Quy trình sản xuất mẫu phết máu xét nghiệm plasmodium falciparum và plasmodium vivax dùng cho ngoại kiểm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.07 MB, 94 trang )
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
----------------
NGUYỄN NGỌC HIỀN
QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU PHẾT MÁU XÉT NGHIỆM
PLASMODIUM FALCIPARUM VÀ PLASMODIUM VIVAX
DÙNG CHO NGOẠI KIỂM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN NGỌC HIỀN
QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU PHẾT MÁU XÉT NGHIỆM
PLASMODIUM FALCIPARUM VÀ PLASMODIUM VIVAX
DÙNG CHO NGOẠI KIỂM
Ngành:
Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số:
8720601
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS VŨ QUANG HUY
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của chúng tơi. Các tài
liệu trích dẫn, các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và tuân
theo đúng yêu cầu của một đề tài nghiên cứu. Luận văn này là duy nhất và
chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn
NGUYỄN NGỌC HIỀN
.
.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................i
MỤC LỤC ................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CÂU HỎI NGHIÊN CỨU ........................................................................... 3
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 3
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 4
1.1 Tình hình sốt rét hiện nay ................................................................ 4
1.2 Hình thái Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax ............... 6
1.3 Chu trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét ................................ 10
1.4 Phương pháp phết máu ngoại biên tìm ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax............................................ 12
1.5 Phương pháp test nhanh chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax ........................................... 19
1.6 Ngoại kiểm tra chất lượng ............................................................ 19
CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27
2.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................... 27
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 27
2.3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 29
2.4 Vấn đề y đức và tính ứng dụng ..................................................... 45
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ ............................................................................. 46
3.1 Sản xuất mẫu phết máu P.falciparum và P.vivax .......................... 46
3.2 Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định ......................................... 53
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN .......................................................................... 62
.
.
4.1 Quy trình sản xuất mẫu phết máu Plasmodium falciparum và
Plasmodium vivax ........................................................................................ 62
4.2 Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định ......................................... 71
Kết luận .............................................................................................. 74
Kiến nghị............................................................................................. 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO
.
.
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Việt
Từ viết tắt
Từ đầy đủ
BC
Bạch cầu
HC
Hồng cầu
KSTSR
Ký sinh trùng sốt rét
KST
Ký sinh trùng
TB
Tế bào
TP. Hồ Chí Minh
Thành phố Hồ Chí Minh
Tiếng Anh
Từ viết tắt
CRM
Từ tiếng Anh
Nghĩa tiếng Việt
Certified Referrence material Mẫu chuẩn được chứng
nhận
EDTA
Ethylene diamin tetraacetic
acid
EQA
External quality assessment
Ngoại kiểm tra chất lượng
ISO
International Organization
Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
for Standardization
P. falciparum Plasmodium falciparum
P. vivax
Plasmodium vivax
P. oval
Plasmodium oval
P. malariae
Plasmodium malariae
RDT
Rapid Diagnostic Tests
Phương pháp chẩn đoán
nhanh
.
.
Mẫu chuẩn
RM
Referrence material
SOP
Standard operating procedure Quy trình thao tác chuẩn
WHO
World Health Organization
.
Tổ chức y tế thế giới
.
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Chu kì phát triển của ký sinh trùng sốt rét..................................12
Hình 1.2 Kỹ thuật làm tiêu bản ký sinh trùng sốt rét ................................13
Hình 1.3 Cách quan sát tiêu bản tìm ký sinh trùng sốt rét ........................15
Hình 1.4 Hình ảnh lam máu giọt mỏng đạt và khơng đạt yêu cầu ............17
Hình 1.5 So sánh hình ảnh đại thể và vi thể trên lam máu mỏng và giọt dày
....................................................................................................................17
Hình 2.1 Sàng lọc tác nhân lây nhiễm và kiểm tra lồi KSTSR ...............31
Hình 2.2 Quy trình kỹ thuật làm lam phết máu mỏng và giọt dày ............33
Hình 2.3 Cân hóa chất pH dung dịch đệm.................................................34
Hình 2.4 Đo pH của dung dịch đệm vừa pha ............................................35
Hình 2.5 Dán keo mẫu phết máu khi nhuộm ............................................40
Hình 2.6 Chọn mẫu ngẫu nhiên bằng phần mềm Microsoft Excel ...........41
Hình 2.7 Bảo quản lam máu sau sản xuất..................................................42
Hình 2.8 Mẫu ngoại kiểm sau đóng gói ....................................................43
Hình 3.1 Tế bào bị biến đổi do ngoại cảnh ................................................47
Hình 3.2 Hình dạng P.falciparum và P.vivax trên quang trường 100x .....48
Hình 3.3 Hình ảnh nhuộm với Giemsa pha dung dịch đệm pH 6,0 ..........50
Hình 3.4 Hình ảnh nhuộm với Giemsa pha dung dịch đệm pH 7,2 ..........51
Hình 3.5 Hình ảnh nhuộm với Giemsa pha dung dịch đệm pH 8,0 ..........52
Hình 3.6 So sánh phương pháp nhuộm trên giá và trong buồng nhuộm53
.
.
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu sản xuất phết máu P.falciparum và
P.vivax........................................................................................................36
Sơ đồ 2.2 Thử nghiêm các quy trình nhuộm .....................................36
Sơ đồ 2.3 Quy trình đánh giá tính đồng nhất ...................................41
Sơ đồ 2.4 Quy trình đánh giá độ ổn định .........................................42
.
.
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 So sánh hình thái của kí sinh trùng sốt rét ................................... 9
Bảng 2.1 Nghiên cứu các phương pháp nhuộm ........................................36
Bảng 2.2 Tiêu chuẩn đánh giá mâu lam máu ............................................38
Bảng 2.3 Máy móc và thiết bị sử dụng ......................................................43
Bảng 2.4 Dụng cụ và vật tư tiêu hao .........................................................43
Bảng 2.5 Hóa chất, sinh phẩm ...................................................................44
Bảng 3.1 Đánh giá chất lượng lam máu theo sự thay đổi pH của dung dịch
đệm.............................................................................................................48
Bảng 3.2 Đánh giá tính đồng nhất của phết máu mỏng NC01 P.falciparum
....................................................................................................................54
Bảng 3.3 Đánh giá tính đồng nhất của lam máu dày NC01 P.falciparum 55
Bảng 3.4 Đánh giá tính đồng nhất của phết máu mỏng NC02 P.vivax .....55
Bảng 3.5 Đánh giá tính đồng nhất của phết máu dày NC02 P.vivax ........55
Bảng 3.6 Đánh giá độ ổn định của phết máu mỏng NC01 P.falciparum ..56
Bảng 3.7 Đánh giá độ ổn định của lam máu giọt dàyNC01 P.falciparum 57
Bảng 3.8 Đánh giá độ ổn định của phết máu mỏng NC01 P.vivax ...........59
Bảng 3.9 Đánh giá độ ổn định của lam máu giọt dày NC01 P.vivax ....... 60
.
.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông tư 01/2013/TT‐BYT ngày 11 tháng 01 năm 2013 của Bộ Y tế về
việc Hướng dẫn thực hiện quản lý chất lượng xét nghiệm tại cơ sở khám,
chữa bệnh đã quy định các phòng xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra và
ngoại kiểm tra để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm [2]. Đây cũng là
tiêu chí bắt buộc đối với các xét nghiệm được phép liên thông kết quả xét
nghiệm ban hành theo quyết định 2429/QĐ-BYT ngày 12 tháng 6 năm 2017
của bộ trưởng Bộ Y tế [3]. Phết máu ngoại biên tìm ký sinh trùng sốt rét là
một kỹ thuật xét nghiệm theo phương pháp thủ cơng. Tuy đã có nhiều
phương pháp chẩn đốn khác hiện đại hơn nhưng phương pháp thủ công vẫn
được xem là chính xác, là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán bệnh sốt rét
nguy hiểm [36], [47], [49]. Tuy nhiên do là phương pháp thủ cơng nên sai sót
khi thao tác, hay nhẫm lẫn là một nguy cơ hoàn toàn có thể xảy ra. Vì vậy
đảm bảo chất lượng là vấn đề đáng quan tâm nhất, mỗi phòng xét nghiệm
cần tiến hành nội kiểm tra và đặc biệt là ngoại kiểm tra chất lượng.
Trên thế giới các chương trình ngoại kiểm tra ký sinh trùng sốt rét đã
được triển khai tại nhiều quốc gia và khu vực. Việc xây dựng các ngân hàng
lam máu ngoại kiểm tra chất lượng cũng được Tổ chức Y tế thế giới (World
Health Organization -WHO) quan tâm. Trong đó, mẫu ngoại kiểm hai lồi ký
sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax chiếm tỉ lệ
cao nhất. Đây cũng là hai loài ký sinh trùng phổ biến nhất ở nước ta [15], [5].
Tuy nhiên, để có thể ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm chúng ta cần
có một mẫu chuẩn đạt tiêu chuẩn. Các mẫu chuẩn thường dùng hiện nay đa
số được nhập khẩu từ thị trường nước ngoài với giá thành rất cao. Trong khi
đó, vùng dịch tễ của bệnh sốt rét ở nước ta lại thường tập trung ở vùng mền
núi Tây Nguyên vùng biên giới, ven biển [5], [15] nơi mà mạng lưới cơ sở y
tế gặp nhiều khó khăn nên dù đây là xét nghiệm quan trọng trong chẩn đoán
bệnh sốt rét nhưng chưa có nhiều cơ sở y tế tham gia ngoại kiểm tra chất
.
.
lượng, chưa thể thực hiện đồng nhất và có quy mơ chương trình ngoại kiểm
phết máu ngoại biên tìm ký sinh trùng sốt rét.
Trong tình hình như vậy, việc sản xuất ra được một mẫu kiểm chuẩn
đảm bảo tính đồng nhất và ổn định theo thời gian để có thể tiến hành ngoại
kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm là điều cần thiết. Cần tập trung vào
sản xuất mẫu ngoại kiểm Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax là
hai loài phổ biến nhất và có thể gây ra bệnh sốt rét ác tính với chuyển biến
nguy hiểm và hậu quả nghiêm trọng. Các đơn vị trước đây phải mua mẫu
nước ngoài nhập khẩu với giá cao sẽ tiết kiệm thời gian và chi phí khi sử
dụng mẫu nội địa sản xuất trong nước. Các đơn vị chưa tham gia ngoại kiểm
sẽ có cơ hội tham gia theo qui định với chi phí hợp lí hơn. Từ tình hình thực
tế trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Quy trình sản xuất mẫu phết
máu xét nghiệm Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax dùng cho
ngoại kiểm” nhằm sản xuất ra được mẫu kiểm chuẩn đảm bảo tính đồng
nhất, ổn định, khơng lây nhiễm và ít bị tác động bởi điều kiện môi trường
trong quá trình vận chuyển mẫu. Kết quả của nghiên cứu khơng những giúp
cho các phịng xét nghiệm trong nước có thể tiến hành thực hiện chương
trình ngoại kiểm tra chất lượng với giá cả hợp lý mà còn nhằm nâng cao chất
lượng của các phịng xét nghiệm đảm bảo tính chính xác tin cậy trong quá
trình thực hiện xét nghiệm, tiến tới liên thơng kết quả xét nghiệm đem lại lợi
ích cho cả bệnh nhân, cơ sở y tế và cộng đồng.
.
.
CÂU HỎI NGHIÊN CỨU
Có thể sản xuất được mẫu phết máu xét nghiệm Plasmodium falciparum
và Plasmodium vivax dùng trong ngoại kiểm đảm bảo các tiêu chí đánh giá
chất lượng hay khơng?
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu tổng qt
Quy trình sản xuất phết máu xét nghiệm Plasmodium falciparum và
Plasmodium vivax dùng cho ngoại kiểm.
Mục tiêu cụ thể
1. Nghiên cứu quy trình sản xuất phết máu xét nghiệm Plasmodium
falciparum và Plasmodium vivax dùng trong ngoại kiểm đảm bảo
các tiêu chí đánh giá chất lượng.
2. Đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định và các tiêu chí khác trên mẫu đã
sản xuất.
3. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến mẫu sản xuất.
.
.
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TÌNH HÌNH SỐT RÉT HIỆN NAY
1.1.1 Tình hình sốt rét trên thế giới
Theo số liệu thống kê của Tổ chức y tế thế giới đến năm 2009, bệnh
sốt rét vẫn lưu hành ở 108 quốc gia. Ước tính có khoảng 225 triệu người mắc
và 781 nghìn người chết do sốt rét, riêng châu Phi chiếm 91%; Đơng Nam Á
6%. Châu Mỹ có khoảng 1 triệu người mắc và khoảng một nghìn người chết.
Khu vực Đơng Nam Á sốt rét lưu hành ở hầu hết các nước với 88% dân số
trong tổng số 1320 triệu người. Sốt rét trầm trọng hơn ở các nước tiểu vùng
sông Mê Kông như Trung Quốc, Lào, Myanmar, Campuchia, Thái Lan và
Việt Nam; có khoảng 24 triệu người mắc và khoảng 40 nghìn người chết,
tính trung bình có 3000 trẻ chết do sốt rét ở Châu Phi mỗi năm. Khu vực Tây
Thái Bình Dương có khoảng 2 triệu người mắc và khoảng 3 nghìn người chết
do sốt rét.
Mặc dù bệnh sốt rét đã được thanh toán ở nhiều nơi trên thế giới Bắc
Mỹ, một số nước Bắc Á và bệnh sốt rét cũng đã giảm nhiều ở một số nước
trong đó có cả Việt Nam. Tuy vậy cho đến năm 2010 vẫn có 216 triệu người
mắc sốt rét, 655000 người chết do bệnh sốt rét, đặc biệt ở châu Phi (91%),
Đông Nam Á (6%), Địa Trung Hải (3%), khoảng 86% trẻ em dưới 5 tuổi
chết do sốt rét [115]. Ở các nước Châu Phi như Kenya, Uganda, Tanzania...
bệnh sốt rét luôn ở mức cao [5], [9].
Kể từ năm 2000 cho đến nay, nỗ lực phịng chống sốt rét trên tồn thế
giới đã mang lại những bước tến bộ vượt bậc, tỉ lệ mắc sốt rét đã giảm 37%
và tỉ lệ tử vong do sốt rét giảm 60% trên toàn cầu vào năm 2015. Tuy nhiên,
tình trạng kháng thuốc diệt cơn trùng dùng trong dự phòng, kháng
artemisinin vốn là thuốc chủ lực trong việc điều trị sốt rét, thậm chí kháng
các thuốc dùng trong phương pháp điều trị kết hợp với artemisinin đã và
đang gia tăng, đe dọa đẩy lùi những thành quả đạt được trong việc kiểm soát
.
.
và loại trừ sốt rét. Hiện tượng kháng thuốc không chỉ xuất hiện tại Việt Nam,
ký sinh trùng sốt rét kháng artemisinin đã được phát hiện tại bốn quốc gia
khác trong khu vực Tiểu vùng Sông Mekong Mở rộng: Campuchia, Lào,
Myanmar và Thái Lan. Các nghiên cứu khẳng định rằng hiện tượng kháng
với artemisinin xuất hiện một cách độc lập ở nhiều nơi thuộc khu vực này.
Phần lớn bệnh nhân vẫn được điều trị thành công bằng phương pháp điều trị
kết hợp với artemisinin nếu không bị kháng với thuốc phối hợp. Tuy nhiên, ở
một số nơi tại Campuchia và Thái Lan đã xuất hiện chủng P. falciparum
kháng với cả artemisinin và các thuốc phối hợp (đa kháng thuốc). Sốt rét do
P. falciparum ở Campuchia và Thái Lan đang ngày càng khó điều trị hơn.
Khơng những thế, tình trạng kháng đa thuốc cịn có nguy cơ lan rộng đến
nhiều quốc gia và khu vực khác, gây hậu quả nghiêm trọng [1].
1.1.2 Tình hình sốt rét tại Việt Nam
Năm 2015, tại Việt nam, ước tính có khoảng 11,7 triệu người (xấp xỉ
12,6% dân số) sống tại các vùng dịch sốt rét [4]. Theo số liệu báo cáo hàng
năm của Chương trình phịng chống sốt rét Quốc gia nhiều tỉnh có mức độ
lưu hành sốt rét cao chủ yếu thuộc khu vực Miền Trung - Tây Nguyên hầu
hết các tỉnh có các xã, huyện có đường biên giới với Lào hoặc Campuchia
đều có tỷ lệ bệnh nhân mắc sốt rét cao hơn so với các địa phương khác trong
toàn quốc. Bệnh sốt rét tuy đã giảm nhưng có nguy cơ quay trở lại lớn; đối
tượng dễ mắc bệnh là những người sống ở vùng sâu, vùng xa và đặc biệt là
những người dân sống ở vùng biên giới giữa Việt Nam với Lào và
Campuchia. Tại các vùng này nguy cơ lan truyền sốt rét tiếp diễn và phức
tạp, việc nhiễm bệnh sốt rét chủ yếu thông qua giao lưu tự do nên rất khó
khăn trong việc giám sát, phát hiện, điều trị bệnh nhân sốt rét [1], [5].
Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc ln là một vấn đề nan giải trong
phịng chống sốt rét, ở nước ta. Nhiều nghiên cứu trước đây ở một số vùng
dịch tễ trong cả nước đặc biệt là các tỉnh miền trung, Tây nguyên và miền
Đông Nam Bộ đã ghi nhận sự kháng thuốc của P. falciparum với các thuốc
chloroquine, fansidar, amodiaquine, và cả mefloquine, có những nơi kháng
.
.
chloroquine và fansidar đến hơn 90%. Tại Viêt Nam việc nghiên cứu, theo
dõi đánh giá tình hình sốt rét kháng thuốc được Viện Sốt rét - Ký sinh rùng Côn trùng trung ương, các viện khu vực Quy Nhơn, thành phố Hồ Chí Minh
tiến hành thường xuyên tại các vùng sốt rét lưu hành nặng là khu vực các
tỉnh miền trung – Tây nguyên và tỉnh Bình Phước nhằm phát hiện sớm ký
sinh trùng sốt rét kháng thuốc đặc biệt với Artemisinin và dẫn chất
(Artesunate, dihydro artemisinin…) là thuốc sốt rét có hiệu lực mạnh trong
điều trị hiện nay [1].
1.2 HÌNH THÁI PLASMODIUM FALCIPARUM VÀ PLASMODIUM
VIVAX
Quan sát hình thái ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum
(P.falciparum) và Plasmodium vivax (P.vivax) trên vật kính 100x cả phết
máu mỏng và giọt dày.
Quan sát giọt dày để xác định sự hiện diện của ký sinh trùng vì lượng
máu lấy nhiều hơn giọt mỏng nhưng khó xác định lồi ký sinh trùng, có thể
đếm được mật độ ký sinh trùng sốt rét theo hệt thống đấu cộng (từ 1+ đến
4+) và mật độ ký sinh trùng trên đơn vị microlit máu. Quan sát phết máu
mỏng để xác định loài ký sinh trùng và đếm mật độ ký sinh trùng trên đơn vị
microlit máu sốt rét dựa trên số hồng cầu bị nhiễm [47], [49]. Ký sinh trùng
sốt rét (KSTSR) ln biến đổi hình dạng trong quá trình phát triển ở người
cũng như ở muỗi. Ở người, các giai đoạn phát triển của ký sinh trùng sốt rét
gồm:
- Thể tư dưỡng gồm có giai đoạn non và già.
- Thể phân liệt gồm có giai đoạn non và già.
- Thể giao bào gồm có giống đực và giống cái [8], [47].
Quan sát trên một phết máu nhuộm Giemsa, một KSTSR bao gồm:
- Tế bào chất, nhuộm màu xanh lơ.
- Nhân, nhuộm màu đỏ.
.
.
- Sắc tố sốt rét, có màu màu nâu đen hoặc đen.
- Khơng bào khơng bắt màu [8], [47].
1.2.1 Hình thái Plasmodium falciparum
1.2.1.1 Thể tư dưỡng (Trophozoit)
Thể tư dưỡng bao gồm thể tư dưỡng non hay thể nhẫn và thể tư dưỡng
già. Thể tư dưỡng non rất nhỏ và mảnh, đường kính bằng 1-2 µm, bằng
khoảng 1/6 đường kính hồng cầu, tế bào chất rất mảnh, nhân nằm ở bờ tế bào
chất, đơi khi có 2 nhân. Thỉnh thoảng gặp dạng nhiễm sắc thể bị dẹp, dính
vào thành hồng cầu, khơng nhìn thấy khơng bào của ký sinh trùng, nhân là
một chấm đỏ nằm giữa hai vạch ngắn [8]. Thể tư dưỡng già thường không
thấy trong máu ngoại biên, trừ các trường hợp sốt rét ác tính. Các hạt Maurer
xuất hiện, to nhỏ không đều, nằm rải rác trong hồng cầu. Hồng cầu bị ký sinh
có kích thước tương đương các hồng cầu bình thường [32], [36].
1.2.1.2 Thể phân liệt (Schizont)
Thể phân liệt P.falciparum thường khơng tìm thấy trên phết máu ngoại
biên, chỉ xuất hiện trong một số trường hợp bệnh sốt rét ác tính. Mảnh trùng
nhiều và nhỏ, khoảng từ 16 – 32 mảnh trùng, sắp xếp không đều nhau.
Nguyên sinh chất phân chia kèm theo một mảnh nhân là một mảnh nguyên
sinh chất. Hạt sắc tố hình que màu nâu đen ánh vàng tập trung thành đám
hoặc thành tảng [32], [36].
1.2.1.3 Thể giao bào (Gametocyte)
Thể giao bào P.falciparum xuất hiện sau khoảng 10 ngày từ khi hình
thành thể tư dưỡng có hình lưỡi liền hoặc hình quả chuối dài, hai đầu tròn,
hơi cong. Nhân giao bào cái nhỏ có màu đỏ đậm và các hạt sắc tố tập trung
xung quanh, giao bào đực có màu hồng, to hơn giao bào cái, các hạt sắc tố
không tập trung, nằm rải rác trong tế bào chất. Tế bào chất của giao tử cái
màu xanh đậm, giao tử đực màu xanh nhat hoặc hồng. Thể giao bào đực
thường to hơn, 2 đầu tròn hơn giao tử cái. Giao tử trưởng thành thường có
.
.
chiều dài lớn hơn đường kính hồng cầu, làm hồng cầu bị biến đổi hình dạng
[32], [36].
1.2.2 Hình thái Plasmodium vivax
1.2.2.1 Thể tư dưỡng (Trophozoit)
Thể tư dưỡng non P.vivax có đường kính 2- 3 µm [8] bằng khoảng 1/3
đường kính của hồng cầu. Vịng ngun sinh chất có 1 phần rìa dày và 1 rìa
mỏng hơn, nhiễm sắc thể nằm ở phía rìa mỏng tạo nên thể hình nhẫn. Thể tư
dưỡng già có dạng amip. Tế bào chất màu xanh và nhân nhiễm sắc thể có
màu đỏ. Có các hạt Schuffner có màu hồng phân bố đều trên màn hồng cầu.
Hồng cầu bị ký sinh có kích thước lớn hơn hồng cầu bình thường [32], [36].
1.2.2.2 Thể phân liệt (Schizont)
Thể phân liệt P.vivax xuất hiện sau 36 – 40 giờ và tồn tại từ 6 – 8 giờ,
có thể nhìn thấy trong phết máu ngoại biên. Thể phân liệt có hình trịn, tế bào
chất chiếm tồn bộ hồng cầu. Sắc tố màu nâu sẫm rải rác giữa tế bào chất.
Có 12 – 24 nhân, xếp ngẫu nhiên, khơng đều, có hình dạng “hoa hồng” đặc
trưng [36].
1.2.2.3 Thể giao bào (Gametocyte)
Thể giao bào P.vivax thường xuất hiện sau 4 ngày từ khi hình thành thể
tư dưỡng. Thể giao bào có dạng tròn, tế bào chất màu xanh lơ chiếm đầy
hồng cầu, hồng cầu bị ký sinh to hơn hồng cầu bình thường. Nhân là một
đốm tròn, nhỏ, bắt màu đỏ nằm trong tế bào chất, bên trong rải rác hạt sắc tố
[32], [36].
1.2.3 So sánh hình thái Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax và
các loài ký sinh trùng sốt rét khác trên phết máu ngoại biên
Phương pháp phết máu ngoại biên tìm ký sinh trùng sốt rét xác định loài ký
sinh trùng cũng như các giai đoạn ký sinh trùng thường dựa trên các đặc
điểm về kích thước, màu sắc, hình dạng của nhân và nguyên sinh chất ký
.
.
sinh trùng, sự hiện diện của các hạt đặc hiệu, sắc tố sốt rét và hình dạng của
hồng cầu bị ký sinh trùng ký sinh.
Bảng 1.1 So sánh hình thái các lồi ký sinh trùng sốt rét[8], [32], [36]
Đặc điểm
P.falciparum
Hình thái xuất
Tư dưỡng
hiện trong máu
non và giao
ngoại biên
bào
P.vivax
P.ovale
P.malaria
Tất cả các
Tất cả các
Tất cả các
thể
thể
thể
Kích thước
HC bị ký sinh
Kích thước
Kích thước
to hơn, có
bình thường,
to hơn, có
hình bầu
có các vết
các hạt
dục, có các
Maurer,
Schuffner
hạt
Schuffner
Vịng nhẫn
nhỏ, mảnh,
Tư
kích thước
dưỡng
1,5µm, có
non
nhiều thể
cùng ký sinh
Tư
trong 1 HC
dưỡng
Kích thước
bình
thường, có
các hạt
Ziemann
Vịng nhẫn
to, ngun
sinh chất
dày, kích
thước
2,5µm, 1 thể
ký sinh
Tương tự
vivax nhưng
ngun sinh
chất dày
hơn
Tương tự
vivax nhưng
kích thước
nhỏ hơn
trong 1 HC
Có dạng
Hình trứng
Có hình
amip, hình
hoặc dài, có
Tư
Ít thấy trong
dạng amip
trứng, hình
bờ đều, đơi
dưỡng
máu ngoại
khơng đồng
bầu dục có
khi giống
già
vi.
đều, nhìn rõ
răng cưa.
một dải
khơng bào.
Có hạt
băng, ngang
Schuffner
qua HC.
.
0.
Có hình
trịn, TB
Phân
Ít thấy trong
liệt
máu ngoại vi
chất chiếm
tồn HC, có
12-24 nhân,
xếp ngẫu
nhiên.
Từ 6-12
nhân các hạt
sắc tốt to,
tập trung ở
giữa TB
chất
Từ 6-12
nhân, xếp
hình hoa
cúc, hạt sắc
tố tập trung
ở giữa TB
chất
TB chất có
màu xanh
Có dạng
đậm, nhân
trịn, TB
Giao
nhỏ có màu
chất màu
Giống
Giống
bào cái
đỏ đậm và
xanh đậm,
P.vivax
P.vivax
các hạt sắc tố
nhân tròn
tập trung
nhỏ
Giống
Giống
P.vivax
P.vivax
xung quanh.
Giao
Thường to
bào
Giao
bào đực
hơn, 2 đầu
Có dạng
trịn hơn,
trịn, TB
màu xanh
chất màu
nhạt hoặc
xanh lơ
hồng, các hạt
chiếm đầy
sắc tố nằm
HC, nhân to
rải rác trong
hơn
TB chất
1.3
CHU TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT
Ký sinh trùng sốt rét sống kí sinh trong hồng cầu và được truyền bởi
muỗi. Ký sinh trùng sốt rét là những ký sinh trùng bắt buộc, sống trong tế
.
1.
bào và khơng có giai đoạn phát triển ngồi ký chủ. Chu trình sống phải qua
hai ký chủ, một là động vật có xương sống và một là cơn trùng.
Giai đoạn sinh sản vơ tính trong cơ thể người chia làm hai thời kỳ, thời
kỳ phát triển trong gan và trong hồng cầu. Muỗi Anopheles cái mang thoa
trùng sốt rét đốt người, thoa trùng từ nước bọt của muỗi truyền vào máu
ngoại biên của người. Thoa trùng theo dòng máu xâm nhập tế bào gan, trở
thành thể tư dưỡng rồi thể phân liệt. Thể phân liệt vỡ ra tạo thành mảnh
trùng, giải phóng vào hệ tuần hồn và xâm nhập hồng cầu. Thời gian để hoàn
tất 1 chu kỳ trong gan thay đổi tùy theo loài, từ 6 đến 15 ngày. Đối với
P.falciparum là 6 ngày và P.vivax khoảng 8 ngày.
Sau khi tiếp xúc với màng hồng cầu, mảnh trùng tiết ra một loại protein
giúp mảnh trùng xâm nhập vào hồng cầu. Sau đó chúng sinh sản vơ tính tạo
thành thể tư dưỡng, phân liệt làm vỡ hồng cầu giải phóng mảnh trùng, đại bộ
phận những ký sinh trùng này sẽ lại thâm nhập vào hồng cầu khác để tiếp tục
sinh sản vơ tính. Chu kỳ hồng cầu có thể kéo dài từ 36 đến 72 giờ. Số lượng
mảnh trùng cũng thay đổi tùy loài, từ 12 đến 32 mảnh trùng. Đối với
P.falciparum từ 36 – 48 giờ, 16 – 32 mảnh trùng. Đối với P.vivax khoảng 48
giờ với 16 – 24 mảnh trùng.
Nhưng một số mảnh ký sinh trùng trở thành những thể giao bào đực cái,
nếu muỗi hút những giao bào này, chúng sẽ phát triển chu kỳ hữu tính ở
trong dạ dày của muỗi. Giao bào đực và cái được muỗi hút vào dạ dày sẽ
phát triển thành những giao tử đực và cái, qua sinh sản hữu tính sinh ra thoa
trùng. Các thoa trùng đến tập trung trong tuyến nước bọt của muỗi là tiếp tục
truyền bệnh cho người khác. Chu kỳ hữu tính từ trong muỗi kéo dài 10 – 40
ngày tùy loài và nhiệt độ môi trường. Nhiệt độ dưới 16 oC hoặc trên 45oC
đều làm ngưng sự phát triển của ký sinh trùng trong muỗi.
.
2.
Hình 1.1 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét
1.4
PHƢƠNG PHÁP PHẾT MÁU NGOẠI BIÊN TÌM KÝ SINH
TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM FALCIPARUM VÀ PLASMODIUM
VIVAX
1.4.1 Kỹ thuật làm phết máu mỏng và giọt dày [47], [51], [46]
Bƣớc 1: Trộn đều ống máu trước khi tiến hành kéo lam.
Bƣớc 2: Chuẩn bị một phiến kính sạch.
Bƣớc 3: Dùng micropippet nhỏ 6 µl máu vào một đầu của lam kính. Dùng 1
góc nhọn của đầu lam khác đặt vào trung tâm giọt máu đánh theo hình xoắn
ốc từ trong ra ngồi từ 5 - 6 vòng để được giọt máu đặc có đường kính 1 –
1,2cm xoay góc lam kéo đi ngược vào trong rồi nhấc lam kéo lên.
Bƣớc 4: Dùng micropipette hút 2µl máu cho vào giữa lam sạch khác,
Bƣớc 5: Tiếp theo, đặt 1 cạnh lam kéo máu lên lam kính có giọt máu, thành
một góc 45o.
Bƣớc 6: Di chuyển lam kéo chạm vào giọt máu, chờ cho máu lan ra gần hết
cạnh của lam kéo.
.
3.
Bƣớc 7: Đẩy nhanh đều và nhẹ tay lam kéo máu về phía đầu kia của lam
kính chứa máu để tạo thành phết máu mỏng.
Bƣớc 8: Để lam máu khô tự nhiên, ít nhất trong 30 phút đối với phết máu
mỏng và qua đêm (12 giờ) đối với lam máu giọt dày, tránh ánh sáng và nhiệt
độ cao.
Hình 1.2 Kỹ thuật làm tiêu bản ký sinh trùng sốt rét [16]
1.4.2 Pha chế dung dịch đệm
1.4.2.1 Chức năng của dung dịch đệm trong kỹ thuật nhuộm Giemsa
Trong quy trình nhuộm Giemsa, dung dịch đệm dùng để pha thuốc nhuộm
Giemsa đậm đặc thành dung dịch Giemsa có nồng độ nhất định. Dung dịch
đệm giúp dung dịch Giemsa sau pha có giá trị pH ấn định, đảm bảo màu
nhuộm của phết máu đạt tiêu chuẩn, dễ dàng quan sát, nhận diện ký sinh
trùng sốt rét cũng như các loại tế bào máu. Độ pH của dung dịch đệm dùng
pha dung dịch Giemsa nhuộm có ảnh hưởng đến màu sắc của ký sinh trùng
sốt rét và tế bào máu. Nếu độ pH dung dịch đệm đạt chuẩn 7,2 thì trên lam
máu nhuộm Giemsa, ký sinh trùng sốt rét có nhân bắt màu đỏ, nguyên sinh
.
4.
chất bắt màu xanh da trời, sắc tố bắt màu nâu đen hoặc màu nâu ánh vàng;
hồng cầu bị ký sinh có màu hồng nhạt. Nếu độ pH dưới 7,2 thì màu sắc nhạt
hơn và trên 7,2 thì màu sắc đậm hơn; không bảo đảm được màu sắc chuẩn
khi soi phát hiện dưới kính hiển vi.[47]
1.4.2.2 Quy trình pha chế dung dịch đệm
Pha dung dịch đệm từ muối Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4); và
muối Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) và nước cất 2 lần.
Bƣớc 1: Cân 0,7 gam muối KH2PO4 và 1,0 gam muối Na2HPO4 bằng cân
điện tử chính xác.
Bƣớc 2: Cho 2 loại muối trên vào 2 cốc thủy tinh khác nhau. Cho vào mỗi
cốc 150 ml nước cất, dung đũa thủy tinh khuấy đều dung dịch.
Bƣớc 3: Cho 2 dung dịch vào 1 cốc khác, thêm nước cất đến khi đủ 1 lít
dung dịch.
Bƣớc 4: Dùng máy đo pH đo pH của dung dịch vừa pha.
Bƣớc 5: Pha dung dịch muối KH2PO4 2% bằng cách cho 2 gam muối
KH2PO4 vào 100ml nước cất, khuấy đều đến khi tan hoàn toàn. Tương tự với
Na2HPO4 để thu được dung dịch muối Na2HPO4 2%.
Bƣớc 6: Dùng 2 dung dịch muối KH2PO4 và Na2HPO4 để điều chỉnh pH.
Nếu dung dịch đệm đã pha có pH nhỏ hơn 7,2 cho thêm dung dịch Na 2HPO4
2%, ngược lại nếu dung dịch đệm đã pha có pH lớn hơn 7,2 thì cho thêm
dung dịch muối KH2PO4 2% cho đến khi dung đến khi dung dịch có độ pH
bằng 7,2 Pha dung dịch đệm pH từ muối Potassium dihydrogen phosphate
(KH2PO4); và muối Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4).
1.4.3 Quy trình nhuộm Giemsa
1.4.3.1 Nguyên tắc
Thuốc nhuộm Giemsa có thành phần bao gồm methylene blue, azure B
(trimethylthionine) và eosin (tetrabromofluorescein).
Nguyên tắc nhuộm: azure B và methylene blue sẽ liên kết với các phân
tử anion và eosin sẽ liên kết với các phân tử cation của protein. Vì vậy,
.
5.
những thành phần tế bào có tính acid sẽ bắt màu đỏ của eosin và thành phần
có tính kiềm sẽ bắt màu xanh của azure B và methylene blue.
Trên phết máu ngoại biên sau khi nhuộm Giemsa ký sinh trùng sốt rét
sẽ có nhân bắt màu đỏ, nguyên sinh chất bắt màu xanh da trời, nhân của bạch
cầu bắt màu xanh đậm, các hạt sắc tố bắt màu vàng nâu đến đen [47].
1.4.3.2 Quy trình nhuộm Giemsa [47], [61]
Bƣớc 1: Cố định lam máu mỏng bằng methanol tuyệt đối, không để lam máu
giọt dày tiếp xúc với methnol. Để khô tự nhiên.
Bƣớc 2: Xếp tiêu bản lên giá nhuộm, nhỏ dung dịch Giemsa phủ kín lên lam.
Để từ 5 - 10 phút đối với dung dịch Giemsa 10%, từ 45 - 60 phút đối với
dung dịch Giemsa 3%
Bƣớc 3: Rửa tiêu bản bằng nước sạch. Tránh đổ bỏ thuốc nhuộm.
Bƣớc 4: Xếp lam lên giá, để lam khô tự nhiên.
1.4.4 Đánh giá kết quả
1.4.4.1 Quan sát trên kính hiển vi
- Quan sát trên vật kính 10x để đánh giá tổng quan chất lượng của lam máu,
xác định vùng cần quan sát.
- Quan sát trên vật kính 100x, di chuyển bàn kính theo hình zic –zac để quan
sát lần lượt các quang trường. Kết luận tìm khơng thấy ký sinh trùng sốt rét
khi quan sát ít nhất 100 quang trường 10x. Nếu tìm thấy ký sinh trùng xác
định lồi ký sinh trùng và đếm mật độ ký sinh trùng ký sinh trùng [52], [60].
1.4.4.2 Đánh giá chất lượng phết máu
1.1
P
H
Ƣ
Ơ
Hình 1.3 Cách quanNsát tiêu bản tìm ký sinh trùng sốt rét [47]
G
.
