Nghiên cứu sản xuất axit poly gamma glutamic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------------------------------

ĐÀO VĂN MINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
AXIT POLY GAMMA GLUTAMIC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------------------------------

ĐÀO VĂN MINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
AXIT POLY GAMAMA GLUTAMIC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ

Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.
Trần Liên Hà – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại
học Bách khoa Hà Nội, Cô đã ln tận tình hướng dẫn chỉ bảo tơi trong suốt q
trình thục hiện luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học &
Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã chỉ bảo tơi trong q
trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, bạn, trong phịng thí
nghiệm – bộ mơn Vi sinh – Hóa sinh – SHPT Viện Cơng nghệ sinh học & Công
nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã ln chia sẻ và giúp đỡ tơi
trong q trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình tơi đã ln động viên, tạo điều kiện để
tơi học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu khoa học của tơi. Các
kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được cơng
bố trong bất kỳ các cơng tình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng năm

Đào Văn Minh

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC HÌNH.....................................................................................................iii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN......................................................................................................... 3
1.1.Poly γ- glutamic acid (γ-PGA)..................................................................................... 3
1.2. Cấu trúc và tính chất của γ-PGA ................................................................................ 5
1.2.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA ................................................................................ 5
1.2.2. Tính chất của γ-PGA............................................................................................ 6
1.2.3. Phân loại γ-PGA .................................................................................................. 7
1.3. Cơ chế tổng hợp γ-PGA .............................................................................................. 8
1.4. Vi khuẩn tổng hợp γ-PGA ........................................................................................ 11
1.5. Ứng dụng của γ-PGA ................................................................................................ 12
1.5.1. Trong lĩnh vực y tế............................................................................................. 13
1.5.2. Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm ................................................................ 15
1.5.3. Trong lĩnh vực môi trường................................................................................. 15
1.5.4. Trong lĩnh vực mỹ phẩm.................................................................................... 16
1.5.5. Trong lĩnh vực nông nghiệp............................................................................... 16
1.5.6. Trong các ngành công nghiệp khác ................................................................... 16
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP....................................................................... 17
2.1. Vật liệu ...................................................................................................................... 17
2.1.1. Đối tượng ........................................................................................................... 17
2.1.2. Mơi trường ......................................................................................................... 17
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................. 17
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 18
2.2.1. Tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp PGA ................................................. 18

2.2.2. Phương pháp định tên ........................................................................................ 18
2.2.2.1. Định tên theo phương pháp sinh lý, sinh hóa ............................................. 18
2.2.3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng và phát
triển của chủng vi khuẩn .............................................................................................. 21
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng PGA ............................................................ 21
2.2.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA .................................... 22
2.2.5.1. Ảnh hưởng nguồn các bon .......................................................................... 22
2.2.5.2. Ảnh hưởng nguồn nitơ ................................................................................ 22
2.2.6. Tối ưu đa yếu tố ................................................................................................. 23
2.2.7. Nghiên cứu động học quá trình lên men ............................................................ 25
2.2.8. Phương pháp tinh sạch ....................................................................................... 25
2.2.9. Phương pháp xác định hàm lượng Protein......................................................... 26
2.2.10. Phương kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử bằng điện di sdspage .............................................................................................................................. 26
Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử trong điện trường, tốc độ di chuyển
phụ thuộc vào khối lượng phân tử, điện tích. .............................................................. 26
2.2.11. Nghiên cứu cấu trúc PGA ................................................................................ 26
2.2.11.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) ....................................................... 26
2.2.11.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .................................. 27
2.2.12. Khảo sát đặc tính sinh học PGA ...................................................................... 28


2.2.12.1. Khả năng loại ion Fe3+, Cu2+..................................................................... 28
2.2.12.2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn ............................................................... 28
PHẦN III: KẾT QUẢ……………………………………………………………………..29
3.1. Tuyển chọn chủng có khả năng sinh PGA ................................................................ 29
3.1.1. Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường tổng
hợp PGA ...................................................................................................................... 29
3.1.2. Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo độ nhớt............................................... 30
3.1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA bằng cách xác
định hàm lượng PGA ................................................................................................... 31

3.2. Định tên bằng phương pháp sinh hóa ....................................................................... 31
3.2.1. Xác định khả năng đồng hóa các nguồn cacbon bằng kit API 50CHB ............. 31
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng và phát triển của chủng
B5 ..................................................................................................................................... 33
3.4. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................................... 35
3.4.1. Tách chiết DNA tổng số từ chủng B5................................................................ 35
3.4.2. Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR ...................................... 36
3.4.3. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 và so sánh trên giữ liệu
ngân hàng gen .............................................................................................................. 37
3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PGA .................................. 39
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ ......................................................................... 39
3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon và nồng độ ................................................. 41
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống ............................................................ 42
3.5.4. Nồng độ cơ chất và đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ................................... 43
3.6. Tối ưu đa yếu tố ........................................................................................................ 44
3.7. Khảo sát động thái quá trình lên men tổng hợp PGA từ chủng Bacillus. subtilis B5
......................................................................................................................................... 49
3.8. Thí nghiệm kiểm chứng xác định hàm lượng PGA trước và sau tối ưu ................... 51
3.9. Thu nhận và tinh sạch PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 ....................................... 52
3.9.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa PGA ......................................................................... 52
3.9.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi kết tủa PGA ................................................................ 52
3.9.3. Đánh giá độ tinh sạch......................................................................................... 53
3.10. Đề suất quy sản xuất và thu hồi PGA ở dạng chế phẩm kỹ thuật ........................... 56
3.11. Đặc tính PGA .......................................................................................................... 57
3.11.1 Phổ hồng ngoại FT- IR ..................................................................................... 57
3.10. Xác định khả năng loại ion Fe3+, Cu2+ .................................................................... 58
3.11. Khả năng kháng khuẩn ........................................................................................... 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 60
1. Kết luận ........................................................................................................................ 60
2. Kiến Nghị ..................................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 61


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16SF

Mồi xuôi

16SR

Mồi ngược

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

Ca

Canxi

CMC

Carbon methyl cenlullose

DNA

Deoxylribonucleic aicd

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

V/p

Vịng/phút

Rrna

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

g/l

Gam/lít

G-

Gram âm

G+

Gram dương

K – γ-PGA

Kali – γ-PGA

PCR

Guanosine triphosphate

PDGA

Poly γ- D-glutamic acid

PLDGA

Poly γ- D,L- glutamic

PLGA

Poly γ- L-glutamic acid

VO – γ-PGA

Vanadyl – γ-PGA

γ-PGA

Poly γ- glutamic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra γ-PGA [18]

17

Bảng 2. Sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn

18

Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR

26

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

26

Bảng 2.3. Khoảng biến đổi của các yếu tố

29

Bảng 2.4. Thí nghiệm với 4 yếu tố

30

Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ tương Chao và 34
ThuaNao
Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn chủng trên môi trường đặc hiệu

36

Bảng 3.3. Kết quả đo độ nhớt của các chủng được tuyển chọn

37

Bảng 3.4. Kết quả thử kit API 50 CHB của chủng vi khuẩn B5

39

Bảng 3.6. Bảng kết quả sau tối ưu quy hoạch thực nghiệm

53

Bảng 3.7. Bảng phân tích ANOVA

55

Bảng 3.8. Kết quả thu hồi PGA

59


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cơng thức phân tử γ-PGA

7

Hình 2: Natto – Nhật Bản

8

Hình 3: Chungkokjang – Hàn Quốc

8

Hình 4. Cấu trúc của phân tử γ-PGA dạng muối và dạng ion[13]

10

Hình 5. Cấu trúc phân tử PDGA

14

Hình 6. Con đường tổng hợp γ-PGA [23]

15

Hình 3.1. Kết quả định lượng γ-PGA của các chủng vi khuẩn

39

Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng của chủng B5 42
Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của chủng B5

42

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng B5

43

Hình 3.5. Điện di đồ DNA tổng số chủng B. subtilis B5

44

Hình 3.6. Sản phẩm PCR vùng 16S RNA của chủng B5

45

Hình 3.7. Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng B5

46

Hình 3.8. So trình tự 16s RNA của chủng B5 trên NCBI

47

Hình 3.9. Sơ đồ cây phát sinh lồi của chủng B5

48

Hình 3.10. Ảnh hưởng nguồn Nitơ

49

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

51

Hình 3.12. ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống

52

Hình 3.13. Ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất

53

Hình 3.14. Khi thời gian và nhiệt độ thay đổi, cơ chất và pH ở giá trị trung 57
bình
Hình 3.15. Khi cơ chất và nhiệt độ thay đổi, thời gian và pH ở giá trị trung 57
bình
Hình 3.16. Khi nhiệt độ và pH thay đổi, cơ chất và thời gian ở mức trung 58
bình
Hình 3.17. Khi thời gian và pH thay đổi, cơ chất, nhiệt độ giữ ở mức trung 59
bình
Hình 3.18. Khi cơ chất, ph thay đổi, thời gian, nhiệt độ ở mức trung bình

59


Hình 3.19. Hàm lượng PGA trước và sau tối ưu

60

Hình 3.19. Điện di PGA trên gel polyacrylamide 6%

60

Hình 3.20 Điện di trên gel polyacrylamide 12%

61

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất PGA ở quy mơ phịng thí 62
nghiệm
Hình 3.22 Phổ hồng ngoại FTIR của PGA

63

Hình 3.23. Khả năng loại ion Fe3+, Cu2+

64

Hình 3.24. Khả năng kháng khuẩn

64


MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, các sản phẩm lên men truyền thống rất phong phú và đa rạng.
Trong đó các sản phẩm lên men từ đậu tương với hệ vi sinh rất đặc trưng, cung cấp
nhiều hợp chất có lợi cho con người. Việc khai thác các hệ vi sinh vật từ các sản
phẩm lên men hiên nay đang rất phát triển nó cung cấp rất nhiều các hợp chất có
khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực : y dược, thực phẩm, mơi trường, nơng
nghiệp…
Trong đó Poly γ-glutamic aicd (PGA) được tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn
Bacillus có rất nhiều trong các sản phẩm lên men từ đậu tương. PGA là polymer
mang điện tích âm, nó tồn tại dưới dạng homo-polyamide và được hình thành do Dvà L-glutamic nối với nhau bởi liên kết giữa hai nhóm α-amino và γ-carboxyl. PGA
có khối lượng phân tử rất lớn và có nhiều mức khối lượng từ 100kDa – 2000kDa.

Chính vì vậy đặc tính của PGA rất phong phú: khả năng hịa tan trong nước rất lớn,
có khả năng bị phân hủy sinh học, không gây độc hại cho cơ thể sinh vật và mơi
trường.
Poly γ-glutamic aicd có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, y
tế, môi trường, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác... Đã được nhiều
công ty trên thế giới sản xuất với giá thành cao. Trong tự nhiên PGA là sản phẩm
ngoại bào của một số Bacillus, được phân lập trong các sản phẩn lên men có nguồn
gốc từ đậu tương được biết đến ở nhiều nước châu á : Natto, Chungkogiang,
Thuanao…
Tại Việt Nam, chưa có một nghiên cứu về sản xuất PGA từ vi khuẩn Bacillus
được phân lập từ tương. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nghiên cứu sản xuất Poly γ-glutamic aicd”
Mục tiêu nghiên cứu:
+ Nghiên cứu thu nhận PGA với hàm lượng cao, xác định một số đặc tính PGA từ
Bacillus subtillis
+ Đề xuất được quy trình sản PGA
Nội dung:
+ Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus subtillis có khả năng tổng hợp PGA cao.
1


+ Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa và định tên chủng Bacillus subtillis phân lập
được.
+ Khảo sát đơn yếu tố và đa yếu tố đến quá trình lên men tổng hợp PGA từ Bacillus
subtillis.
+ Thu hồi và xác định đặc tính PGA

2

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1.Poly γ- glutamic acid (γ-PGA)
Poly γ- glutamic acid (γ-PGA) là một polymer tự nhiên mang điện tích âm,
đơn phân là D- và L-glutamic nối với nhau bởi liên kết giữa nhóm α-amino và γcarboxyl [1]. Poly γ- glutamic acid có độ nhớt cao, được sản xuất chủ yếu bởi một
số loài Bacillus. Poly γ-glutamic aicd tan trong nước, có khả năng phân hủy sinh
học, ăn được và không độc với con người và môi trường. Nhiều ứng dụng của γPGA đã được phát triển trong thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, cơng nghiệp và nơng
nghiêp [1;2;3;23;24].
Nó được biết đến lần đầu tiên vào năm 1921 bởi Kramar, năm 1937
Ivánovice và cộng sự đã phát hiện ra γ-PGA khi họ nghiên cứu về lớp màng bao
quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis [23, 25, 26] một loại vi khuẩn gây nên bệnh than
rất nguy hiểm cho động vật ăn cỏ và con
người.
Năm 1913 Sawamura đã phân lập được một
chủng Bacillus subtilis từ Natto- một thực
phẩm lên men truyền thống từ đỗ tương của
người dân Nhật Bản. Năm 1942 Bovanovick,

Hình 1: Công thức phân tử γ-PGA

đã chứng minh được γ-PGA là thành phần chính cùng với fructan tạo nên chất nhầy
dính nhớt của Natto bởi vi khuẩn Bacillus subtilis [27]. Ông cũng chứng minh rằng
γ-PGA là sản phẩm lên men ngoại bào thông thường của Bacillus subtilis và đến
năm 1997 người ta mới có thể mơ tả được cấu tạo của γ-PGA [23].

3


Hình 2: Natto – Nhật Bản

Hình 3: Chungkokjang – Hàn Quốc

Kích thước, đặc tính của γ-PGA biến đổi và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật
tổng hợp nên chúng cũng như điều kiện môi trường. Poly γ-glutamic aicd giúp cho
vi khuẩn sống sót trong mơi trường nồng độ muối cao và ngăn cản thực khuẩn thể
xâm nhập. γ-PGA có khối lượng phân tử rất lớn và khác nhau dao động từ 100kDa2000kDa, tùy từng chủng sản xuất [1;23]
Poly γ-glutamic aicd khơng chỉ được tìm thấy ở sản phẩm Natto của người
Nhật mà nó cịn có trong các sản phẩm lên men truyền thống một số nước Đông Á
và Đông Nam Á. Thái lan cũng có một sản phẩm tên “Thua-nao” tương tự như lên
men Natto (Nhật). Đây là một sản phẩm truyền thống và được làm chủ yếu ở miền
bắc Thái Lan. Thua-nao có độ nhớt ít hơn so với Natto, trong q trình lên men
Thua-nao cịn có sự sản sinh ra các enzyme kìm hãm γ-PGA, và các nhà nghiên cứu
cũng đã chứng minh trong sản phẩm này có sự tham gia của các vi khuẩn Bacillus
[5]. Tại Hàn Quốc sản phẩm truyền thống của người dân Andong phía nam nước
này được làm từ đậu tương lên men có tên là chungkookjang đã được các nhà khoa
hoc Hàn Quốc phân tích và tuyển chọn một chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh ra
γ-PGA như là thành phần chính tạo độ nhớt cho dịch. Loại vi khuẩn này sau đó
được định tên là Bacillus. subtilis và có tên riêng là chungkoongjang. Ở Nelpal các
nghiên cứu cũng tìm thấy γ-PGA trong “Kinema”- một sản phẩm thực phẩm truyền
thống của người dân nước này cũng làm từ đậu tương [11;13].
Các nghiên cứu sâu hơn về γ-PGA đã được tiến hành từ đó sản phẩm này trở
thành một polyme hiện đại nhận được sự quan tâm nhiều từ các nhà khoa học trong
100 năm trở lại đây. Phương pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA
đã được Ashiuchi và cộng sự đưa ra [14;16].
Một nghiên cứu mới đây, năm 2006 bởi Masaaki Morikawa và cộng sự khi
họ nghiên cứu về sự hình thành màng sinh học (biofilm) từ chủng Bacillus subtilis
đã được chứng minh thành phần chính là γ-PGA đã mở ra một hướng ứng dụng mới
đầy tiềm năng cho γ-PGA trong tương lai [3].

4

1.2. Cấu trúc và tính chất của γ-PGA
1.2.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA
γ-PGA là một polyme tự nhiên mang điện tích âm đơn phân là L-glutamic
acid hoặc D-glutamic acid hoặc chứa cả hai, liên kết với nhau bằng mối liên kết
giữa nhóm α-amino và nhóm γ-carboxyl [13;24]. Thơng thường α-NH2 liên kết với
α-COOH tạo nên liên kết α-peptide. Nhưng khi có được một hệ enzyme xúc tác
thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptide.
Nếu trong mơi trường có L-glutamic acid hay vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất
này thì mối liên kết γ-peptide được hình thành, vi khuẩn có khả năng chuyển hóa
trực tiếp hay gián tiếp L-glutamic acid thành D-glutamic acid thì hai dạng này sẽ
đồng trùng hợp tạo ra γ- D-L- PGA [24].

Hình 4. Cấu trúc của phân tử γ-PGA dạng muối và dạng ion [13]
Trên hình 4, Phân tử PGA là một chuỗi dài có khối lượng tùy từng chủng vi
sinh tổng hợp và môi trường dinh dưỡng thường dao động trong khoảng 100kDa2000kDa[1;23]. Cấu trúc PGA có thể chia như sau:
PGA chỉ có đơn phân là D-glutamic chỉ được tổng hợp bởi loài B. anthracis. Cấu
trúc của PDGA đã được giả định thơng qua mơ hình 10 hoặc 20 glutamat trong
nước ( Zanuy và Aleman, 2001)
5


Hình 5. Cấu trúc phân tử PDGA (Zanuy và Aleman, 2001)
Mơ hình lý thuyết này cho thấy một phân tử PDGA trong nước là một chuỗi
xoắn trái ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử, giữa nhóm CO và NH. Khi đo độ
phân tán quang (ord) là cấu trúc chuỗi soắn 3.17 và 3.19( Burckner 1953, Zanuy và
Aleman, 2001).
PGA là hỗn hợp D và L-glutamic đã được Sawa đề xuất, trong đó tỉ lệ D và
L glutamic là khoảng 58/42. Dạng hỗn hợp này có 3 cấu trúc là xoắn ốc α, tấm β và
cấu trúc cuộn ngẫu nhiên. Cấu trúc này rất linh hoạt, thay đổi tùy thuộc vào nồng độ

PGA và pH của dịch (He et at, 200). Ở nồng độ PGA thấp (0,1% w /v) và pH dưới
7,0, PGA có cấu trúc chủ yếu là α-xoắn. Khi nồng độ và pH tăng lên, PGA chuyển
sang dạng cấu trúc hỗn hợp giữa xoắn α và tấm β, chủ yếu là tấm β khi ở nồng độ
0,5% w /v. Trong đó cấu trúc tấm β chiếm phần lớn (Joyce et al, 2006).
1.2.2. Tính chất của γ-PGA
Poly γ-glutamic aicdtan trong nước, có thể phân hủy sinh học, ăn được,
khơng độc với môi trường, sinh vật và con người. Poly γ-glutamic aicd hòa tan tốt
trong nước và tạo được các liên kết bền vững với H2O [13;16;23]. Nó có thể được
phân tách nhờ sắc kí giấy [18]. Poly γ-glutamic aicd khác biệt với protein cả về cấu
trúc và tính chất chính bởi liên kết γ-peptide. Thường thì các liên kết α-peptide bị
phân cắt bởi protease nhưng γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởiγ-GTP (γglutamyltranspeptidase) [24].

6


Poly γ-glutamic aicd tinh khiết có độ nhớt cao dù ở nồng độ thấp, đặc biệt
kết hợp với một số thành phần hóa học khác mà chủ yếu là fructan để tạo nên một
phức chất có độ nhớt rất cao [10;23].
Poly γ-glutamic aicd có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo muối có
ứng dụng rộng rãi trong ngành y tế, môi trường, mỹ phẩm như các ion : Na+, K+,
Mg2+, Ca2+, NH4+ [14;24].
Trong các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học Mỹ và Nhật chỉ ra rằng
chất gian bào được sản xuất bởi Bacillus subtilis B-1 có khả năng hình thành rất
mạnh màng sinh học nổi (floating biofilms) ngồi mơi trường, sau khi tinh sạch,
chúng được xác định chứa chủ yếu γ-PGA [3].
Poly γ-glutamic aicd có thể nhận biết thơng qua nhuộm bằng xanh methylen,
đặc điểm để phân biệt với protein có thể nhận biết khi nhuộm vằng comassi blue.
Kích thước cũng như khối lượng của polyme này rất đa dạng phụ thuộc vào
cấu trúc cũng như dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trường vi sinh
vật. Khối lượng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu

kilo dalton. Nhìn chung, các phân tử PDLGA thường có khối lượng lớn hơn nhiều
so với PDGA hay PLGA. Dạng neo thường có kích thước nhỏ hơn dạng tự do [13].
1.2.3. Phân loại γ-PGA
Có nhiều hình thức phân loại γ-PGA tùy thuộc vào cấu trúc, chủng vi sinh
vật tổng hợp hay phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật. Tuy nhiên có
hai phương pháp phân loại phổ biến nhất:
Phân loại theo cấu trúc
Có 3 loại phân tử γ-PGA như sau [13;14]:
Poly γ- D-glutamic acid (PDGA): chỉ chứa các đơn phân là D- glutamic acid.
Cho tới nay, Bacillus anthracis là chủng vi khuẩn điển hình nhất được biết đến sản
xuất PDGA. PDGA không gây độc đối với động vật ăn cỏ và động vật có vú, nhưng
nó làm vô hiệu khả năng miễn dịch của vật chủ và cuối cùng thúc đẩy mức độ
nghiêm trọng các triệu chứng của bệnh than [14].
Poly γ- L-glutamic acid (PLGA): chỉ chứa các đơn phân là L- glutamic acid.
PLGA được sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn cực kỳ ưa mặn như khuẩn cổ
7


Natrialba aegyptiacia để chống lại sự mất nước trong điều kiện môi trường nồng độ
muối cao [2;20]. PLGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các động vật có súc tu
(sứa biển, san hơ) và thành phần chính trong chất dính của Hydra. PLGA kết hợp
với các cation như Ca²+, Mg2+ và K+ giúp sinh vật, vi khuẩn điều hòa áp suất thẩm
thấu bên trong tế bào [14;17].
Poly γ- D,L- glutamic acid (PLDGA): chứa cả hai loại đơn phân là L và D
glutamic acid. PLDGA được sản xuất chủ yếu từ Bacillus được chia làm 2 nhóm:
Phụ thuộc vào glutamic acid, không phụ thuộc vào glutamic acid.Tỷ lệ D/L trong
PLDGA phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+trong môi trường phát triển của vi khuẩn tùy
thuộc vào loài vi khuẩn [14].
Phân loại theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật, có 2 dạng như sau
[18]:

Poly γ- glutamic acid dạng tự do được tiết trực tiếp vào môi trường nuôi cấy.
Cách phân loại này chủ yếu dựa trên hệ enzyme của vi sinh vật. Loại vi
khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng neo là Bacillus anthracis. Đối với loài vi khuẩn
này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn
công vào bên trong tế bào. Cịn loại vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự do là
Bacillus subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn và có vai
trị cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp môi trường thiếu dinh
dưỡng [18].
1.3. Cơ chế tổng hợp γ-PGA
Rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ con đường trao đổi
chất và các enzyme có liên quan đến q trình polyme hóa để tạo γ-PGA nhằm tăng
năng suất tạo sản phẩm. Ogawa đã chỉ ra rằng enzyme transglutaminase có vai trị
quan trọng trong q trình polyme hóa tạo ra γ-PGA. Mặt khác, Thorne và cộng sự
chỉ ra rằng enzyme glutamyl transamidase tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển
hóa nhóm glutamyl từ L-glutamine sang dạng đồng phân của glutamic acid hoặc
tạo các liên kết peptide giữa các gốc acid amin. Ngoài ra các kết quả của họ cho
thấy rằng phản ứng tạo chuyển liên kết peptid được xúc tác bởi enzyme glytamyl
transpeptidase trong cùng hệ enzyme đó. Các nghiên cứu này cho thấy hàng loạt cơ
8


chế phản ứng chuyển hóa amin và liên kết peptide tham gia tổng hợp poly glutamyl
[23]. Một hệ enzyme sẽ tham gia phản ứng tổng hợp ra γ-PGA với quá trình chuyển
hóa sau đây:

Hình 5: Con đường tạo ra γ-PGA [23]
Thực ra, các enzyme này chỉ tạo ra được các đồng phân. Bacillus anthracis
và Bacillus subtilis khơng hề có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA. Điều đó
chứng tỏ quá trình tạo ra γ-PGA nhờ vào sự đồng phân hóa chỉ là con đường phụ.
Có một con đường chuyển hóa chính khác [23].

Những nghiên cứu khác nhau về quá trình tổng hợp polymer glytamyl được
thực hiện bởi các nhóm độc lập đã đưa ra các kết quả khác nhau. Năm 1973, Troy
đã tìm ra một phức hợp các enzyme poly- glutamyl synthetase ở màng nhầy bao
quanh vi khuẩn Bacillus licheniformis 9945A xúc tác cho hàng loạt phản ứng trên
màng trong đó L- glutamic acid được hoạt hóa, đồng phân hóa và polyme hóa thành
cấu trúc PDGA như là một sản phẩm tiết vào canh trường dạng hòa tan. Hệ enzyme
này địi hỏi năng lượng ATP khơng thể thay thế bằng các nguồn năng lượng cao
khác. Trong môi trường u cầu có Mg2+mà khơng thể thay thế bằng các ion kim
loại hóa trị hai khác [6;23].
Năm 1962, Leonard và Housewight, phân tách được một hệ enzyme tổng
hợp γ-PGA cũng từ chủng Bacillus licheniformis 9945A. Tuy nhiên, hệ enzyme này
xúc tác tạo ra một loại γ-PGA chứa 60% là L-glutamic acid. Chúng địi hỏi Mn2+ là
co-factor mà khơng thể thay thế bằng Mg2+hay bất kì ion kim loai hóa trị hai nào
khác. Bên cạnh đó, nó sử dụng tất cả các nguồn năng lượng như ADP, GTP,CTP
.v.v.chứ không chỉ ATP [19;23].
9


Năm 1980, Noda đã công bố việc tách được một hay một số enzyme ngoại
bào từ Bacillus Natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa amin đặc biệt là
cho glutamine. Cả L và D-glutamine đều là cơ chất, các đơn phân này được chuyển
hóa thành đơn phân cịn lại rồi chúng sẽ liên kết với nhau bằng γ peptide và tồn tại
dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân. Kết quả là có hàng loạt enzyme phải
tham gia vào quá trình tổng hợp này [22;23].
Quá trình tổng hợp γ-PGA sử dụng các hệ enzyme đa dạng tùy thuộc vi sinh và môi
trường nuôi cấy. Các phân tử γ-PGA tạo ra cũng hết sức đa dạng. Tất cả được minh
họa trong hình sau:

Hình 6. Con đường tổng hợp γ-PGA [23]

10


1.4. Vi khuẩn tổng hợp γ-PGA
Một số sinh vật (vi khuẩn, vi khuẩn cổ, động vật; bảng 1) sản xuất γ-PGA tự
do. Kết quả bảng 1 cho thấy tất cả các vi khuẩn sản xuất γ-PGA đều là Gram dương
chủ yếu là các vi khuẩn thuộc loài Bacillus, thuộc lớp trực khuẩn, do đó các chủng
này liên quan chặt chẽ với nhau. γ-PGA có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo
lồi tổng hợp và mơi trường của chúng[18].
Vi khuẩn ở đất (chủ yếu là từ loài Bacillus) sử dụng γ-PGA cho việc cô lập
các ion kim loại độc hại, tăng sức đề kháng trong môi trường bất lợi. Poly γglutamic acid cũng có thể là một nguồn glutamate cho vi khuẩn ở trong tình trạng
đói trong giai đoạn chết dần của canh trường. Planococcus halophilus,
Sporosarcina halophile và Natrialba aegyptiaca là những vi khuẩn cổ có khả năng
sản xuất γ-PGA, sử dụng nó để làm giảm nồng độ muối xung quanh tế bào cho phép
chúng tồn tại trong một môi trường khắc nghiệt [15;18]. Bacillus anthracis sinh
tổng hợpγ-PGA dạng neo giúp thích nghi với sự khắc nghiệt của mơi trường hoặc là
nguồn dự trữ năng lượng dưới [4;14;18].
Hydra là sinh vật có nhân điển hình được biết đến là có khả năng tạo γ-PGA.
Hydra sử dụng các bào quan để bắt mồi và vận động, hàm lượng γ-PGA lớn kích
hoạt khả năng này [14;17;18]. Các động vật có súc tu như sữa biển, san hô cũng tạo
ra PGA với vai trị một chất dính, giữ các sinh vật phù du làm thức ăn [14].

11


Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra γ-PGA [18]
Tên

conformation

Bacillus anthracis

Filament
conformation

D

D

Bacillus D

D

Bacillus mesentericus
(probably
subtilis)

References
Hanby

and

Rydon

(1946)
Bruckner

and

Ivanovics (1937)

Thorne and Leonard

Bacillus licheniformis

D and L

D and L

Bacillus megaterium

D and L

D+L

Bacillus pumilus

D and L

ND

Bacillus subtilis

D and L

L and D +L

Tanaka et al. (1997)

Planococcus halophilus

D

D

Kandler et al. (1983)

Sprorosarcina halophile

D

D

Kandler et al.(1983)

Staphylococus epidemidis

D and L

ND

Natriaba aegyptiaca

L

L

Hezayen et al. (2001)

Hydra

ND

ND

Weber (1990)

(1958)
Ashiuchi et al. (2003)
Schneerson

et

al.(2003)

Kocianova

et

al.

(2005)

1.5. Ứng dụng của γ-PGA
Poly γ-glutamic acid có bản chất là polyme có khả năng phân hủy sinh học,
không độc với con người và có thể ăn được [13;23;24]. Nhận thấy những tiềm năng
to lớn của polyme này, trong khoảng nhiều năm trở lại đây đã có rất nhiều nghiên
cứu trên thế giới được tiến hành với mục đích thu được hàm lượng γ-PGA cao nhất
từ vi khuẩn Bacillus. Sau đây là bảng thống kê hàm lượng γ-PGA thu được trong
các nghiên cứu đã tiến hành trên thế giới:
Bảng 1.2: Sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn

12


Chủng

Nhiệt

độ,

thời

PGA (g/l)

Tác giả

30ºC, 4 days

17-23

Troy (1973)

37ºC, 2 days

10-20

Kunioka and Goto (1994)

30ºC, 4 days

20

Ito et al. (1996)

30ºC, 3-5 days

8-12

Cheng et al. (1989)

B. subtilis F02-1

30ºC, 2-3 days

50

Kubota et al. (1993a,b)

B. subtilis (natto)

40ºC, 4 days

35

Ogawa et al. (1997)

B.

licheniformis

ATCC 9945

B. subtilis IFO
3335
B. subtilis TAM4
B.

licheniformis

A35

gian

Poly γ-glutamic acid được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như công nghệ thực
phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, xử lý môi trường nước, nông nghiệp…[1;13].
1.5.1. Trong lĩnh vực y tế
γ-PGA được sử dụng làm chất mang cho các loại thuốc khác trong quá trình
điều trị căn bệnh ung thư, tiểu đường. γ-PGA còn được sử dụng trong thành phần
của chất cầm máu, và thành phần của chỉ khâu tự tiêu. Keo sinh học là một sản
phẩm được kết hợp giữa gelatin vàγ-PGA, dạng keo này được sử dụng nhiều trong
y học với tác dụng làm lành những tổn thương của phổi [20]. Trong các sản phẩm
chăm sóc da, γ-PGA được kết hợp với tia cực tím, hồng ngoại có tác dụng làm giảm
kích thước của lỗ chân lơng giúp bề mặt da nhẵn mịn hơn sau khi trị liệu [13 ;23].
PGA được quan tâm như là nền tảng phân phối thuốc vì có nhóm carboxyl
trên mạch cung cấp điểm gắn cho các loại thuốc, do đó khiến thuốc hịa tan tố hơn.
Liên hợp PGA thuốc có thể nhập vào các mô và khối u nhả thuốc chậm theo thời
gian tự phân hủy của PGA. Sản phẩm phân hủy là acid glutamic, có thể đi vào
chuyển hóa tế bào bình thường và không được bài tiết qua thận. γ-PGA làm tăng
khả năng miễn dịch bằng cách kích thích tế bào đi gai (CDc) tiết IL12, interferon
gamma để tiêu diệt các khối u.
13

Canxi chiếm khoảng 1,5 – 2% trọng lượng cơ thể. Nhưng khả năng hấp thụ
Ca trong ruột bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như chế độ ăn uống, hàm lượng
phytate và oxalate. Các chất trên với Ca hình thành phức hợp, phức hợp này không
được hấp thụ và bị thải ra bằng đường tiêu hóa. Thiếu hụt Ca có thể dẫn đến chứng
lỗng xương, Ca trong máu thấp có thể dẫn đến hiện tượng co cứng cơ, chuột rút.
Năm 2007, nghiên cứu của Tanimoto đã chỉ ra rằng γ-PGA làm tăng khả năng hấp
thụ Ca đường ruột ở người. Phức hợp Ca – PGA nhanh chóng được bổ sung vào
thực phẩm chức năng để tăng cường khả năng hấp thụ Ca đường ruột giải quyết
nhiều vấn đề liên quan tới thiếu hụt Ca [9;12].
Poly γ- glutamic acid giúp trị bệnh đái tháo đường. Đái tháo đường sảy ra khi
cơ thể không sản xuất đủ insulin, hoặc cơ thể giảm đáp ứng với tác dụng của insulin
làm nồng độ đường trong máu tăng cao. Vanadium là khống chất có nhiều trong tự
nhiên có tác dụng như insulin mà khơng cần đến các chức năng của thận. Vanadium
chuyển hóa thành cation vanadyl kết hợp với γ-PGA hình thành phức hệ Vanadyl –
γ-PGA (VO – γ-PGA). Phức hệ VO – γ-PGA đã được nghiên cứu chứng minh hoạt
động tốt hơn insulin bổ sung vào thực phẩm chức năng giúp trị bệnh đái tháo đường
[9].
Poly γ- glutamic acid chống cao huyết áp. Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh
cao huyết áp trong đó do hấp thu muối quá nhiều là một nguyên nhân quan trọng. K
và Na là hai yếu tố ảnh hưởng đến việc tăng giảm huyết áp, khi hàm lượng K trong
máu thấp, Na cao sẽ dẫn tới tăng huyết áp. K – γ-PGA trong thực phẩm giúp ngăn
ngừa cao huyết áp bằng cách giảm sự hấp thụ và lưu giữ Na và tăng hấp thụ K trong
máu [9].
Poly γ- glutamic acid giúp chăm sóc da. Vitamin C là yếu tố cần thiết cho sự
hình thành collagen giúp sửa chữa và hình thành các mơ da. Nhưng vitamin C đi
vào cơ thể khơng ổn định do nó dễ dàng bị phá vỡ bởi nhiệt độ, ánh sáng… γ-PGA
– Vitamin C làm tăng hấp thu vitamin C đường ruột giúp cải thiện lượng vitamin C
trong cơ thể. γ-PGA – Vitamin C cịn có khả năng ức chế collagenase. Khi da lão
hóa, collagenase được thúc đẩy hoạt động làm giảm độ đàn hồi của da. Vậy γ-PGA

14


– Vitamin C trong thực phẩm ngoài khả năng ức chế collagenase cịn đóng vai trị
chất chống oxy hóa của da [9].
1.5.2. Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm
Ngày nay việc sử dụng phụ gia trong chế biến thực phẩm rất phổ biến như
Carbon methyl cenllulose (CMC) một chất tạo trạng thái trong thực phẩm được sản
xuất theo phương pháp hóa học và được sử dụng với số lượng rất lớn. γ-PGA cũng
là một chất tạo trạng thái, ổn định sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, sản xuất theo
phương pháp sinh hóa, có đặc tính tốt hơn, hiện tại đang được sử dụng thay thế một
phần cho CMC trong công nghệ chế biến thực phẩm (ngành công nghiệp sản xuất
mỳ ăn liền, bún, đồ hộp thịt, nước quả...) [9;13;23].
Trong công nghệ sản xuất bánh kem xốp hiện đại γ-PGA được thêm vào trong
nguyên liệu làm kem cùng với chất nhũ hóa nhằm làm tăng tính chất nhũ hóa, ổn
định sản phẩm kem xốp, và tăng cường tính chất của kem giữa hai mặt bánh, giảm
độ dày của lớp kem giữa hai lớp bánh mà không ảnh hưởng đến chất lượng bánh
[9;13].
Trong đồ uống từ quả tươi thường xảy ra hiện tượng đắng khi các monodiglyceride kết hợp với polycarboxylic acid hoặc muối của acid đó, γ-PGA khi được
thêm vào có tác dụng giảm độ đắng do hỗn hợp những este này gây nên. Khơng
những vậy, nó cịn có tác dụng ổn định hệ cấu trúc nhũ hóa trong sản phẩm giúp sản
phẩm không bị phân lớp trong thời gian bảo quản [9;13].
Poly γ- glutamic acid được sử dụng làm chất phụ gia bổ sung vào các sản
phẩm đông lạnh bởi làm tăng khả năng chống kết tinh của sản phẩm, làm giảm nhiệt
độ đóng băng của sản phẩm xuống [9;13].
Poly γ- glutamic acid là thành phần có trong kẹo cao su, kẹo và đồ uống có tác dụng
chống hơi miệng, ngăn ngừa sâu răng mà không làm giảm hương vị của thực phẩm.
Tác dụng này của γ-PGA được so sánh cao hơn nước muối sinh lý 30 – 35% [9].
1.5.3. Trong lĩnh vực môi trường

γ –PGA được sử dụng như một chất tạo chelat trong xử lý nước thải, làm
nhựa sinh học có tác dụng liên kết bùn nhằm làm đông tụ, kết lắng bùn thay thế cho
muối nhôm sunfat, chitosan, polyacrylic acid… Trong q trình xử lý mơi trường,
15