đã có những cơng trình nghiên cứu và ứng dụng CKS trong

phòng chống các bệnh do vi nấm ở thực vật. Bùi Thị Việt Hà và cộng sự đã ứng
dụng chế phẩm kháng sinh T-41 và D-42 có nguồn gốc XK để chống nấm
Sclerotium rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua và nấm R. solani gây bệnh lở cổ rễ,
thối bắp ở bắp cải và đã được thử nghiệm ngoài đồng ruộng cho kết quả khả quan
[10], [11].
Thực tế đã cho thấy, việc sử dụng các CKS có nguồn gốc XK trong lĩnh vực
bảo vệ thực vật có nhiều triển vọng hơn so với hóa chất bảo vệ thực vật bởi các hợp
chất tự nhiên này có nhiều ưu việt: có tác dụng chọn lọc cao, có thể tiêu diệt VSV
gây bệnh ngay ở nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thường khơng độc hoặc độc thấp
với người, động vật và thực vật, có khả năng ức chế VSV đã kháng thuốc hóa học,
thời gian bán hủy ngắn do đó khơng gây ơ nhiễm mơi trường… CKS và dịch lên
men các chủng sinh CKS được dùng để xử lý hạt giống trước khi gieo trồng nhằm
tiêu diệt mầm bệnh bên trong và ngoài hạt, diệt bệnh ở các bộ phận trên mặt đất của
cây và làm sạch mầm bệnh trong đất. Tuy nhiên, để khắc phục tính kháng thuốc của
VSV, ngồi việc định kỳ thay thuốc, người ta còn dùng phối hợp nhiều CKS. Bên


cạnh đó cịn cần chú ý tới việc đảm bảo sự cân bằng của khu hệ VSV hữu ích trong
đất.
Nhìn chung, so với trong y học, việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực
vật vẫn còn ở mức độ thấp, tuy nhiên, những thành tựu thu được và xu hướng phát
triển hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của CKS trong nền nông nghiệp hiện
đại. Cần phải có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong việc tìm kiếm CKS mới,
xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, đồng thời có thể phối hợp với các biện pháp
hóa học sẽ đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và nâng cao hiệu
suất cây trồng.
1.5. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG
Hiện nay, tốc độ ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, do đó cần
phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc xử lý chất thải ra ngồi mơi
trường. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme có khả năng và triển vọng

trong giám định và xử lý ô nhiễm môi trường. Trong lĩnh vực này, VSV môi trường
đang là phương pháp tiếp cận nghiên cứu tốt nhất của thế giới.
1.5.1. ển chọn xạ khuẩn sinh enzyme
VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để duy trì
sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzyme đa dạng và
phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng sinh enzyme như
nhau, ngay cả những chủng cùng một lồi cũng khơng cùng hoạt tính sinh tổng hợp
enzyme [21]. Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng VSV có hoạt
lực cao trong việc tạo thành enzyme mong muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn
các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác
thải; tuyển chọn các VSV sinh enzyme chịu kiềm, chịu axit thường phân lập từ nơi có
độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu
đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy… Tuy nhiên, trong thực tế, để tuyển chọn được
các chủng VSV có hoạt tính enzyme mạnh và có khả năng ứng dụng trong sản xuất
địi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Bên cạnh đó có nhiều


chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi cần phải tiếp tục
nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người.
Một số nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã chỉ ra rằng các chủng
XK thuộc chi Streptomyces có khả năng sinh một số enzyme có ý nghĩa quan trọng
trong công nghệ xử lý môi trường. Ziad Jaradat và cộng sự (2008) đã phân lập,
tuyển chọn được chủng Streptomyces sp. J2 từ các bãi rác thải cơng nghiệp có khả
năng sinh enzyme cellulase mạnh sử dụng trong xử lý rác thải [57]. De Azeredo và
cộng sự (2006) đã ứng dụng enzyme protease từ chủng XK Streptomyces sp. 594 ưa
nhiệt để phân hủy các phế thải từ ngành công nghiệp gia cầm [38].
Theo nghiên cứu của tác giả Phạm Hồng Ngọc Thùy (2008) đã phân lập và
tuyển chọn được chủng Streptomyces griseus VTCC-A-1126 có khả năng sinh tổng
hợp chitosanase khi chúng được ni trong mơi trường có chất cảm ứng là chitosan.
Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong vỏ

tôm, cua, ghẹ. Trước đây để phân hủy chitin, người ta thường phải sử dụng axit HCl
đậm đặc gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, việc thu nhận chế phẩm enzyme
chitosanase từ Streptomyces griseus có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy
chitin bằng phương pháp sinh học, giúp tạo sản phẩm có chất lượng tốt và ít gây ơ
nhiễm mơi trường… [20].
Viện Công nghệ Môi trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
nghiên cứu cho ra một chế phẩm vi sinh xử lý môi trường hiệu quả và được ứng
dụng rộng rãi tại Hà Nội, Phú Thọ, Thái Bình…, đó là chế phẩm Biomix 1. Đây là
0

một tập hợp gồm 10 chủng VSV ưa nhiệt (sinh trưởng tối ưu ở 45 - 55 C) thuộc
nhóm XK chi Streptomyces và vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Các chủng này có ưu
điểm là sinh các enzyme xenlulase, amylase, protease ngoại bào có tác dụng phân
hủy mạnh các chất hữu cơ trong chất thải và là những chủng VSV không gây bệnh
cho người và động vật, thực vật.
1.5.2. số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trường
Cho tới nay, người ta đã biết được khoảng 3.000 enzyme. Tất cả các enzyme
đều được gọi tên và được xếp vào “Hệ thống phân loại” gồm 6 lớp. Trong đó, chỉ