Phát hiện đột biến dna ty thể ở bệnh nhân hội chứng melas bằng kỹ thuật giải trình t

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT TỒN VĂN
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ BỆNH NH N HỘI
CH NG ME AS B NG K THU T GIẢI TR NH T

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: CN. DƯ NG BÍCH TR M
ThS.
THÁI KHƯ NG

Tp. Hồ Ch Minh th n

5n m

9


DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHI N C U ĐỀ TÀI
T

STT
1

g

g i

hT

2

Th i h

3

g

hV

g

i

g

hủ hi

i

T

g

Y Si h h

h

hủ hi

i

T

g

Y Si h h

h

T

g

Y Si h h

h

h


MỤC ỤC
TV
.......................................................................................................................... 1
h
g 1: T
QU

T
U ....................................................................................... 2
1.1. T g
h i h g
S .............................................................................. 2
1.1.1. Sơ
cv
c
E S ............................................................................. 2
1.1.2. Tr ệu c
và c ẩ đoá .................................................................................. 3
1.1.3. Đ u trị ................................................................................................................ 4
1.2.
ge
hể
ặ iể di
ủ h ge
hể ............................................... 5
1.2.1. Hệ e ty t ể ....................................................................................................... 5
1.2.2. Đặc đ ểm d truy của ệ e ty t ể .................................................................. 6
1.2.3. Tí c ất k ô đồ
ất và tốc đ đ t b ế của ty t ể ................................... 7
1.2.4. Các bệ do đ t b ế e ty t ể .......................................................................... 8
1.3.
h
i hh
h
h hi
i ge
h h h i h g

MELAS ................................................................................................................................. 9
1.3.1. Kỹ t uật PCR ...................................................................................................... 9
1.3.2. Kỹ t uật ả trì tự tự đ
........................................................................... 11
h
g : VẬT
U – P ƯƠ
P ÁP ........................................................................... 13
2.1.
i ợ g ghi
............................................................................................... 13
2.2. Thi ị – ụ g ụ .................................................................................................... 13
2.3.
ó h .................................................................................................................... 13
2.3.1. Hóa c ất tác c ết DN b e ( DN ) từ máu ............................................ 13
2.3.2. Hóa c ất PCR ................................................................................................... 13
2.3.3. Hóa c ất dù tro đ ệ d trê e agarose .................................................. 13
2.3.4. Hóa c ất dù c o p ả
t
sạc sả p ẩm PCR ................................... 14
2.3.5. Hóa c ất dù c o p ả
PCR Cyc e seque c ...................................... 14
2.3.6. Hóa c ất dù c o q trì tủa sả p ẩm PCR Cyc e seque c ................ 14
2.4. Ph
g h ............................................................................................................. 14
2.4.1. T u ậ vật ệu
ê c u............................................................................ 14
2.4.2. Tác c ết DN từ mẫu máu ............................................................................. 14
2.4.3. T ết kế mồ c o p ả
PCR ....................................................................... 15

2.4.4. P ả
PCR .................................................................................................. 15
2.4.5. Đ ệ d ............................................................................................................... 16
2.4.6. T
sạc sả p ẩm PCR .................................................................................. 16
2.4.7. Cycle Sequencing PCR ..................................................................................... 16
2.4.8. Tủa sả p ẩm cyc e seque c
PCR ............................................................... 17
2.4.9. Giải trình tự và phân tích kết quả ..................................................................... 17
h
g :
T QU –
UẬ .................................................................................. 18
3.1.
ặ iể
g ủ
h h ........................................................................... 18
3.2.
h hi
g ............................................................................... 18
3.3.
iể
i ................................................................................................ 19
3.3.1. Kết quả k ểm tra các t ô số t uyết của mồ .............................................. 19
3.3.2. Kết quả k ểm tra tí đặc ệu của mồ b
Pr mer-Blast ............................. 20
3.4.
h
g P R ............................................................................................. 21
3.5.

gi i
h
h hi
i ge DNA
hể
h h
h i h g
MELAS ............................................................................................................................... 22
h
g V:
T UẬ –
................................................................................ 25
4.1.
.................................................................................................................... 25
4.2.
i
ghị .................................................................................................................. 25
T
UT
O ...................................................................................................... 26


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
g 1.1: iể hi
g ủ h i h g
S. ....................................... 3
g 1.2: Ti
h ẩ hẩ
h i h g
S .......................................... 4

g 2.1: T h 3 ặ
i dụ g h
gP R ể h
ge
mtDNA ............................................................................................................... 15
g 2.2: Th h hầ hó h P R ................................................................. 16
g 2.3: h
g
h hi P R .................................................................... 16
g 2.4: Th h hầ
h h h
g i h ạ h
hẩ P R ........... 16
g 3.1: ặ iể
g ủ
h h .................................................... 18
g 3.2:
i h ạ h ủ
..................................................................... 19
g 3.3:
iể
h g
h
ủ
id g h h
g
PCR .................................................................................................................... 19


DANH SÁCH H NH ẢNH

h 1.1:
ge
hể. ................................................................................................ 6
h 1.2: S di
he h
―
h
h i‖
. ................................. 7
h 1.3: g
ủ h
g P R. ...................................................... 11
h 1.4: S
g
gi i
h
g i di
. ........................... 12
Hình 2.1: Thang DNA 1kb plus. ................................................................................. 14
h 3.1:
Pi eST ặ
i 1. ........................................................ 21
h 3.2:
Pi eST ặ
i 2. ............................................................ 21
h 3.3:
i di iể
hẩ P R h
g ge ủ
DNA ty hể.. ................................................................................................................ 22

h 3.4:
gi i
h
.......................................................................... 23

DANH MỤC CHỮ VIẾT T T
Cyt C

Cytochrome C

ddNTP

dideoxynucleotide

DNA

Deoxyribonucleic acid

FADH2

Flavin adenine dinucleotide

MELAS

Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes

mtDNA

Mitochondrial DNA

NAD+/NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

PCR

Polymerase chain reaction

ROS

Reactive oxygen species


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHI N C U
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
1. Thơng tin chung:
-T

i: Ph

gi i

h

.

-

ã

:

hi

- hủ hi

i:

.

g

+

i

hể

h

T

.

h h

i

S

h ại:

g

h

0989850374.

Email:


ThS.

Th i h

g. i

ị

-

h ại: 0948847479.

h

i :

( h ,T

): T

g

Y Si h h

Ph

.
- Thời gi

h

hi : 25/05/2018 – 25/06/2019.

. Mục tiêu: Thi
i

g dụ g
h h

h i h

h gi i

h

g MELAS ại Vi

hể ể h

hi

.

3. Nội dun ch nh:
- T h hi ge
- Thi

i

g ại i ủ

ặ

id g h

hể i

h i h

- Thi

i

- Ph

i

h

g

g ời h .

gP R h

ge

ụ

i

ủ

S.

P R, i h ạ h

h

h h

hẩ

P R

gi i

h

ge .

.

4. Kết quả ch nh đạt được ( h
 V

ạ (

h ,

ợ g, h

ạ , i h -xã h i,
g h:

h

g dụ g, ...):

S/ S/

, ThS,

S…):

Không


g

ạ

h

g

ớ

(

i

,

ạ

h, ă

x

n): Không
 S h/ h

g

 P e , i i h
hữ
h

ã ă g

h (T

ể

hữ
;

h(
ã
hữ

h/ h
;

, g

g

h ạ g
, hời gi
): Không

5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài man lại:

h, ă

x

): Không

i ới gi i h
h

i ới

h
e

ă g
gi i




ghi

ợ

h ể gi , gi
 Phạ

i

ị
/

nghiê
ại h

g

h ể gi

h g ời

hẩ ,

ị h

ị h ể gi ): Không
hỉ

g dụ g

i gi g

ợ

ghi

,
hh i h

(

ị

hd

ại h ): c
hẩ

(T

dụ g
h

ợ
di

g MELAS.

ó hể
h

g dụ g
g gi g dạ

dụ g

h
h h

gi


Đ T VẤN ĐỀ
i h

g

S (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokeh i h

like episodes)

g ã gi

ợ di
ặ

g

i

ã

,h

h ờ gx
h

i

.

hầ

hi

, ă g
h ó

id

hh

i h

gi

g

.

ẻe

i

d

hi

h

hi

hời gi

h

h

i
iể

h

i i

ạ h,

g ủ

hể,

g ủ

i

ạ

h h ờ g, ó hể h i

i.

g

h

g

h

d

g

ại

i

3243 , 3251 ,

T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho
tRNALeu,
5

i

i

i

13513 ,

12770

e xid ed

e ủ

13514
h

hợ

ge MT-ND5 mã hóa cho

, 583

ge MT-TF mã hóa cho

tRNAPhe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MT-TC
mã hóa cho tRNACys. T
S, i

g ó,

he

i

i

i

T3271 x

iể

ge

tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, R
i

,

S ểx
h. T

ị h g

g
h

h

xé
ợ

ghi

hi

h

i

ghi

g
h h

h h
hẩ

i h, gầ

h i h

g

g h
h

h h .

i

h

ó

hi

g
h

di

ELAS.

1

ủ
h
g

h h

S
ghi

ầ

h

h

ó,

hể ể h
h

h

h

h

i
h

h gi i

g

.
h

g MELAS.

ị

hă

ị hi

ó, x

g dụ g
h i h

h di
hh ,

h

ã hó

h i h

g h

g h

hó hă ,

, i

i

g .

g,

g h

g ó h

h h ớ
h

g

g

S ó hể g

h ghi

iể hi

g

hi

i

hầ

ới
g

hẩ

S
h

h

ạ

h

gh i h

g 7,5%.

ạ

h ờ g

h hi

hi

h ặ

i

Tại h h h
h

h

80%

hác nhau COXIII, ND1, ND5 h ặ ge

h ,

h h

iể hi

h

hi

h giới ã ó hi

hi , d

i h

3243

h h

ợ

ó hể gó
gi

h


Chươn

: TỔNG QUAN TÀI IỆU

Tổn quan về hội ch n MELAS

1.1.

cv

1.1.1.
i h

c

MELAS

g

i e e i de )

S (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokeh i h

g ã gi

ợ di
ặ

g

i

ã

,h

1984. Tỷ
. Phầ

ớ

S

ợ

g

h

hi

ầ

.

hầ

h i h

, ă g
h ó

id

hh

i h

.

h

ớ

h

h h

iể hi

d

hi

i

ă

g

d

g

i

d
i

ạ h,

h

h

g ủ

hể,

ầ

ầ

i

ă

h

i

h

h

3243 ,

g

g

g

S

h h

).

h

g ủ h i h

ủ h i h

hể (

ại

i i

g 0,2 : 100000 ại

di

3243 trên gen mã hóa cho tRNALeu ủ
h

h

h

1990

hi
ợ

S he

2 – 40[2].

gi

g

g

i

i

ại ị
h

g

3251 , T3271C, T3291C,

A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu,

i

G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone

xid ed

e ủ

h

hợ

,

583

MT-TF mã hóa cho tRNAPhe,

ge

G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MT-TC mã hóa cho
tRNACys. T
i

g ó,

he

i

i

i

3243

T3271 x

iể

h

ge

h

tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, R
T
h

hể

ă

h h dạ g ă g

i

g

x
ới h

ầ

ă g
ă g

ợ g

S ó hể h g
h
hi

g

ợi d
x

ợ

ới

h h ớ

ă g ủ
h

i

hi
, i

i

ã

.

i

g[2].

2

hó

x hó .

g i

ạ

hh

g

ủ
hữ g
ei ,

h h ờ g iể hi
g

.T

) ó hể

h

i

i g… h

ã hó

g gi

ạ h ầ

ạ h ầ
ạ

h

hể

ó, hữ g g ời ó
h

S,

g [2], [3],[5].
hẩ

h h

(he e

i [4].

S ó hể g

ể h ể hó

g

g h

g

ạ

ợ g. hữ g

dễ d g h hi
ủ dạ g h g

h

g

COXIII, ND1, ND5 hoặ ge

g

gi

gh i h

g 7,5%.

h ặ

ợ g h

S

80%

h

dụ g x

dụ g x

hi

hi

i

h
hi

g

g i

hi ,

x

iể hi
g

hỉ h

g

h hợ

ới
h

h

h


1.1.2. Tr ệu c

và c ẩ đoá

i h

g

ă g

,
h

g

S h ờ g
g

ụ g,
g

hủ, gi

e

ợ

g

gd

dị h ã

i,
h h

hẩ
ủ d

h i

ệ

âm sà

ờ g hợ

h , iể

h

ờ g,

S

h

g

i i

[2],[5].
Bả

1.1: B ểu

của

c

Biểu hiện
-

E

S[2].
Tần số

Gi
t quỵ
Trí tu sa sút
ng kinh
Nhiễm toan acid lactic
Sợi
rách nham nh (Raffed red fibers,
RRFs) trên sinh thi
Xu t huy t
M t thị l c
Nh
ầu tái phát
Khi m thính
Y
B nh lý thần kinh ngoại biên
M t kh ă g h c t p
Suy gi m trí nhớ
Nơn m a tái phát

Tầm vóc ng n
Vơi hóa hạch n n
ng kinh rung gi
Th i u
Th
i ý th c
g i h g
h h ờng
Bu n rầu, phi n mu n
, ă h ă
R i loạn tinh thần
i h
ờng (type 1 và 2)
Thối hóa thị giác
Thối hóa võng mạc
Li
t ngồi ti n triển
M
g
ới các k ă g
B h
i
B h ờng d n truy n tim
B nh th n
B nh bạch bi n

3

g

hiễ

hó h .
,

i

≥ 90%

7% – 89%

50% – 74%

25% – 49%

< 25%


Ti
i

h ẩ

h ẩ

h ẩ :

Y

i

g

g ủ h i h

h ẩ d

g

x

Bả

i

g

g

S hi

x

d

(1992)

i

2

h ẩ d

(2012).

1.2: T êu c uẩ c ẩ đoá

c

E

S[2]

Bộ tiêu chuẩn do Hirano và cộng sự đề
Bộ tiêu chuẩn do Yatsuga và cộng sự
xuất (1992)
đề xuất (2012)
B h h
ợc chẩ
c h i B h h
ợc chẩ
c h i
ch ng MELAS n u th a 3 tiêu chí sau:
ch ng MELAS n u th a ít nh t 2 tiêu chí
loại A và 2 tiêu chí loại B.
- Gi
t quỵ ớc 40 tu i.
- Co gi t hoặc m t trí nhớ.
1. Tiêu chí loại A:
- Nhiễm toan lactate hoặc sợi
- Nh

ầu và nôn m a.
rách nham nh .
ng kinh.
Và ít nh t 2 trong s các tiêu chí kèm
- Li t n
g ời.
he
:
- B nh mù m t.
- Tâm lý phát triể
h h ờng.
- T
h
g h
ú p tính trên
- Nh
ầu tái phát.
ã d
t quỵ
- Nôn m a tái phát.
2. Tiêu chí loại B:
- N g
lactate huy
g h ặc
dịch não tủy cao.
- Sợi
rách nham nh d a
vào sinh thi
.
- B h ờng DNA ty thể lien quan

h i ch ng MELAS.
hữ g
g ủ h i h g
S
h h
h
dạ g, h
ạ

h g

h

ủ

h

g h .
hể, ặ

i

i

ủ h i h
h hầ

i ị h h i .V
i

ạ

ạ h h g h

, h
g õ

g

S

i h, i

h

hh

g

hi

gx

hi

hời h

g

hi

ờ g hợ

h

ó

g.

1.1.3. Đ u trị
i

h

h ờ g i

ụ

hữ g hầ

ủ

h

g x hó

x

hể ị
ã

ợ

g

g. V h ,

g x hó

ó i
g

ã

hh

ị

ị

g hời gi
ợ

g

dụ g, h

h

hh

ỳ i

iể d

Với i
hể ị
h

h

ó

dụ g h

g

h

ợ

g.

h h

h ờ g

g

hời gi

h
ợ

hỉ

ụ hể.
g

.

4

i

ụ hể. Vi

h

h ,

ợ he dõi
z

h

ợ

h
ị
i

h

h h cơng.

h
h h

g h

e,
ó h h

h h ờ g diễ
i

i

ị he
id, i

g

g i

i
g ủ

i

h
ợ


h
hạ , h

ó ghi

iể

g hữ g i

g,

g

g

h

g h

h ỗi h

i ò hữ

i

hi

ã

ợ
i

h

Re e

h

g

, hi

h

h ặ
g

h

S

i

ị

xide.

ó

g h
h

h

ợ

g

S:

ợ

dụ g

i

h

g h ể

gi

h

g h
Q10.

ă g h

ạ

g ã

i

S RT1 h
h

ó hể

iể

dã

g

ợ

dụ g ể i

ịh i

ă g.
i ới

gi

h

ghi

ghi
ị

ớ

g

hể

ó

g i

hi

ide ã

g i

i i

h ă g i h

e

gd i

h

i hi

i ị

h ạ

ạ h ó, ị

i

ă

m.3350T>C.

ạ h ã d gi

g i

i

h

hụ

h

h ih i h
i

ể

L- gi i e ó hể ó g
g

h.

g

d ới

h h

i

Ri f
h h

h

hữ g

Q10 ó g
hợ

ợ

h

ờ g hợ

h h

dụ g thành công

S, h

h

g h

g h

i

g ãi[2].

Hệ en ty thể và đặc điểm di truyền của hệ en ty thể

1.2.

1.2.1. Hệ e ty t ể
T

hể

hể g ời

hó

ó h ge
ại

dạ g

h 2 h
h h hầ

R
ầ

i g, h

ới ge

ạ h ò g é , ó
i

hi

e, 22 h
g

h

R

hợ

ủ

iể

ị ủ

ị h

hợ

hợ V ( TP

hó

i ge
g

h ,

ợ dị h

ẽ

i ,
ới

ới h ge
g

hi

ã

ei
g

ị

h ,

hị

h

h , h ge

ã hó .

tRNAPro (gen MT-TP)
i

h

ã

13 h

ei

h

hợ (
ợ

ã hó

ã hó

i

h 3 iể

ại ủ
ó

-ubiquinone
ị ủ

h ỗi h h
ợ

ợ

ã

h ể

hể.
ặ

xe

h e).

37 ge

(Hình 1.1)[6].

hỉ

(ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3
h

,g

h ể

h ỗi h h

ã hó 7 iể

ND1-ND6 và ND4L
oxidoreductase), Cyt b

h h ớ 16.569

h .

hé

ã h ỗi ặ g ( )

h

h g

ã hó

giữ gen tRNAPhe (gen MT-TK) và

-

g h

hể h

g
hi

ã hó

ớ

h

ó

ã ủ h ge

h ỗi h ( ), h

5

iể

i ò

hể, h
h i ầ

g
e

g
h

ủa quá trình sao


chép. Hai gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA
ợ
h
hể h

giữ

ge

g hợ

ei
hể

hé

g

e z

e h

ã

dị h

ợ

hi

ã

ợ e d
h

ợ

i

hiể

h i ầ

g h h. Ph

g
h

R

.

R

g

h h

ại d h ge

ểh h h h

i

g

h

i

hể ại

e e h

ủ

ge

ầ

hi

hể.
h

ã ủ

g ó

oper

ei .
ới h ge

iể

i

h
g

ge
hi

R

ã hó

h
i ge

R

h h hi

ã

ge

hể

hi

ã

ó

16S, R

hể h

ó hi

h

h .

12S

g h h ủ

g

ã hó . Q

,

-lo

g i g

iể

g

gi

ợ g

g ới

i h ẩ [4].

Hình 1.1: Hệ e ty t ể.
g ời ó hể h
ó

ợ gd

g

.S
nh

g
h

h

h
gi

ă g
iể

ủ

h

ợ

h

ầ

ủ
g i h ,

g

ầ

dụ g ă g

g

h ạ

h ạ

g. S

ợ g

iể

ghi

gặ

.S

1.2.2. Đặc đ ểm d truy
S di

h
hi

g
g

ới h g g

ă g hi

i h

ợ g ủ

g

g h
h

g hời ỳ ầ
h

ại

gd ờ g

i

ớ

ủ

i h

h
ă g.

của ệ e ty t ể
ge

di
hể

ợ di

6

h .
he dò g

, g ời

i

g

ge

hể h

h

h h

hụ ữ
h e

, h

i

he .

h di

g

h h

h

ạ h hỉ h
g

mtD

g hỉ

g

g i ủ

ợ gi i h h

g 100.000 h

g

h 100 – 1500 h

i

,

g ủ

g

g ó

ặ
ủ

hợ

g ời

i h

h

h hủ

g

iể gen này

hể,

ờ g i h dụ
õ

ới ó hể

g

h i ủ
i h

g hi

h ờ g hỉ

ợ h

h

g

g.
i ới

ge

g h
h ạ

chúng tuân theo
h

g h ge

hú g x

hể ại h g

ị h ó hữ g iể di

ợ

g

h ,

hể

g

i ,
ủ ge

ặ

iể

i

giữ

hi ò

i

i

hữ g

hú g.

g

i

h

g ó

g ời

h e

h

1.2.3. Tí

1.2: Sự d truy

c ất k ơ

đồ

h
ầ
ạ h

i

ó iể hi

i

h

ầ

h .
x

hi

g

i

h
h ầ

h
g g

― ú h

h i‖, he

ó ầ

h

g ể

g h

h

t eo t uyết “ ắt t ắt cổ c a ” ở mtDN .

ất và tốc đ đ t b ế của ty t ể

7

ạ gd

i

(Hình 1.2)[6].

Hì

.

h

hể

g ge

g ời

h
h

g h

ge

e),

h

ó hể

ới ầ

h h

(

g

h

ợ g i
ủ

h

ó

h di

ạ h

h

hể

h h gi

i

iể di

g

he

i. V dụ,
h e

h .

hiễ

g

h i g ời

g ời

g ủ

g ỷ

iể hi
h

i h

i g ặ

i

,

ó hể i h
h ,

h

ủ

ới


ỗi
h

ó hể h

g

g

ợ g

h g g

.V

ó hể ó

ợ g i
gi

h

hi

i

h h ờ g

h h

g

, hi x

g

h

g h

ợ

i , hi

( ee

g i

).

g

h

ủ

giữ

hể

(Homoplasmy)[10].
S

i
he e

,

ợ g

g

hể

h

hể h

i

g ó

ó hi

i

hể

h

hữ

ge

hể g

i h
T

do đ t b ế
h

h h ờ g

g

h

hể ó
hầ

ủ

g
h

ủ

hể ị

g

h

ợ x

ị h

i

ới

h ),

d .

g i

,

i

, ã

ghi

x
hại.

.

hi

i

hủ

ge
g

hi

h
h

ợ g

h

ă g
h

i ò

h

i

g ời, g i

i
g ầ

h .

hi

hể g

hợ

ă g

ợ g

h

dạ g, ó hữ g i
ạ g hi

h

ghi

g

h

g

ă g

ă g ủ
ới

h

e h h ge
g h .

g

hủ

hi
hể

g h ,d h
g

h ,

ă g

hi

g ủ

ới

ợ g

h

i h

hể.

hể[6].
ă g

g ó hể

hh

ge

h hi

g h

g ó h

g
ge

h

x

hể

ợ

i

e ty t ể

hể

h

i

h

h ể hó

1.2.4. Các bệ

h

hữ g hiể

ới

xú

h.

g ể ó hể i

ei hi

hi
i

.

10 – 20 ầ

hể dễ i

ị h

g ủ

g
i

ới

, h ge

h ờ gg

, hầ

h
ủ

g

ẽx

ghi

i

ầ ( h g i

h

ủ

dạ g he e

di
i

dạ g

g h

g

h

ó
ge

ại

g ời

h ạ g

ợ g

ị h
h

id ủ

ợ

g

h

i
dị

ới

,h
.

xe

d

h

g i
ợ g

g

hể.

hi

iể hi
h , h ờ g

h

h

phosphoryl hóa oxy hóa.
S

h i h

i

ủ

h

hể hị

h

hi

h

hể

hi

ợ g di

h

g

g,

i

hi h i ủ
g h
― ú h

i iể h h
g

,

ợ g
h i‖.

8

hi
ợ

hi

i

iể hi

ge g

g g ỡ g,
h

g
h

hể


ạ g h i h g

g h ,

g

ủ

h. Tỷ

iể hi
hữ g i
h

i i h hó

ợ g i

ới

g

ờ g hi

h ẽ ị

,
ỷ

hi

ợ

ủ
h

ặ

h ,

g

i

ge

hể

hợ

h
T

i

ó hi

x

ghi

ị h.

g i

.

, ị

h

ủ

h

ủ

,h

h

h

g

g h

ạ
ủ

i
hiể

, ã óh

hẩ

i

hữ g

i

h
hể, ặ

g ỡ g iể

i

ị

― ú h
g ủ

i

di

ỷ

h

g ời

g
g

hi

g h

ă

1988,

ạ di

d
g

ge

ó ã

h

h

h

ợ x
i

ei

hể. hữ g ghi

g

g

g ủ
i

g h
d

i
i

ă g ặ

h

h.

ầ
250

hể g
h

h

h di

g h ,

ó hi

g h ỗi h h

g h ờ g
g

i h

g ỡ g iể hi

i

he

g ó

h ặ

hể

g i
h

h

i

ủ
.T

.

h

ợ

h

óh g g

dạ g h

h

ị h

h ạ g

1.3.

h

h h

ẽ h

g ủ

h

g ủ
h

i

i hi h

i

ó hể g

ờ g ị h . Th

g

iể hi

ợ g

hể;

ới

hể ủ

ị h

hi

ị g ỡ g

g

i

g

h

i

ỗi

i ỷ

h i‖

i
g

hi

h

ầ

ó i

iể hi

g 60% – 90% ge

,

h.

i .

g ớ

h g

i

h

i

d

ủ

hh

ge

h

,

g h

hể

i

ă g ủ

giữ

ị g ỡ g

h

h

i

h ỷ

ge

g ỡ g iể hi

ại

gi

ờ g hợ

h

i
h

di

h

g ại

i

hể[4],[6].

C c k thu t sinh học ph n t ph t hiện đột iến en

ệnh nh n hội

ch n MELAS
Vi

x
g h

MELAS
hẩ

,

h

ị h h h x
g

i

g hời gi
,

h gi

g

ó

g

h ủ mtDNA

ghĩ

ủi

g ể h

di

h

h h

h hân
, h

hi ,

MELAS và gia

h h .

1.3.1. Kỹ t uật PCR
h

PCR (polymerase chain reaction e

e)

g hữ g

h

ợ

9

g
dụ g

g hợ

d

g ãi h

h
g ĩ h

hờ


Si h h

h

giới hi

ầ

g ã h

. Ph
ầ

i

gi i h

g

i h

g

e

h

ạ h

(P i e ) h
ầ

i .

ủ

ới. Ph

ới

ạ h h

hữ g

gi i

ạ

i i

ạ

ẽ hỉ

g hợ

h

i

h

h( e

i i

ạ

ặ (
hd

i i

ợ

e

e

g hợ
ợ

di h

ợi

ể d
ới

hd
h

h

e

40 h

ợ g
ỳ

ủ

i.

ạ h ủ

40o

g

ặ

70oC trong
h

ợi

h ại.
hi

h

e

g i

hú

e xú

g hợ

he

giữ h i

95oC

.

i
h

94oC

h

):

ủ

g i

ủ

dụ g ó
g

ợ

h h ớ
.

ợi

hi

h é d i

ạ

h

ể
hầ

ã

ỗi ầ

ại

i.

ỳg
i

ạ h

h ó ủ

h d

g ới

i

i

g ới

g ới h i ầ

ợ hạ x

30 gi

ụ i ,

hữ g

ặ

ị i

é d i ( xe i

é d i

g

g P R (Hình 1.3):

ợi

ầ

1986

i ểh h h h

giữ h i

i

hé

ủ

ă g

ặ

): Ph

1 hú , h

ợ

e hi h ạ

di

ặ
ể

e i g): hi

g hợ h
72o

ă g

id i

h h

hầ

ạ

e ẽ
i

h
i

ạ

ị g 30 gi
,

ó h

1 hú ,

ị ẻ gã

hi

g

ạ

ỳ ủ

1985;
ă

e

ạ

i h

ă

1993.

ợ h h h h d
h i

g

i h

ầ

e
g

,

h

dS i g
ă

P R: T

i

e.

ă gg

h 51

g h

g ị g 30 gi

-

ầ
ó h

P R ã

h

-

i

ạ h h
g h

e

d

ại
ủ

g hợ

-

g h

h

ớ

ẽ

ủ ầ

ớ .
ẽ

ợ
108

10

ặ

i ặ

ại hi

h
ới

he
ợ g

ầ

h , he
ầ [7].


Hình 1.3: N uyê tắc cơ bả của p ả

PCR: (1) B ế tí

dà , (4): Hồ t à
1.3.2. Kỹ t uật
V

ả trì

ă
i i

g

ại

h

d

h 4
h

3’ ủ

gi

ại dd TP.
hỉ ầ

ớ

d ã h

hd

g ghi
.

hó

hờ
i

,

ạ h i

i

di

ợ

ide ó hể
hi

ạ h i

g
i

di
h

iể
ể

h

ỉ h
g h

g

h h h

g
i

h
g

ầ

ẽ ghi h
g

i

ợ

h h hủ

ạ h
h

i

di ẽ h
ẽ

h

ỉ h
ạ

h

ge . Phầ

e

i

h
g
h 1.4).

di
h

ớ

ó.
ạ h

g

ỉ h
(

i

ỗi hi ó

ờ g

dị g ủ
ủ

11

di,

g,

hầ

di. Phầ

i

h i

ạ h i
,

g,

g

ại h h
g

h

h g h

h i hầ

hi

g
e h

h

hi

dd TP
g

g

i

ủ
i

h

ge h

g ghi h
T

, h

S ge

ụ i .

hầ

g ủ

g h

g h i

g

hữ g

h ạ
di i

h

ủ

ide

g h

h ỳ h

g gi i

ới ge

h

ó hể h

h.

h

ủ

h

di i

h h

he

h hh

h ỳ h

g gi i
h g

g h

h

g4

h ỳ h

ó i

ạ

d

di

h ể

h

gi i

, h

ẽ h

e ide

iể

h

hó g xạ

ỗi hi ó

ạ

c u kỳ đầu t ê .

tự tự đ

1986, e

g hó ,

, (2) Bắt cặp, (3) Kéo

ẽ

ợ

g iể
g

g ới
d

g i

.


di
h

h
ghi

ỳ h

ó hể hạ

Hình 1.4: Sơ đồ

ó hể hạ
hi

u

h

ợ

ầ

.

ả trì

12

tự tự đ

đ ệ d mao quả .

g ời


Chươn II: V T IỆU – PHƯ NG PHÁP
Đối tượn n hiên c u

2.1.

ghi
h

g

i

h h

S ại

h i

hi

 Vấ đ y đ c tro
B h h
h
h
2.2.
-

h h
g1

ợ

hẩ

ghi gờ

h g 06/2018

h i

h g 01/2019.

ê c u:

ớ

hi h

id g ủ

ghi

i h g i

ủ

ụ

14

g ghi

.
i

h ghi

gi
i

ợ gi i h h

ợ g ó hể

ợ g ghi

h i h

gi

ụ

ghi

ợ giữ

hỉ

.
dụ g

.

Thiết ị – Dụn cụ
Máy NanoDrop2000
gi i

-

i

-

h

3500

h

-

i

hi

, h

g h

Genetic Analyzer.
-

di (T
h

di

e

)
giữ

-It® Imager

ủ hã g UVP.

e d f

Mastercycler.

h

-

g

i

di

GenomeLab GeXP
2.3.

Hóa chất

2.3.1. Hóa c ất tác c ết DNA b

e ( DNA) từ máu

GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo
Scirntific) g

ei

e ,d

g dị h

Buffer WB I và Wash Buffer II), d

gi i (

g dị h h

i Solution), d
h

g dị h

(W h

( lution Buffer).

2.3.2. Hóa c ất PCR
Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio).
iP R h
2.3.3. Hóa c ất dù
g

e dạ g
g dị h T

g ge

tro
(P

ủ

i

đ ệ d trê

e a arose

eg ).

0,5X.

Ethidium bromide 10mg/ml (Sigma).
g dị h

di g d e (Sig

).

Thang DNA 1kb plus (0,1 µg/µl) (Thermo Scientific).

13

h i h

g

S.


Hình 2.1: Thang DNA 1kb plus (Thermo Scientific).
2.3.4. Hóa c ất dù

c op ả

t

ExoSAP- T® P R P d

e

sạc sả p ẩm PCR
(The

S ie ifi ) g

xonuclease I

và Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP).
2.3.5. Hóa c ất dù

c op ả

PCR Cyc e seque c

BigDye® Terminators V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).
Sequencing buffer 5X.

i x i (h ặ
2.3.6. Hóa c ất dù
-

c o quá trì

tủa sả p ẩm PCR Cycle sequencing

EDTA-Ethylendiaminetetraacetic

-

Ethanol 70%

Acid 0,5M, pH 8,0 (Promega)

-

Hi-Di formamide

-

Ethanol 100%

2.4.

Phươn ph p

2.4.1. T u
V

h

i g ợ ).

h

ậ vật ệu
i

g
ại ủ

ê c u

ghi
g

g ại i.
T

4o

1,5

g/
ó

ó

g ại i

g
ữ

i

g ủ ạ h

g

ợ x
e2

g

.

-80oC.

2.4.2. Tác c ết DNA từ mẫu máu
ợ

h hi

g GeneJET Whole Blood Genomic

DNA Purification Mini Kit ủ hã g Thermo Scirntific he h ớ g d

14

ủ

h


x

, h
ợ

ợ 200 μ d g dị h h
g

2000 (The

.
).

2.4.3. T ết kế mồ c o p ả
S dụ g hầ

i h ạ h ủ g

h

hi

ợ

g dị h g

h hi

PCR

CLC Main Workbench v5.5 hi
hầ

GenBank NC_012920.1).
g P R

h

ge

h
ó

3 ặ

MT-ND1 ủ

gen MT-TL1, MT-ND5, MT-TK

h

iể

-20oC.

ữ

h

g

ẵ .

hể ( ã

dụ g h

hé

hầ

O ig

ợ

h

g

ặ

hi

ủ

i.

h

ze 3.1

h

h h (S P) ầ

g ó hi

x

h

ợ gS P( i ge

xỉ h

g hời ạ
ặ hi

Te h

gie ,

Bả

2.1: Trì

ủ

g

h

i ẽ

ợ

)

ầ .S
g hợ

hi

ặ

hi

h
ại

tự 3 cặp mồ s d
i

mtDNA-F1
mtDNA-R1

mtDNA-F2
mtDNA-R2
mtDNA-F3
mtDNA-R3

3
2.4.4. P ả
i

ợ

g

hi iể

g

T(

hi
i

ác thông
eg

ed

p ả

PCR để

â bả các gen mtDNA

T

h

V
h

i (5’ – 3’)

TACTTCACAAAGCGCCTTCC
TGCAGAGTGGGGTTTTGCAG
GTCATTCTCATAATCGCCCA
TATTGATTGTTAGCGGTGTG
CTACGGCGGACTAATCTTCA
AAGTACTCTGAGGCTTGTAG

g
n

h
h ớ
(bp)

MT-TL1,
MT-ND1

2463

MT-ND5

2887

MT-TK

1831

PCR

Thi
ặ

i

).

h

2

ị

ó hi

ạ

1

iể
S P he

i.

e ide

h
i,

ầ 3’ ủ

ể

h

( giúp
e ide

i ủ

Primer-BLAST
dụ g

g

g

hi

( />( />
i ặ hi

h
g

g

gP R ể h

ge

g 2.1 ới h h hầ

sau:

15

h

ụ
g

i

g
h

g

h hi

h


Bả

2.2: T à

p ầ

Bả

óa c ất PCR

Tên hóa chất

2.3: C

PCR Buffer

1X

i

h

MgCl2

1,5 mM

ặ

ại 40 h

dNTP

0,2

i x i/ g ợ
Takara

ại

Taq

polymerase

i

-

0,1 µM

HS

0,5 U
<250 ng

H2 O

V

h

i

98oC

3 phút

98oC

10 giây

60oC

20 giây

72oC

1,5 phút

72oC

5 phút

ỳ

Kéo dài

é d i

ệt PCR

Chu trình nhiệt

ặ

-

gDNA

trì

Giai đoạn

Nồn độ cuối

/ ỗi

ơ

g

ủ 15,0 µ

2.4.5. Đ ệ d
i n di kiểm tra s n phẩm PCR trên gel agarose 1,5% với
ợc chạy kèm với h

M

i n di 30 phút với hi
2.4.6. T
S
ủ The
Bả

g

1

ể

h h ớc. Thời gian

i n th 100V.

sạc sả p ẩm PCR
hẩ

P R

ợ

i h ạ h

g i

x S P-IT® PCR Product Cleanup

S ie ifi .
2.4: T à

p ầ các c ất c o p ả

Thành phần phản n

hi

t

sạc sả p ẩm PCR

Thể t ch

Exonuclease I

1,0 µl

SAP

1,0 µl

S

S

h

m TBE 0.5X.

hẩ

P R

5,0 µl

Tổn thể t ch

7,0 µl

hỗ hợ

phút và 80oC – 15 hú .

he
hú

hể

h

g 2.5,

h ủ, h

20 à

e



i

37oC 15
e.

2.4.7. Cycle Sequencing PCR
S

dng BigDyeđ Terminators V3.1 Cycle Sequencing của Applied

Biosystems, s dụng m t m i xuôi hoặc m i g ợc. Thành phần ph n

16

gg

:


BigDyeđ Terminator V3.1 2,5X

0,5 àl

Sequencing buffer 5X

1,0 àl

i gi i
S
h

h

h

(5à )

i h ạ h

Tổn thể t ch
h hi : i
h

g

0,6 µl
7,5 µl

96

9,6 µl
g 1 hú , i

o

he

30 h

ỳg

96oC trong 10 giây; 50oC trong 5 giây; 60oC trong 4 phút.
2.4.8. Tủa sả p ẩm cyc e seque c
S
f

hẩ

ide

ớ

Q

e e

hi h

h i

e e ẽ

ợ

ĩ 96 gi g gi i

h

ủ

h

ã g

ới

i-Di

.

h h:

h ẩ

-

P R

PCR

ị

e 1,5

– ghi

hi

Ph hỗ hợ

i

μ/

100%: 30 μ /

eh

-

h 32,5 μ hỗ hợ

-

h

T -Ethylendiaminetetraacetic Acid 1,25 mM: 2,5
.V
ỗi

hẩ
h h ớ

.

hẩ

ex

e 1,5

e e

.
ã h ẩ

ị.

e i gP R

P R >700

e,

ú g h

ex

ể

(

h

gã

).
4oC trong 25 phút.

13000 ò g/ hú

ại

-

dị h

i, h

200 μ e h

13000 ò g/ hú

-

g i e e hú ạ h dị h
Ủ

h 17 μ

-

48o (

e

ủ .

h i h ).
ide

e,

ex

,

h h.

96oC, 2 phút.

Ủ

iữ ạ h -30o

-

i, h

hi

i- i f

be.

4oC trong 15 phút.

-

-

70%

g 5 hú

i ạ

gi g gi i

h

( ĩ 96 gi g).

2.4.9. Giải trình tự và phân tích kết quả
T
h
h
hi

h

e ide ủ
g

h

g hầ

h

ge
i

ạ ge

3500 e e i

ầ
ze (

i W
ụ

i
ge

h

h

ợ x

ied i

e h 5.5. h

g

h

ó.

17

e ,
g

ủ mtDNA

ị h

g

gi i

).
h ẽ

ợ
gió g
ó h


Chươn III: KẾT QUẢ – BIỆN U N
Đặc điểm l m sàn của ệnh nh n

3.1.

i
h

ợ g ghi

g

ại

Sh ặ
h i

ầ

hi

ợ

14

h hân ã

hẩ

h

g 1.

i iể hi

hd

Bả

3.2.

g

.V

ợ

h ạ g,
h h

.

g

i

i

g i h h
ị

ợ

h ạ g hiễ

ỷ

: ữ

h

i.
của bệ

Giới t nh
Nam
ữ
ữ
Nam
ữ
ữ
ữ
ữ
ữ
Nam
Nam
Nam
ữ
Nam

â

Tuổi mắc ệnh

1
i
5
i
5
i
20
i
7
i
1
i
8
i
7
i
2
i
2
i
3
i
8
i
4
i
2
i

h i ầ

ể i

di

h i h

h h h
h

, h

ghi

h

ợ

di

h h

i iS i
ợ

i hh

gi

ị h

hé

h

,
ei

g h

280

.

g hi ó gi
ó

ợ hể hi

g ời h

i.S

g h

ó g 260

ó g 260
ó

1 – 20

h

h i

i

h
h

h g hể hi .

i Pe
h

i

g

ủ

ớ

g

ớ

ó, hi ghi

i

e

ghi gờ

Kết quả t ch chiết DNA tổn số
T h hi

h

h

ầ ghi h

Mã số
MELAS-Y1
MELAS-Y2
MELAS-Y3
MELAS-Y4
MELAS-Y5
MELAS-Y6
MELAS-Y7
MELAS-Y8
MELAS-Y9
MELAS-Y10
MELAS-Y11
MELAS-Y12
MELAS-Y13
MELAS-Y14

hẩ

ới

ớ

3.1: Đặc đ ểm âm sà

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

i

h h

toan lactate trong máu. Nghiên

là 6 : 8.

ợ

h

hi

h hi , i
gi
e i

g

h .

h hi

g

h h iể

ị

ị
hụ

ợ

g (O

h

hụ

g

ớ

ạ h

i h ạ h ủ
– Optical density)

h

ó g 280
i h ạ h ủ

g 3.2.

18

a Blood

g

g ại
ớ

ớ

ó g
h

h