Phân loại và quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia Rhacophoridae) ở Việt Nam (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM LAN ANH

PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN
CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus
(AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

PHẠM LAN ANH

PHÂN LOẠI VÀ QUAN HỆ DI TRUYỀN
CÁC LOÀI THUỘC GIỐNG ẾCH CÂY Gracixalus
(AMPHIBIA: RHACOPHORIDAE) Ở VIỆT NAM
Ngành: Sinh thái học
Mã số: 8.42.01.20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS NGUYỄN THIÊN TẠO
2. PGS.TS HOÀNG VĂN NGỌC

THÁI NGUYÊN - 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi
dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên
nhiên Việt Nam) và PGS. TS. Hoàng Văn Ngọc (Trường Đại học Sư phạm, Đại
học Thái Nguyên). Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là hoàn
toàn trung thực. Kết quả nghiên cứu này khơng trùng với bất cứ cơng trình nào
đã được cơng bố trước đó.
Tơi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Thái Nguyên, ngày

tháng 6 năm 2020

Tác giả luận văn

Phạm Thị Lan Anh

i


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm n chân thành và tri ân sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn
Thiên Tạo (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng
nghệ Việt Nam) và PGS.TS Hồng Văn Ngọc (Trường Đại học sư phạm, Đại
học Thái Nguyên) đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận
văn này.
Em xin chân thành cảm n thầy cơ trong khoa Sinh học, Phịng Đào tạo

Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên
cứu và hoàn thành khóa học. Đặc biệt, em xin cảm n Phịng Bảo t n Thiên
nhiên (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) đã gi p đ , cung cấp tài liệu và các
trang thiết bị trong thời gian nghiên cứu tại đây.
Tôi xin cảm n Ban Lãnh đạo, các cán b ki m lâm của khu bảo t n
thiên nhiên Na Hang, Tuyên Quang đã cung cấp thông tin và tạo điều kiện
thuận lợi cho tơi trong q trình khảo sát thực địa.
Xin được t lịng biết n sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã
đ ng viên và ủng h tơi trong q trình thực hiện nghiên cứu này.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát tri n khoa học và công nghệ
Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.05-2019.334
Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020
Học viên

Phạm Lan Anh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... v
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH........................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài......................................................... 2

4. N i dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chƣơng 1: TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ................................. 4
1.1. Tổng quan về nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ......................................... 4
1.1.1. Lược sử nghiên cứu lư ng cư ở Việt Nam ................................................ 4
1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lư ng cư thu c giống Gracixalus ............... 5
Chƣơng 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN,
THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 9
2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................... 9
2.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 9
2.3. Phư ng pháp nghiên cứu .............................................................................. 9
2.3.1. Khảo sát thực địa ....................................................................................... 9
2.3.2. Trong phịng thí nghiệm .......................................................................... 11
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 15
3.1. Phân loại các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam ............................. 15
3.1.1. Đặc đi m hình thái các lồi trong giống Gracixalus ở Việt Nam ........... 16
3.2. Phân tích mối quan hệ di truy n các loài trong giống Gracixalus.............. 30

iii


3.2.1. Sự sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus ở Việt
Nam dựa trên đoạn gen 16S-rARN ................................................................... 30
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 37

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

16S-rRNA

: 16S ribosomal RNA

12S-rRNA

: 12S ribosomal RNA

cs

: C ng sự

DNA

: Axit đê ôxi ribônuclêic

ĐDSH

: Đa dạng sinh học

et al.

: Và tác giả khác

IEBR

: Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật

IUCN

: Tổ chức Bảo t n Thiên nhiên Quốc tế

KBTTN

: Khu Bảo t n thiên nhiên

LC

: Lư ng cư

LCBS

: Lư ng cư và Bò sát

PCR

: Phản ứng chuỗi polymerase

PL

: Phụ lục

TS

: Tiến sĩ

VNMN

: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

VQG

: Vườn quốc gia

♂

: Con đực

♀

: Con cái

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các m i sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của
giống Gracixalus ..................................................................... 14
Bảng 3.1. Thơng tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu ....................... 30
Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền 16S-rARN giữa các loài trong giống
Gracixalus ở Việt Nam .................................................................... 35

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. S đ đo mẫu ếch nhái khơng đi ................................................... 12
Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại BI phân tích từ trình tự gen ti th 16S
rRNA với đ dài 542 nucleotid các loài thu c giống Gracixalus
và các lồi ngồi nhóm. Các số nhánh trên và nhánh dưới lần

lượt là xác suất sau Bayes (BPP) và ML bootstrap (chỉ các giá
trị trên 70% được hi n thị). .............................................................. 34

vii


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Số lượng lồi lư ng cư (LC) ghi nhận phân bố ở Việt Nam tăng nhanh
trong các thập kỷ qua từ 82 loài vào năm 1996 [9] lên đến 186 loài vào năm
2009 và cho tới nay có khoảng 290 lồi được ghi nhận. Kết hợp phư ng pháp so
sánh hình thái, phân tích âm sinh học và dữ liệu sinh học phân tử đã phát hiện
nhiều loài mới cho khoa học, đặc biệt là các nhóm lồi có đặc đi m hình thái
tư ng đ ng và nhóm các lồi phức hợp ẩn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Chỉ
riêng họ Ếch cây (Rhacophoridae), trong khoảng 10 năm trở lại đây đã có h n
30 loài mới được phát hiện và ghi nhận phân bố mới ở Việt Nam.
Giống Gracixalus trước đây được coi là m t phân giống của giống
Aquixalus (Delorme và c ng sự, 2005). Tuy nhiên, Li và c ng sự, 2008 và 2009
dựa trên các bằng chứng về di truyền phân tử đã khẳng định Gracixalus là m t
giống riêng biệt. Hiện nay, có 17 lồi được ghi nhận phân bố ở My-an-ma, Lào,
Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam, trong đó ở Việt nam đã ghi nhận 11 lồi.
Đáng ch ý, có 10 lồi mới được phát hiện từ năm 2010 cho đến nay (Rowley và
c ng sự, 2011, 2014; 2020 Mo và c ng sự, 2013; Nguyễn và c ng sự, 2013;
Matsui và c ng sự, 2015, 2017; Zeng và c ng sự, 2017; Chen và c ng sự, 2018;
Wang và c ng sự, 2018; Yu và c ng sự, 2019). Điều này cho thấy mức đ đa
dạng cao về thành phần các loài thu c giống Gracixalus ở Việt Nam. Thêm
vào đó, các kết quả phân tích về mối quan hệ di truyền và phát sinh lồi
thu c nhóm G. jinxiuensis cho thấy vấn đề phân loại học vẫn chưa được giải
quyết và cần thiết có những nghiên cứu cụ th h n (Matsui và c ng sự, 2017,
Chen và c ng sự, 2018).

Mặt khác, các lồi thu c giống Ếch cây Gracixalus đa số có kích thước
nh , màu sắc trầm tối phù hợp với lối sống gần mặt đất của ch ng, lưng màu
nâu, xám hay xám nâu có m t vệt hình chữ X màu nâu nhạt ở lưng; có m t sọc
đen chạy từ mũi đến mắt và từ sau ổ mắt qua màng nhĩ về phía vai, bụng
1


thường có màu trắng đục và xuất hiện nhiều hạt, tay khơng có màng b i và đặc
biệt trong giống ếch này có lồi phát ra âm thanh như tiếng chim hót. Do vậy,
ch ng được các nhà nghiên cứu quan tâm và tìm hi u. Ứng dụng phư ng pháp
nghiên cứu sinh học phân tử là m t công cụ hữu hiệu hỗ trợ công việc phân loại
và phân tích mối quan hệ di truyền giữa các lồi, các nhóm lồi có sự tư ng
đ ng về hình thái, các lồi mới được phát hiện và mơ tả gần đây dựa trên dữ
liệu hình thái và phân tử.
Vì những lý do nêu trên, học viên tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân loại và
quan hệ di truyền các loài thuộc giống Ếch cây Gracixalus (Amphibia:
Rhacophoridae) ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm cập nhật thông tin về thành phần loài, phân loại,
phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài
thu c giống Ếch cây Gracixalus ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa
học cập nhật về phân loại học dựa trên các dữ liệu hình thái học và sinh học
phân tử của các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam, đ ng thời các đặc
đi m sinh học sinh thái từ các dẫn liệu ghi chép, quan sát ngồi thực địa. Mơ tả
hình thái, biện luận mối quan hệ di truyền và cung cấp m t số đặc đi m sinh
học sinh thái về sinh cảnh sống, phân bố của các loài.
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung số liệu góp
phần xây dựng c sở khoa học cho công tác quản lý, xây dựng kế hoạch bảo

t n các loài đ ng vật đặc hữu và có phân bố hẹp. Đ ng thời bổ sung tư liệu và
mẫu vật cho Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam.
4. Nội dung nghiên cứu
Đ thực hiện được các mục tiêu trên, đề tài dự kiến tri n khai các n i
dung nghiên cứu cụ th như sau:
2


- N i dung 1: Nghiên cứu đặc đi m hình thái các lồi trong giống
Gracixalus ở Việt Nam.
+ Cập nhật danh sách các loài trong giống Gracixalus ở Việt Nam.
+ Mơ tả, phân tích đặc đi m hình thái các loài trong giống Gracixalus ở
Việt Nam và cập nhật thơng tin về phân bố của lồi.
- N i dung 2: Nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các loài trong giống
Gracixalus ở Việt Nam.
+ So sánh sai khác di truyền giữa các loài trong giống Gracixalus dựa
vào kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S-rARN thu c hệ gen ty th .
+ Xây dựng cây quan hệ di truyền giữa các lồi dựa trên giải trình tự
mẫu vật Gracixalus thu thập ở Việt Nam và các trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen.

3


Chƣơng 1
TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về nghiên cứu lƣỡng cƣ ở Việt Nam
1.1.1. Lược sử nghiên cứu lưỡng cư ở Việt Nam
Theo Nguyen et al. (2009) [30], nghiên cứu về LC ở Việt Nam có lịch sử
khá lâu đời nhưng bắt đầu phát tri n mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ XIX,

giữa và cuối thế kỷ XX và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ XXI.
Trước năm 1945, các nghiên cứu về LC ở Việt Nam chủ yếu do các nhà
khoa học nước ngoài thực hiện như: Tirant (1885), Boulenger (1903), Smith
(1921, 1924, 1932)... [2] và hàng loạt cơng trình phát hiện lồi mới được cơng
bố vào nửa đầu thế kỷ XX nhưng đáng ch ý là các cơng trình của Anderson
L.G (1942), Bourret (1937, 1942) mang tựa đề Les Batraciens de l’Indochine
(1942) [10]. Cuốn sách đã mơ tả 171 lồi và phân lồi LC ở vùng Đơng Dư ng
(Việt Nam, Lào, Campuchia), trong đó có 78 lồi ghi nhận ở Việt Nam. Bên
cạnh đó cuốn sách đã cơng bố danh sách các địa đi m nghiên cứu trên tồn
vùng Đơng Dư ng, tổng quan lịch sử nghiên cứu LC ở vùng này; cơng trình
cịn đưa ra các đặc đi m hình thái dùng trong phân loại LC, các ghi ch đặc
đi m sinh học, phân bố theo các vùng địa lý, phân bố theo đ cao, định loại và
mô tả các loài. Mẫu vật và tư liệu mà tác giả phân tích được mang về từ vùng
Viễn Đơng, bán đảo Đơng Dư ng, vịnh Bengal, Đông Ấn, Java và được lưu trữ
tại Bảo tàng Tự nhiên Paris. Đây có th coi là tài liệu đầy đủ nhất về LC trong
khu vực vào những năm giữa thế kỷ XX. Tuy nhiên, thời gian này công tác
nghiên cứu LC mới chỉ dừng ở mức thu thập mẫu vật, thống kê, phân loại và
lập danh sách loài.
Từ năm 1945 đến năm 1954, Việt Nam tiến hành cu c kháng chiến
chống thực dân Pháp, nên việc nghiên cứu LC bị gián đoạn. Trong giai đoạn
này hầu như khơng có cơng trình nghiên cứu LC nào ở Việt Nam.

4


Sau hịa bình lặp lại ở miền Bắc Việt Nam (1954-1975) các nghiên cứu
về thành phần loài LC mới được tăng cường bởi các tác giả Việt Nam. Có th
k tên m t số nhà nghiên cứu tiêu bi u: Đào Văn Tiến, Trần Kiên, Nguyễn Văn
Sáng, H Thu Cúc (1956-1976), Đào Văn Tiến và Lê Vũ Khôi (1956),... và các
nghiên cứu r ng khắp từ cả hai miền Bắc và Nam. Trong báo cáo của Ủy ban

Khoa học và kỹ thuật Nhà nước, 1981 về LCBS miền Bắc Việt Nam (19561976) đã ghi nhận 69 loài LC dựa trên mẫu vật thu tại 11 địa đi m nghiên cứu
thu c miền Bắc [8].
Từ năm 1975 đến nay, nổi bật là các nghiên cứu m t số các tác giả có th
k đến như: Năm 1977, Đào Văn Tiến đã tổng hợp và cơng bố khóa định loại
87 lồi LC trong bài báo về “Định loại LC Việt Nam” [7]. Năm 1981, Trần
Kiên và cs. đã thống kê thành phần loài đ ng vật toàn miền Bắc từ năm 1956
đến năm 1976 in trong “Kết quả điều tra c bản đ ng vật miền Bắc Việt Nam”,
trong đó có 69 lồi LC [1]. Tiếp đó, Inger et al. (1999) đã tiến hành điều tra,
đánh giá và ghi nhận 100 loài LC phân bố ở Việt Nam, tăng h n 20% so với
nghiên cứu của Bourret (1942). Năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và H Thu Cúc
xuất bản chuyên khảo Danh lục Bị sát và LC Việt Nam ghi nhận 82 lồi LC
[4]. Đến năm 2005 số lượng loài tăng lên gấp đôi (162) được Nguyễn Văn Sáng
và cs. thống kê trong cuốn Danh lục ếch nhái và Bò sát Việt Nam [5]. Cuốn
Danh lục gần đây nhất của Nguyen et al. (2009) ghi nhận tổng số 177 loài LC ở
Việt Nam [30]. Năm 2014 có 222 lồi LC được ghi nhận phân bố, tăng thêm
20,27% so với năm 2009.
1.1.2. Lược sử nghiên cứu các loài lưỡng cư thuộc giống Gracixalus
Họ ếch cây Rhacophoridae được đánh giá là m t trong những họ có số
lượng và thành phần lồi đa dạng trong lớp LC. Hiện nay trên thế giới họ
Rhacophoridae có khoảng h n 430 loài, thu c 17 giống. Chúng phân bố chủ
yếu ở Châu Phi, Trung Quốc, Ấn Đ , các nước Đông Nam Á, Nhật Bản và Đài
Loan [30].

5


Năm 2014, Nguyễn và c ng sự đã ghi nhận ở Việt Nam có sự phân bố của
khoảng 70 lồi trong họ ếch cây, đến nay là 82 loài thu c 12 giống Chirixalus,
Feihyla, Gracixalus, Kurixalus, Liuixalus, Nyctixalus, Philautus, Polypedates,
Raorchestes, Rhacophorus, Theloderma, và Zhangixalus trong đó giống

Gracixalus ghi nhận được 11 loài, chiếm khoảng 13,4% tổng số loài.
Theo Delorme, Dubois, Grosjean và Ohler, 2005 Gracixalus thu c phân
giống Aquixalus của họ Ếch cây Rhacophoridae. Mặt khác, bằng cách sử dụng
phân loại cổ xưa Pyron và Wiens, 2011 đã đặt Gracixalus thu c Philautus
(Sensuricto) và xác nhận m t cách đ n thuần.
Giống Ếch cây - Gracixalux Delorme, M., A. Dubois, S. Grosjean, and A.
Ohler, 2005 hiện ghi nhận tổng số 17 loài trên thế giới và ở Việt Nam đã ghi
nhận 11 loài (Frost 2019), g m Gracixalus ananjevae (Matsui và Orlov, 2004);
G. gracilipes (Bourret, 1937); G. jinxiuensis (Hu, 1978); G. lumarius (Rowley,
Lê, Đậu, Hoàng và Cao, 2014); G. nonggangensis (Mo, Zhang, Luo, Zhou và
Chen, 2013); G. quangi (Rowley, Dau, Nguyễn, Cao và Nguyễn, 2011); G.
quyeti (Nguyễn, Hendrix, Böhme, Vũ và Ziegler, 2008; G. sapaensis (Matsui,
Ohler, Eto và Nguyễn, 2017); G. supercornutus (Orlov, Ho và Nguyễn, 2004);
Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020; và G. yunnanensis
(Yu, Li, Wang, Rao, Wu và Yang, 2019)
Kurixalus ananjevae (Matsui & Orlov, 2004) lần đầu được Matsui và
Orlov mô tả với tên khoa học là Chirixalus ananjevae dựa trên hai mẫu chuẩn
thu tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam vào năm 2004 [26]. Theo Nguyễn Văn Sáng và
cs. (2005), C. ananjevae có tên phổ thơng là Nhái cây ananjeva và là lồi ghi
nhận mới cho khoa học [5]. Đây là lồi có đặc đi m hình thái rất giống với lồi
C. eiffingeri và C. idiootocus (bây giờ thu c giống Kurixalus) và cho tới nay loài
mới chỉ được ghi nhận tại tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam [26]. Năm 2014, Rowley et al.
sử dụng kết quả phân tích sinh học phân tử đã chuy n loài sang giống
Gracilxalus với tên gọi G. ananjevae [36].

6


Ứng dụng kỹ thuật của sinh học phân tử đã gi p các nghiên cứu hệ thống
và tu chỉnh vị trí phân loại của các họ, các giống hoặc chia tách các lồi phức

tạp m t cách chính xác h n. Frost et al. (2006) đã xây dựng cây quan hệ di
truyền của hầu hết các họ ếch nhái trên tồn thế giới, cơng trình này đã tu chỉnh
vị trí phân loại của rất nhiều họ và giống lư ng cư, trong đó có m t số giống
phân bố ở Việt Nam như các loài thu c giống Paa chuy n sang giống
Nanorana, các loài thu c giống Chirixalus chuy n sang giống Chiromantis, các
loài thu c giống Rana chuy n sang giống Huia, Hylarana và Sylvirana,...[16].
Về quan hệ di truyền, các nghiên cứu về các loài thu c giống Gracixalux
còn khá hạn chế với m t số quan đi m khác nhau. M t số cơng trình cơng bố
có liên quan như:
Năm 2008, Dubois và c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử cho sự
liên kết của Gracixalus với Aquixalus mặc dù sau đó Li, Che, Bain, Zhao, và
Zhang, 2008 trên c sở b dữ liệu phân tử lớn h n, đã cung cấp bằng chứng
phân tử rằng Aquixalus (Sensuricto) nên được đặt trong Kurixalus và
Gracixalus nằm cách xa Kurixalus, Gracixalus được xác định là 1 chi.
Năm 2013, Li et al đã phân tích mối quan hệ di truyền của m t số loài của
giống Gracixalux ở Trung Quốc và m t số tỉnh thu c Việt Nam, xác nhận mối
quan hệ họ hàng của Gracixalus và Philautus.
Cũng năm 2011 nhóm Rowley, Nguyen, Dau, Nguyen, và Cao đã đề xuất
trên c sở bằng chứng phân tử rằng hai nhánh chính có th được phân định: (1)
nhánh này có Gracixalus jinxiuensis và m t số lồi chưa được đặt tên trước
đây, (2) m t nhánh khác bao g m ít nhất Gracixalus quyeti, Gracixalus
gracilipes, Gracixalus supercornutus và Gracixalus quangi. Năm 2014,
Rowley cùng c ng sự đã cung cấp bằng chứng phân tử s b cho các mối quan
hệ trong chi.

7


Matsui et al. (2017), đã phân tích về mối quan hệ của quần th loài
Gracixalux ở miền Bắc Việt Nam dựa trên phân tích gen ty th và phát hiện và

mơ tả m t lồi mới Gracixalus sapaensis.
Ngồi ra, gần đây m t số nhà nghiên cứu dựa trên sự khác biệt về di
truyền phân tử và hình thái đã phát hiện và mơ tả các lồi mới cho khoa học
thu c giống Gracixalus g m: Chen et al năm 2018 phát hiện, mơ tả lồi G.
tianlineneis; Zeng et al., 2018 phát hiện, mơ tả lồi G. guangdongensis; Yu et al
năm 2019 phát hiện, mơ tả lồi G. yunnanensis; và G. triengi được Rowley et al
phát hiện và mô tả năm 2020.
Năm 2015, 65 Rowley cùng c ng sự nghiên cứu đặc đi m sinh học, sinh
thái, sinh sản, trứng, phơi, ấu trùng và tiếng kêu của ba lồi ếch Gracixalus
gracilipes, G. quangi, G. supercornutus. Kết quả nghiên cứu cung cấp các thông
tin về sinh học, sinh thái, sinh sản, trứng, phơi, ấu trùng và tiếng kêu như chim
hót của ba loài này.
Chen, Bei, Liao, Zhou và Mo, 2018 đã cung cấp m t cây ML phân tử của
loài Gracixalus và cung cấp m t bản đ sinh thái của loài Gracixalus .
Năm 2020, Nguyễn, Dư ng, Lưu và Poyarkov cung cấp m t bảng các
đặc đi m hình thái cho loài này.

8


Chƣơng 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, THIẾT BỊ VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm cập nhật thơng tin về thành phần lồi, phân loại,
phân bố, m t số đặc đi m sinh học sinh thái và quan hệ di truyền của các loài
thu c giống Ếch cây Graxcixalus ở Việt Nam.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các loài lư ng cư thu c giống Ếch cây
Graxcixalus ở Việt Nam.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát thực địa
* Chuẩn bị dụng cụ đi thực địa: Bản đ , GPS, túi nilong, c n, xi lanh,
khay, bút kim, giấy can, b đ mổ, lọ đựng mẫu vật, sổ ghi nhật ký, máy ảnh,
đèn pin (c lớn, c nh ).
* Địa điểm thu mẫu:.
- Sử dụng mẫu được thu thập tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.
- Ngồi ra, chúng tơi tiến hành khảo sát thực địa trong khoảng thời gian 20
ngày từ tháng 5 đến tháng 7 năm 2019, vào thời gian này các loài Lư ng cư ra
hoạt đ ng, kiếm ăn và sinh sản. Nghiên cứu đã thực hiện các đợt khảo sát m t
số địa đi m thu c khu vực miền núi phía Bắc.
 Đợt 1 từ ngày 15 đến ngày 21 tháng 6 năm 2019 tại Khu bảo t n thiên
nhiên Na Hang, Tuyên Quang.
 Đợt 2 từ ngày 22 tháng 6 đến ngày 25 tháng 6 năm 2019 tại Yên Bái.
* Thời gian thu mẫu: Đ thu thập mẫu và các số liệu hình thái có liên
quan, ch ng tơi tiến hành khảo sát thực địa cả ban ngày và ban đêm. Thường
tập trung ven các suối nh , vũng nước, ao nh , vùng đầm lầy, hang hốc, n i phủ
nhiều lá mục ven các đường mòn trong rừng.
9


 Ban ngày: Từ 8h00 đến 11h00, khảo sát các tuyến đường và chụp ảnh
sinh cảnh, quan sát các nhân tố tác đ ng tới sinh cảnh và loài.
 Ban đêm: Các loài Lư ng cư thường hoạt đ ng và kiếm ăn nên ch ng tôi
tiến hành khảo sát từ 19h00 đến 1h00 ngày hôm sau đ thu thập mẫu vật
và đo đếm các chỉ số hình thái và sinh thái liên quan.
* Thu thập số liệu về đặc điểm sinh thái: Thông tin về sinh cảnh sống, n i
thu thập mẫu và điều kiện môi trường (nhiệt đ , đ ẩm) cũng sẽ được ghi nhận
tại địa đi m thu mẫu đ phục vụ việc phân tích đặc đi m phân bố của từng loài.
* Phương pháp thu mẫu: Chủ yếu thu thập bằng tay.

* Xử lý mẫu vật: Mẫu LC được thu đ trong túi nilong, sau khi chụp ảnh
m t số mẫu được trả về tự nhiên, mẫu vật đại diện cho các loài ở các địa đi m
khảo sát được giữ lại làm tiêu bản nghiên cứu.
* Làm tiêu bản:
Xử lý và bảo quản mẫu vật theo tiêu chuẩn của các bảo tàng trong nước
và trên thế giới qua tham khảo tài liệu của Simmon (2002) [39] và Ngô Đắc
Chứng & Nguyễn Quảng Trường (2015).
- Gây mê: Mẫu vật được gây mê bằng miếng bông thấm etyl acetate. Thu
bổ sung mẫu c hay mẫu gan đ phân tích DNA và lưu trữ trong c n 95% và
bảo quản trong tủ lạnh.
- Cố định mẫu: Việc cố định mẫu cần đảm bảo mẫu có hình dạng dễ phân
tích hoặc dễ quan sát sau này. Sắp xếp mẫu vật theo hình dạng mong muốn, sau
đó phủ nilong m ng lên toàn khay cố định mẫu, ngâm trong c n 80-90% trong
vòng 4-10 giờ. Đối với LC c lớn cần tiêm c n 100% vào bụng và c của con vật
đ tránh thối h ng mẫu.
- Ký hiệu mẫu: Cần đeo nhãn kí hiệu vào cho mẫu vật. Nhãn và chỉ bu c
không thấm nước, chữ viết trên nhãn không bị tan trong c n. Khi đeo nhãn cần
bu c chỉ quanh khớp giữa xư ng đùi và ống chân tránh bị tu t.
10


- Bảo quản mẫu vật: Đ bảo quản mẫu vật lâu cần chuy n sang ngâm c n
70%. Các bình đựng mẫu phải có nắp kín đ tránh bay h i c n và làm khô mẫu.
Mẫu vật phải được bảo quản trong phòng đủ điều kiện (nhiệt đ và đ ẩm thấp,
tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời, có khay và giá đựng).
2.3.2. Trong phịng thí nghiệm
a) Phân tích đặc điểm hình thái:
Mẫu trưởng thành: Các chỉ tiêu về kích thước theo tài liệu của Orlov et
al. 2012, được đo bằng thước kẹp điện tử Alpha-Tool với đ n vị đo nh nhất là
0,01 mm. Ngoài giá trị nh nhất (min) và giá trị lớn nhất (max), giá trị trung

bình và đ lệch chuẩn (TB ± SD) với số cá th tối thi u n > 2 cũng được thống
kê trong bảng các chỉ tiêu hình thái. Tổng số 26 chỉ tiêu hình thái được đo đếm
và phân tích, bao g m:
1

SVL = Chiều dài mút mõm-lỗ 14 AG = Khoảng cách từ nách đến
huyệt

2

bẹn

HW = Chiều r ng đầu (đo ở 15 FLL = Dài chi trước (từ mút
đi m r ng nhất của đầu)

3

ngón tay III đến nách)

HL = Dài đầu (đo từ mút mõm 16 FFL = Chiều dài ngón tay I
đến gờ sau của xư ng hàm)

4

HD = Chiều cao đầu (đo ở đi m 17 TFL = Chiều dài ngón tay III
cao nhất của đầu, thường ở phía
trước ổ mắt)

5

UEW = R ng mí mắt (phần r ng 18 FTD = Đường kính lớn nhất của
đĩa bám ngón tay III

nhất của mí mắt trên)
6

ED = Đường kính ổ mắt (theo 19 HLL = Dài chi sau (từ mút ngón
chân IV đến bẹn)

chiều ngang)
7

TD = Đường kính lớn nhất của 20 FL = Chiều dài đùi (từ hậu môn
màng nhĩ

đến đầu gối)

11


8

IFE = Khoảng cách giữa góc trước 21 TL = Chiều dài ống chân (từ đầu
hai ổ mắt

9

gối đến cổ chân)

IBE = Khoảng cách giữa góc sau 22 FOL = Chiều dài bàn chân (từ

hai ổ mắt

cổ chân đến mút ngón chân IV)

10 ESL = Dài mũi (khoảng cách từ 23 FTL = Chiều dài ngón chân I
mút mõm tới góc trước ổ mắt)
11 TED = Khoảng cách từ rìa trước 24 FFTL = Chiều dài ngón chân IV
màng nhĩ đến góc sau ổ mắt
12 IND = Khoảng cách giữa hai lỗ 25 HTD = Đường kính lớn nhất
mũi

của đĩa bám ngón chân IV.

13 END = Khoảng cách từ góc 26 MTT= chiều dài của khớp
trước ổ mắt tới lỗ mũi
Công thức màng b i được xác định dựa theo tài liệu của Ohler &
Delorme (2006)Error! Reference source not found. Bắt đầu từ m t ngón
hân (ngay ở gốc đĩa bám) thì là 0 (hồn tồn); ½ thì là nửa của đốt; đốt 1 là đốt
sát gốc cổ chân (tính từ trong ra ngồi).

Hình 2.1. Sơ đồ đo mẫu ếch nhái không đuôi

12


(theo Hồng Xn Quang và cs. 2012, có bổ sung)

Định loại mẫu vật: So sánh hình thái của mẫu vật thu được với các mẫu đã
được định tên đang lưu giữ ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN) và
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR). Định loại tên loài theo các tài

liệu của Bourret (1942) , Inger et al. (1999) , Taylor (1962), Orlov et al. (2012)
và m t số tài liệu khác có liên quan. Tên khoa học và phổ thơng của lồi theo
Nguyen et al. (2009) [30] và m t số tài liệu mới công bố gần đây.
b) Phân tích sinh học phân tử: Tiến hành phân tích trình tự DNA m t
số đoạn gen thu c hệ gen ty th do các gen này di truyền theo dịng mẹ, có tốc
đ đ t biến cao h n nhiều lần so với gen trong nhân. Vì vậy, việc sử dụng các
gen này thích hợp đ giải quyết các n i dung nghiên cứu của đề tài. Đoạn gen
thu c hệ gen ty th là 16S rRNA được lựa chọn đ giải mã. Nhiều cơng trình
nghiên cứu trước đây cũng đã sử dụng gen này do có tỉ lệ tiến hóa thích hợp
cho nghiên cứu ở bậc giống, loài và quần th . Mẫu c hoặc gan của các loài ếch
nhái được thu thập và bảo quản trong c n 70% ở 4oC. Các mẫu mô sẽ được
chiết tách dựa trên quy trình được trình bày trong Kuraishi et al. (2013) và có
điều chỉnh theo Nguyen et al. (2015), sử dụng b kít chiết tách của Qiagen.
DNA sau khi chiết tách sẽ được sử dụng đ nhân đoạn bằng phư ng pháp phản
ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction-PCR). Tổng th tích mỗi
phản ứng PCR là 20µl, bao g m 10µl mastermix, 7µl nước, 0,5µl mỗi chiều
m i, 2-5µl DNA khn, tùy thu c vào n ng đ DNA. Điều kiện phản ứng
PCR: 950C ở 5’ với DreamTaq mastermix; 35 chu kỳ phản ứng ở 95 oC trong
30s, 560C trong 30-45s, 72oC trong 30s; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 7
ph t. Các sản phẩm PCR sẽ được điện di bằng gel agarose 1,5%. Sản phẩm đã
được nhân đoạn thành công sẽ được tinh sạch đ loại b tạp chất sinh ra từ
phản ứng PCR sử dụng b kít GeneJETTM PCR Purification (Thermo Fisher
Scientific) và gửi giải trình tự hai chiều ở FirstBase (Ma-lai-xi-a). Sản phẩm
tinh sạch sau đó được gửi tới cơng ty Macrogen đ giải trình tự. Cuối cùng, kết

13


quả giải trình tự được xác thực bằng cơng cụ BLAST trên Ngân hàng gen. Tất
cả các cơng đoạn phịng thí nghiệm sẽ được thực hiện tại phịng thí nghiệm của

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, n i có đầy đủ các thiết bị nghiên cứu hiện đại
phục vụ các nghiên cứu về hệ thống phân loại học và di truyền quần th .
Bảng 2.1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền
của giống Kurixalus
Tên mồi

Trình tự mồi

Tài liệu tham khảo

L2204

5'-AAA CTG GGA TTA GAT ACC CCA CTA T-3'

Nguyen et al. (2014)

tVal-L

5’- CGTACCTTTTGCATCATGGTC -3’

Nguyen et al. (2014)

H3056

5’-CTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG -3’

Nguyen et al. (2014)

Chúng tôi sẽ xác định các mức đ của các đ n vị di truyền bằng cách: (1)
ước tính sự sai khác về mặt di truyền của các trình tự thu được giữa các đ n

vị/quần th được coi là có sai khác; (2) xây dựng cây phát sinh chủng loại.
Khoảng cách di truyền giữa các đ n vị phân loại được tính tốn bằng cách so
sánh các số lượng khác biệt cố định và các đ t biến chung, số lượng nucleotid
thay thế trung bình cũng như số lượng nucleotid thay thế thực tại từng vị trí.
Cây phát sinh chủng loại sẽ được xây dựng các phân tích hợp lý tối đa
(Maximum Likelihood) có trong phần mềm Kakusan 4. Mơ hình tiến hóa của
các trình tự sẽ được lựa chọn dựa trên tiêu chí thơng tin Akaike (AIC) bằng
cách so sánh các mơ hình phân tích Kakusan. Phân tích mơ ph ng phi thơng số
sẽ được sử dụng đ cung cấp đ tin cậy về thống kê cho các nhánh trong cây
phát sinh chủng loại sử dụng phư ng pháp hợp lý tối đa . Các giả thuyết về cây
phát sinh lồi cũng được tính tốn sử dụng phư ng pháp Bayes có trong phần
mềm MrBayes v3.2.
c) Phân tích thống kê:
Sử dụng phần mềm PAST Statistics đ phân tích thống kê và so sánh
m t số chỉ số tư ng đ ng và sai khác về đăc đi m hình thái giữa các quần th
và các loài trong cùng giống Gracixalus.

14


Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Phân loại các loài thuộc giống Gracixalus ở Việt Nam
- Qua phân tích hình thái của 102 mẫu vật từ b mẫu vật được thu thập
được qua các đợt thực địa đang lưu giữ ở Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,
thống kê được 10 loài loài lư ng cư thu c giống Gracixalus g m:
1. Gracixalus ananjevae (Matsui and Orlov, 2004)
2. Gracixalus gracilipes (Bourret, 1937)
3. Gracixalus jinxiuensis (Hu, 1978)
4. Gracixalus lumarius Rowley, Le, Dau, Hoang, and Cao, 2014

5. Gracixalus nonggangensis Mo, Zhang, Luo, Zhou, and Chen, 2013
6. Gracixalus quangi Rowley, Dau, Nguyen, Cao, and Nguyen, 2011
7. Gracixalus quyeti (Nguyen, Hendrix, Böhme, Vu, and Ziegler, 2008)
8. Gracixalus sapaensis Matsui, Ohler, Eto, and Nguyen, 2017
9. Gracixalus supercornutus (Orlov, Ho, and Nguyen, 2004)
10. Gracixalus trieng Rowley, Le, Hoang, Cao, and Dau, 2020
11. Gracixalus yunnanensis Yu, Li, Wang, Rao, Wu, and Yang, 2019
- Đặc đi m chung: Loài nhái cây nh cho đến trung bình, dài thân từ 1032 mm. Màng nhĩ rõ. Thiếu răng trên khẩu cái. Mũi có dạng chuỳ đơi khi dẹt.
Thường khơng có răng lá mía. Con đực thường có túi kêu. Ngón chân và ngón
tay đều có đĩa khá lớn, đĩa chân nh h n đĩa tay. Ngón tay tự do hoặc chỉ có
màng b i ở gốc ngón, ngón chân có màng b i phát tri n. Chân sau dài h n thân
nhiều. Chai sinh dục có hoặc khơng. Da thân và các chi nhám nổi mụn hoặc
khơng, bụng có mụn phẳng. C t sống ngắn. Đốt ngón ngồi cùng đ n hoặc chẻ
nhánh. Trên lưng thường có hoạ tiết sẫm hình chữ X. Các loài của giống này
thường gặp trên các bụi cây c thấp trong rừng ẩm nhiệt đới, trên núi nhiều khi
rất xa nước. Ch ng thường đẻ trứng trực tiếp trên lá cây, trứng phát tri n thẳng

15


trong lớp v nhầy trong. Trứng thường lớn, không sắc tố, số lượng trứng trong
m t ổ không nhiều, chỉ từ 6-20 quả.
3.1.1. Đặc điểm hình thái các lồi trong giống Gracixalus ở Việt Nam
1. Nhái cây Gracixalus ananjevae (Matsui and Orlov, 2004)
Mô tả: - Đầu: Đầu dài gần bằng r ng, mõm nhọn, vùng má gần như
thẳng đứng, lõm. Màng nhĩ rõ và rất gần mắt. Khơng có răng lá mía. Mặt lưng
có những nốt sần nh màu trắng.
- Chi: Ngón tay hồn tồn tự do. Ngón I ngắn h n ngón II, khơng có
màng giữa ngón I và II, giữa ngón II và III có màng ở gốc, đốt ngồi cùng của
ngón III tự do, ở cạnh ngồi của ngón IV màng kéo riềm đến đốt ngồi cùng

cịn cạnh trong thì riềm kéo đến hai đốt ngồi. Các đầu ngón tay và ngón chân
có đĩa bám. Đĩa ngón chân nh h n đĩa ngón tay. Chân mảnh, khớp cổ bàn h i
vượt mắt.
- Mầu sắc: Toàn thân xanh xám. Vùng thái dư ng phía dưới nếp trên
màng nhĩ mầu nâu sẫm với vết trắng từ dưới mắt đến vai. Gờ mõm nâu kéo dài
đến đầu mõm bởi m t đường mảnh nâu sẫm. Nhiều nốt nâu trắng nh khơng cố
định trên lưng. Có những chấm trắng ở hơng cũng như những hạt nổi ở vùng
hậu mơn. Phần ngồi của màng chân đen. Dưới bụng trắng. Con ngư i nâu. Da
nhẵn với m t vài hạt nh trên đầu và lưng. Có nếp da từ mắt đến vai. Họng
nhẵn. Ngực, bụng và mặt dưới đùi nổi hạt.
- Kích thước: Dài thân con cái 43 mm; con đực 32 (Matsui và Orlov
2004) [26].
Giá trị sử dụng: Khoa học, ngu n gen hiếm
2. Nhái cây chân mảnh Gracixalus gracilipes (Bourret, 1937)
Mô tả:
Đầu: Đầu dài bằng r ng. Mõm nhọn có hình tam giác h i vượt quá hàm.
Gờ mõm rõ, vùng má gần như thẳng đứng, lõm. Mũi gần đầu mõm h n mắt.
Gian mũi bằng 2/3 gian mắt. Gian mắt gấp đơi mí mắt trên. Màng nhĩ rõ, gần

16