Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen lim xanh tại khu vực núi luốt, trường đại học lâm nghiệp bằng kỹ thuật RAPD

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành chƣơng trình tốt nghiệp đại học và chuẩn bị cho công
việc trong tƣơng lai, qua quá trình học tập tại trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tôi
đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên, giúp đỡ trong học tập cũng nhƣ
trongcuộc sống. Bài khóa luận tốt nghiệp là sự đánh giá kết thúc của một quá
trình học tập và nghiên cứu ở giảng đƣờng Đại học. Để hồn thành khóa luận
này khơng chỉ cần sự cố gắng, nỗ lực của bản than mà em còn nhận đƣợc
những sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và gia đình.
Nhân đây, tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS. TS.
Nguyễn Văn Thắng và Ths. Nguyễn Thị Huyền đã quan tâm giúp đỡ, hƣớng
dẫn tận tình cho tơi trong thời gian thực hiện khóa luận.
Xin đƣợc gửi tới các thầy cơ giảng viên Viện Công nghệ sinh họcTrƣờng Đại học Lâm Nghiệp lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc. Vì sự
quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình, chu đáo của thầy cô suốt 4 năm qua.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh
động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành chƣơng trình
học tập của mình.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Ngọc Đức


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. 6
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................... 2
1.1. Cây Lim Xanh ............................................................................................ 2

1.1.1. Vị trí và phân bố...................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
1.1.3. Đặc điểm sinh học của cây Lim Xanh .................................................... 4
1.1.4. Công dụng của cây Lim Xanh................................................................. 5
1.2. Đa dạng di truyền và một số kỹ thuật phân tử ứng dụng trong nghiên cứu
đa dạng di truyền ở thực vật .............................................................................. 5
1.2.1. Đa dạng sinh học ..................................................................................... 5
1.2.2. Đa dạng di truyền .................................................................................... 7
1.3. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng trong nghiên cứu đa dạng sinh học ...... 8
1.3.1. Kỹ thuật chỉ thị ADN không sử dụng PCR: ........................................... 9
1.3.2. Kỹ thuật Chỉ thị ADN sử dụng PCR: .................................................... 10
1.4. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới .................................. 13
1.5. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở Việt Nam .................................. 16
Chƣơng II MỤC TIÊU - NỘI DUNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 19
2.1 Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 19
2.1.1. Mục tiêu chung:..................................................................................... 19
2.1.2. Mục tiêu cụ thể: ..................................................................................... 19
2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 19
2.3.Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 19


2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 19
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 20
2.4. Hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ........................................... 20
2.4.1. Hóa chất................................................................................................. 20
2.4.2. Máy móc thiết bị ................................................................................... 22
2.5. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.................................................... 22
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 22
2.6.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN từ mẫu câyLim Xanh ............................ 22

2.6.2. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)................................. 24
2.6.3.Phƣơng pháp điện di trên gel agarose .................................................... 24
2.6.4. Phƣơng pháp phân tích số liệu RAPD ................................................. 25
Chƣơng II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 26
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .............................................................. 26
3.2. Kết quả phân tích hiệu quả của các cặp mồi nghiên cứu ......................... 26
3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu ........ 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 36
1. Kết Luận ...................................................................................................... 36
2. Kiến Nghị .................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Viết đầy đủ

AFLP

Amplified Fragment Length ADN

CTAB

Cetyl Trimethyl Amonium Bromide

ADN

Deoxyribose Nucleic Acid

cs

Cộng sự

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

OD

Optical Density

EDTA

Ethylene Diamino Tetra Acetic acide

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphism ADN

SSR

Simple Sequence Repeat

PIC

Polymorphism information content

TE

Tris-EDTA

UV

Ultra Violet


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

2.1: Bảng ký hiệu các mẫu Lim Xanhsử dụng trong nghiên cứu ........... 20

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu ................. 22
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa ...................................................... 23
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách ..................................................... 23
Bảng 2.5.Thành phần phản ứng PCR .............................................................. 24
Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR ................................................................... 24
Bảng 3.1. Các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên với mồi OPAC-14......28
Bảng 3.2. Các phân đọan ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiênvới mồi OPAH-01
đƣợc mã hóa thành kí hiệu 0 và 1. .................................................................. 29
Bảng 3.3. Tổng hợp số loại phân đoạn, băng ADN đƣợc nhân bản,số phân
đoạn, băng ADN đa hình ................................................................................. 31
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng của các mẫu Lim Xanh nghiên cứu .................. 33

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng sốcủa các mẫu Lim Xanh .................... 26
Hình 3.2.Sản phẩm PCR-RAPD các mẫu Lim Xanhvới mồi OPAC-14 ........ 27
Hình 3.3.Sản phẩm PCR-RAPD các mẫu Lim Xanh với mồi OPAH-01....... 29
Hình 3.4.Sản phẩm PCR-RAPD các mẫu Lim Xanh với mồi Rm1 ............... 30
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Lim
Xanh ................................................................................................................ 34


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Lim Xanh tên khoa học là: Erythrophleum fordii, thuộc họ Vang
(Caesalpiniaceae) , là Cây gỗ lớn, thƣờng xanh có thể cao trên 30m, thân
thẳng. Lúc non vỏ ngồi có mầu xám với các vết nứt dọc nhẹ màu nâu, khi già
vỏ có màu nâu sẫm, nứt ơ vng hay bong vảy lớn và có nhiều lỗ vỏ nổi rõ;
thịt vỏ dày, màu hồng. Là lồi cây gơc q hiếm nên có giá trị kinh tế cao. Vì
vậy việc khai thác bừa bãi đã dẫn đến loài Lim Xanh có nguy cơ báo động.
Từ nhƣng lí do trên em xây dựng đề tài này nhằm cung cấp nguyên liệu phân
tử ban đầu cho quy trình giám định bằng mã vạch ADN từ thực vật.
Cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào về phân tích đa dạng di truyền của
loài Lim Xanh đƣợc báo cáo, các nghiên cứu trƣớc mới chỉ tập trung vào phân
tích hình thái của lồi Lim Xanh, gần đây cùng với sự phát triển của sinh học
hiện đại, sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử AFLP, RAPD, SSR,
SNP…đã cho phép đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể,
các xuất xứ một cách nhanh chóng, trong đó chỉ thị RAPD là một loại chỉ thị
đƣợc sử dụng phổ biến, RAPD là một kỹ thuật cho phép phát hiện nhanh tính
đa dạng di truyền của các quần thể, phƣơng pháp này khá đơn giản, khơng địi
hỏi kỹ thuật cao, khơng phải sử dụng đồng vị phóng xạ, có thể phát hiện ra
nhiều locus một lúc, nên đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá đa dạng di
truyền.
Đểgóp phần bảo tồn và sử dụng nguồn gen hiệu quả và những giá trị

kinh tế mà loài cây này mang lại chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu đa
dạng di truyền nguồn gen Lim Xanh tại Khu vực núi Luốt – Trƣờng Đại
Học Lâm Nghiệp bằng kỹ thuật RAPD”.

1


Chƣơng I
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Cây Lim Xanh
1.1.1. Vị trí và phân bố
Lim Xanh có tên khoa học là Erythruphleum fordii,thuộc họ Đậu
(Fabaceae), chi Lim Xanh (Erythruphleum). Cây Lim Xanh thƣờng đƣợc
phân bố chủ yếu ở các kiểu rừng á nhiệt đới thƣờng xanh độ cao từ 300500m. Chi Lim Xanh có nguồn gốc ở miền Nhiệt đới và cận nhiệt đới của
Nam Á và Đông Nam Á bao gồm cả miền Đông đảo Đài Loan, Quảng Đông,
Triết Giang…, là lồi cây đa tác dụng có giá trị kinh tế cao và bảo tồn cao.
Tại Việt Nam Lim Xanh là loài cây cận đặc hữu của Việt Nam vì ngồi
khu phân bố tập trung nhất ở Việt Nam, còn phát hiện Lim Xanh mọc rải rác
ở miền Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, theo các tài liệu trƣớc đây, Lim Xanh
mọc tập trung ở các tỉnh vùng Đông Bắc, Bắc Trung Bộ và biên giới cực nam
của loài cây gỗ quí này là tỉnh Quảng Nam. Nhƣng gần đây đã phát hiện Lim
Xanh cịn có ở Quảng Ngãi, Bình Định, và Bình Thuận (huyện Hàm Tân, độ
vĩ 10,47 Bắc). Nhƣ vậy khu phân bố của Lim Xanh từ 10-230o vĩ Bắc và 102108o kinh Đơng. Các tỉnh có nhiều Lim Xanh nhất là: Lạng Sơn, Phú Thọ,
Vĩnh Phúc,Thái nguyên, Bắc Kạn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Thanh Hoá, Nghệ
An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam. Vùng sơng Thanh, huyện
Nam Giang, tỉnh Quảng Nam còn những khu rừng với nhiều cây Lim Xanh có
đƣờng kính trên 1,5m. Gỗ cây Lim Xanh có giá trị kinh tế cao.

2

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Cây lim xanh (chụp tại núi Luốt)
Cây gơc lớn cao 37 - 45m,đƣờng kính có khi tới 2 - 2,5m, thƣờng xanh,
gốc có bạnh vè, than trịn, phân cành nhánh lớn, tán lá hình ô, dày, rộng. Võ
màu nâu, bong vẩy lớn. Khi còn non có nhiều bí khổng. Lá kép lơng chim 2
lần, hoa tự kép hình bong. Quả thn dài 20 cm, rộng 3 - 4 cm, hạt dẹt màu
nâu đen, xếp lợp lên nhau, có lớp vỏ chất sừng, bảo vệ chắc nên tồn tại lâu
trong đất, dễ bảo quản.
Tán cây: Tán cây thƣờng trịn có độ dày từ 1/5 ÷ 1/4 chiều cao vút
ngọn.Hình thái lá, hoa và quả.

3


1.1.3. Đặc điểm sinh học của cây Lim Xanh
Lim xanh là loài cây gỗ lớn, phân bố trong vành đai nhiệt đới thấp, từ
200 - 800m, nhƣng tập trung nhất ở độ cao 300 - 500m. Vùng phân bố của
Lim Xanh có nhiệt độ bình qn năm 22,2-23,80C, nhiệt độ tối thấp tuyệt dối
1,40C, lƣợng mƣa biến động từ 1.500mm/năm (Qùi Châu, Nghệ An) đến
3.000 mm/năm (Móng Cái, Quảng Ninh), độ ẩm trung bình năm 80-86%.
Yêu cầu ánh sang của cây thay đổi theo các giai đoạn sinh trƣởng, phát
triển: Giai đoạn 4 - 5 tháng tuổi, Lim Xanh là cây chịu bóng, sinh trƣởng bình
thƣờng ở độ tàn che 25 - 75%, đặc biệt thích hợp ở độ tàn che 50%. Trong
điều kiện đƣợc chiếu sáng tự nhiên 100%, sánh sang hồn tồn ( khơng che)
hoặc che tối 100%, cây Lim Xanh non sinh trƣởng rất kém. Giai đoạn càng
lớn ( từ 5 tuổi trở lên) cây sinh trƣởng bình thƣờng ở điều kiện ánh sang tự
nhiên. Khi trƣởng thành, Lim Xanh luôn vƣơn lên tầng cao nhất của rừng.

Cây phân bố trên nhiều loại đất có nhiều nguồn gốc khác nhau nhƣ: sa
thạch, phiến thạch sét, gnai, mica sit, pooc phia… có thành phần cơ giới từ cát
pha, sét nhẹ, sét trung bình đến sét nặng. Cây thích hợp nhất với đất sâu, dày,
ẩm, nhƣng cũng mọc đƣợc ở các loại đất thối hóa với tầng đất mỏng, độ ẩm
không cao, tuy vậy cây sinh trƣởng kém. Đất có lim xanh mọc thƣờng khá
chua đến chua trung bình.
Lim Xanh thƣờng mọc thành quần thụ hỗn loại, chúng mọc xen với các
loài cây thuộc chi Dẻ đá và Dẻ gai (họ Dẻ), và các loài gội nếp, tram, săng lẻ,
sau sau, tram trắng…
Cây tái sinh tốt dƣới tán rừng có độ tàn che 0,3 - 0,7. Đặc biệt tái sinh
tốt dƣới tán rừng có các lồi cây sau sau, săng lẻ để tạo thành các khu rừng
hỗn giao Lim và Sau sau ở vùng Lạng Sơn; Lim và Săng lẻ ở vùng Tây Nghệ
An.
Tăng trƣởng hàng năm không quá chậm so với nhiều loài cây gỗ khác:
tăng trƣởng đƣờng kính 0,7 - 0,8 cm/năm và tăng trƣởng chiều cao 0,8

4


m/năm. Cây trồng 25 tuổi đạt chiều cao 17-21m và đƣờng kính ngang ngực
20 - 21 cm. Tuy nhiên, sự hình thành gỗ lõi hơi chậm so với các lồi khác.
Vỏ hạt lim có chất sừng nên giữ đƣợc sức nẩy mầm trong đất nhiều
năm. Khi gặp điều kiện thuận lợi hạt mới nảy mầm.
Hoa tháng 3 - 4, quả chin tháng 11 đến tháng 1 năm sau.
1.1.4. Công dụng của cây Lim Xanh
Lim xanh đƣợc coi là một cây giàu tannin, vỏ cây chứa khoảng 15,21%
tannin. Trong thời Pháp thuộc đã có xí nghiệp sản xuất tannin ở n Cát
(Thanh Hóa) với nguyên liệu chủ yếu là vỏ lim xanh. Sau này vì rừng lim ở
vùng Tây Thanh Hóa bị suy thối, khơng có vỏ để cung cấp, nên xí nghiệp
thiếu ngun liệu và đã đóng cửa. gỗ lim có dác lõi phân biệt, dác màu xám

nhạt hay vàng nâu, lõi khi mới chặt màu xanh vàng sau chuyển màu nâu sẫm,
rất cứng, thuộc loại tứ thiết, một trong những loại gỗ tốt nhất của Việt Nam.
Gỗ có tỷ trọng 0,94, lực kéo ngang thớ 29 kg/cm2, nén dọc thớ 608 kg/cm2,
oằn 1,546 kg/cm2, hệ số co rút 0,47-0,61. Gỗ lõi không bị mối mọt, rất bền
nên đƣợc dung trong các cơng trình xây dựng lâu dài nhƣ đền chùa, nhà
thờ…, hoặc dung đóng đồ đạc, làm cửa, ván sàn, tà vẹt và đồ trang trí trong
nhà.nhƣng theo kinh nghiệp nhân dân, gỗ lim khá độc nên thƣờng không dung
làm giƣờng ngủ vì sẽ làm đau mình mẩy. Nhiều nguồn tin cho rằng, vùng
rừng lim có khí hậu và nguồn nƣớc suối độc.
Rễ cây có nốt sần cố định đạm làm tăng độ phì của đất. khi cây bị chết,
rễ mục là giá thể tốt nhất cho loài nấm linh chi (Ganoderma lucida), một loài
nấm làm thuốc bổ rất quý phát triển.
Cây có tán lá dậm nên là đối tƣợng rất thích hợp trồng ở các khu rừng
phịng hộ, bảo vệ đầu nguồn nƣớc.
1.2. Đa dạng di truyền và một số kỹ thuật phân tử ứng dụng trong nghiên
cứu đa dạng di truyền ở thực vật
1.2.1. Đa dạng sinh học
“Đa dạng sinh học là sự phong phú của mọi cơ thể sống có từ tất cả các
nguồn trong các hệ sinh thái trên cạn, dƣới nƣớc ở biển và mọi tổ hợp sinh
thái mà chúng tạo nên. Đa dạng sinh học bao gồm sự đa dạng trong loài (đa
5


dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng gen), giữa các loài (đa dạng loài) và các
hệ sinh thái (đa dạng sinh thái)” (theo công ƣớc đa dạng sinh học năm 1992).
“Đa dạng sinh học là đa dạng các loài thực vật, động vật, vi sinh vật
tồn tại và tác động qua lại lẫn nhau trong một hệ sinh thái. Trong hệ sinh
thái nông nghiệp, tác nhân thụ phấn, thiên địch, giun đất, vi sinh vật đất là
thành phần đa dạng chìa khóa, chúng đóng vai trị sinh thái quan trọng trong
quá trình chuyển gen, điều khiển tự nhiên, chu kỳ dinh dƣỡng và tái thiết lập

cân bằng”.
“Đa dạng sinh học là biến dị có mặt trong tất cả các loài thực vật và
động vật, vật liệu di truyền của chúng và hệ sinh thái nơi các biến dị đó xảy
ra.Ba mức độ của đa dạng sinh học là đa dạng di truyền, đa dạng loài và đa
dạng hệ sinh thái.
Đa dạng hệ động và thực vật đem lại cơ hội tuyệt vời không chỉ cho tạo
giống cây trồng, vật ni mà cịn nhiều lợi ích khác lớn hơn trong tƣơng lai.
Một số sử dụng trƣc tiếp nhƣ cung cấp dinh dƣỡng, phát triển bền vững và các
cây trồng thích nghi với điều kiện địa phƣơng. Những giá trị sử dụng gián tiếp
nhƣ tạo môi trƣờng sinh thái, sức khỏe công đồng, tác nhân thụ phấn và điều
khiển sinh học, hệ sinh vật đất. Đa dạng sinh học đem lại sự phát triển nông
nghiệp bền vững và sự thịnh vƣợng cho con ngƣời hiện tại và trong tƣơng lai.
Vai trò của đa dạng sinh học với đời sồng con ngƣời đƣợc thể hiện
thông qua các mặt nhƣ: Lƣơng thực - Dinh dƣỡng - Thuốc chữa bệnh - Bảo
tồn văn hóa, tập quán và phát triển bền vững.
Đa dạng sinh học khơng những bảo tồn, duy trì số lƣợng nguồn tài
ngun nƣớc và đất, nó cịn giúp tăng độ màu mỡ của đất, nâng cao chất
lƣợng nguồn nƣớc cho con ngƣời và các sinh vật.
Đa dạng có vai trị làm giảm nhƣng tác động của con ngƣời đến môi
trƣờng, nhƣ ngăn ngừa và phân giải khí thải, chất thải, ngay cả chất thải rắn
do các hoạt động của con ngƣời tạo ra chuyển thành dạng hữu ích hoặc ít độc
hại hơn [13].
6


1.2.2. Đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong
cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di
truyền đƣợc trong một quần thể và giữa các quần thể.
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di

truyền trong một lồi, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho
cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp
bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền.
Tính đa dạng di truyền rất cần thiết cho việc duy trì lồi, khả năng sinh
sản, tính thích ứng và khả năng sinh sản, tính thích ứng và sức đề kháng với
mơi trƣờng bất lợi và các tác hại khác. Trong nền nơng lâm nghiệp hiện đại,
tính đa dạng di truyền có ý nghĩa đặc biệt quan trọng [11].
Trƣớc đây trong những nghiên cứu về phân loại bảo tồn, phân tích, đa
dạng và chọn lọc tạo giống ngƣời ta thƣờng sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ
thị hóa học tuy nhiên các chỉ thị này còn tồn tại một số nhƣợc điểm. Chỉ thị
hình thái dựa trên các thơng số nhƣ hình dạng kích thƣớc màu sắc của cơ
quan bên ngồi đặc biệt là cơ quan sinh sản, tuy nhiên thu mẫu phụ thuộc vào
việc thu thập có đầy đủ bộ phận hoa, quả hay khơng, cịn có những lồi mang
đặc điểm hình thái rất giống nhau dễ gây nhầm lẫn trong q trình định loại.
Chỉ thị hóa học tuy cho kết quả nhanh và chính xác nhƣng nhƣợc điểm của nó
là các mẫu thu đƣợc ở các vùng địa lý khác nhau cũngrất khác nhau do môi
trƣờng sống của chúng. Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh
học, các phƣơng pháp phân tích đa dạng di truyền ngày càng hiện đại, nhanh
chóng và chính xác hơn. Dƣới đây là một số chỉ thị phân tử thƣờng xuyên
đƣợc dung trong nghiên cứu đa dạng sinh học.
Đa dạng di truyền là phƣơng thức tồn tại của các loài qua hang ngàn
năm tiến hóa. Đa dạng di truyền là cần thiết và quan trọng đối với bất kì sinh
vật nào để duy trì khả năng sinh sản hữu thụ, tính bền vững trƣớc mọi yếu tố
đe dọa. Nó cũng có vai trò quan trọng đến khả năng đề kháng với các loại
7


dịch bệnh và khả năng thích nghi của các cá thể trong lồi với các thay đổi
của mơi trƣờng. Sự đa dạng về di truyền của các cây trồng vật ni có giá trị
đặc biệt và có ý nghĩa lớn trong chƣơng trình lai tạo giống mới và phục vụ sản

xuất nông lâm nghiệp [12],[17].
Sự khác biệt nhau về gen trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gen
trong nguồn gen đó và số allen của mỗi gen. Sự khác biệt về gen cho phép các
lồi thích ứng đƣợc với sự thay đổi của mơi trƣờng. Nói chung, những loài
quý hiếm thƣờng đơn điệu về gen so với những lồi phổ biến, lồi có phân bố
rộng, hậu quả là những loài quý hiếm thƣờng rất nhạy cảm với sự biến đổi của
môi trƣờng và dễ bị tuyệt chủng.
1.3. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng trong nghiên cứu đa dạng sinh học
Các chỉ thị di truyền là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể
hoặc các lồi khác nhau. Các chỉ thị này khơng thể hiện cho các gen mục tiêu
mà chỉ là dấu hiệu hoặc nhƣ là “cờ đánh dấu”. Chỉ thị di truyền bao gồm cả
chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử (isozyme, protein, ADN). Tất cả chỉ thị di
truyền đều chiếm một vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể (NST) và đƣợc gọi
là locus. Các chỉ thị di truyền thƣờng liên kết với gen và đƣợc di truyền theo
qui luật di truyền. Chỉ thị phân tử thƣờng đƣợc hiểu là chỉ thị ADN, các chỉ
thị này chỉ nằm gần hay liên kết với gen và khơng có hoặc ít ảnh hƣởng đến
kiểu hình.
Chỉ thị di truyền có thể chia thành hai loại: chỉ thị truyền thống và chỉ
thị ADN. Chỉ thị truyền thống gồm chỉ thị hình thái (đây là những tính trạng
hoặc đặc điểm hình thái nhƣ mầu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trƣởng, sự
biến đổi sắc tố v.v.), chỉ thị tế bào (đặc trƣng cấu trúc của nhiễm sắc thể) và
chỉ thị sinh hóa (các isozyme, protein và các chất trao đổi chất). Chỉ thị ADN
là những thay đổi trong phân tử ADN và đƣợc chia thành nhiều loại dựa trên
sự khác nhau về phƣơng pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình. Các chỉ thị
ADN đƣợc sử dụng rộng rãi nhất do số lƣợng chỉ thị không hạn chế. Chỉ thị
ADN đƣợc hình thành từ các loại đột biến ADN khác nhau nhƣ thay thế (đột
8


biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót

trong sao chép các đoạn ADN lặp lại liền kề. Các chỉ thị ADN thƣờng nằm ở
các vùng không phiên mã. Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị
ADN khơng giới hạn về số lƣợng, không ảnh hƣởng bởi yếu tố môi trƣờng và
giai đoạn phát triển của cây. Chỉ thị ADN đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu
quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ
liên kết di truyền, nhận biết gen; và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa
dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu
các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, năng suất và phẩm chất giống.
Mỗi loại chỉ thị ADN đƣợc phát triển bằng một kỹ thuật tƣơng ứng. Kỹ
thuật chỉ thị ADN lý tƣởng cần phải có các tiêu chí sau: cho đa hình cao và
phân bố đều trong genome; cho sự phân biệt rõ sự khác nhau về di truyền, tạo
nhiều chỉ thị độc lập và chính xác; đơn giản, nhanh và ít tốn kém; cần ít mẫu
và ADN; liên kết với kiểu hình nhất định; có thể lặp lại trong các nghiên cứu,
mức độ sai sót thấp nhất, ghi số liệu dễ và chính xác, có nhiều allen (hàm
lƣợng thông tin cao), không cần biết trƣớc thông tin về genome và cơ thể.
Các kỹ thuật chỉ thị ADN đƣợc chia thành các nhóm chính là: các kỹ
thuật khơng sử dụng phản ứng PCR và các kỹ thuật sử dụng PCR. Dƣới đây
là một số kỹ thuật chỉ thị ADN thƣờng đƣợc sử dụng:
1.3.1. Kỹ thuật chỉ thị ADN không sử dụng PCR:
Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân
đoạn ADN dựa trên điểm cắt các enzim giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ
ADN với enzim giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp
sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn ADN với kích thƣớc khác nhau, từ đó lập nên các
bản đồ gen. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay.
Kỹ thuật RFLP dựa trên độ đặc hiệu của các enzim cắt giới hạn
(restriction enzim-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen. Sự
khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
9

Ƣu điểmkỹ thuật RFLP:RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép
phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc ADN khảo sát trong
RFLP lớn vì vậy số lƣợng dấu phân tử (marker) tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu
cầu nghiên cứu.
Nhƣợc điểm kỹ thuật RFLP:Qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm
đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu) và ADN yêu
cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Hơn nữa
hiện nay, ở nƣớc ta nhà nƣớc chƣa cho phép nhập các chất phóng xạ.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản
hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng ADN cần
khảo sát, sau đó đoạn ADN đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các RE, điện di và
phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua
bƣớc lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP.
1.3.2. Kỹ thuật Chỉ thị ADN sử dụng PCR:
1.3.2.1. Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment
Length Polymorphism- AFLP)
Kỹ thuật AFLP đƣợc sử dụng để phát hiện đa hình ADN. Phân tích
AFLP đƣợc kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết
vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp (adapter) để nhân chọn lọc các phân
đoạn ADN đƣợc cắt hạn chế. Các cặp mồi thƣờng tạo đƣợc từ 50 đến 100
băng trong một phân tích. Số lƣợng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn
lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật AFLP cho phép lấy dấu ADN từ bất kỳ
nguồn gốc nào.
Kỹ thuật AFLP có độ tin cậy và lặp lại cao; khơng cần thơng tin về trình
tự ADN của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thơng tin do có khả năng phân tích số
lƣợng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các
locus đặc thù; các số liệu có thể lƣu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh.
Tuy nhiên, điểm kỹ thuật AFLPphải qua nhiều bƣớc mới có kết quả;
ADN cần phải sạch, khơng có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn

10


chế; địi hỏi cơng sức và giá thành cao. Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không
phân biệt đƣợc đồng hợp tử và dị hợp tử[27].
1.3.2.2. Kỹ thuật chỉ thị dựa trên các tiểu vệ tinh (microsatellite) hay chuỗi
lặp lại đơn giản (simple sequence reapeats – SSR)
SSR (SSLP, STMS) trở thành kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng trong
cả động vật và thực vật. SSR rất đa hình do đột biến tác động lên số đơn vị
lặp lại. Sự thay đổi hay sự đa hình của SSR là kết quả của sự khác nhau về độ
dài các đoạn lặp lại trong genome do q trình trao đổi chéo khơng cân hoặc do
sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép. SSR khơng những phổ biến mà
cịn biến động mạnh về số lƣợng kiểu lặp lại trong genome sinh vật nhân thực.
Sự khác nhau allele của SSR là kết quả của sự thay đổi số lƣợng đơn vị lặp lại
trong cấu trúc tiểu vệ tinh. Các chuỗi lặp lại thƣờng đơn giản và cấu tạo bởi 2,
3 hoặc 4 nucleotide. Kỹ thuật SSR đƣợc thực hiện bằng phản ứng PCR với mồi
SSR xuôi và ngƣợc. Sản phẩm PCR đƣợc phân tách trên gel polyacrylamide
kết hợp nhuộm bạc (AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động.
Kỹ thuật SSR có một số ƣu việt hơn các chỉ thị khác nhƣ: Cho nhiều
allen trong một locus. Phân bố đều trong genome. SSR cho thông tin cụ thể
hơn so với di truyền ty thể theo đƣờng mẹ (vì có mức đột biến cao) và di
truyền theo cả bố và mẹ. Là chỉ thị đồng trội. Có tính đa hình và đặc thù cao.
Có thể lặp lại ở các thí nghiệm, sử dụng ít ADN, rẻ và dễ tiến hành, có thể
phân tích bán tự động, khơng sử dụng phóng xạ, có thể sử dụng các ADN cổ
(ancient ADN-aADN). SSR có thể phân biệt các cá thể có mối quan hệ gần.
Điểm hạn chế quan trọng của kỹ thuật chỉ thị SSR là cần phải đọc trình tự
genome để dựa vào đó có thể thiết kế các cặp mồi đặc thù và tối ƣu hóa điều
kiện các mồi cho từng loài trƣớc khi sử dụng.
1.3.2.3.Kỹ thuật RAPD (RADNom Amplified Polymorphic ADN)
Kỹ thuật RAPD là phƣơng pháp phân tích đa dạng ADN khuyếch đại

ngẫu nhiên, kỹ thuật này đƣợc phát hiện vào năm 1990 (Welsh và
McClellADN; William và ctv.). Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của
11


những loài khác nhau. Mồi đƣợc sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi
oligonucleotide gồm 10-mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm
RAPD đƣợc phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của hai loài
khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ đó có thể so sánh sự
đa dạng sinh học của các giống cây.
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những
primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản
ngẫu nhiên những đoạn ADN có trình tự bổ sung với trình tự của các primer.
Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối
diện của mạch khn ADN trong khoảng cách có thể khuếch đại đƣợc (dƣới
3000bp) sẽ cho ra những đoạn ADN có kích thƣớc khác nhau sau khi khuếch
đại. Sự có mặt của các sản phẩm ADN khác nhau chứng tỏ đã có một sự
tƣơng đồng hồn tồn hay một phần giữa ADN bộ gen và mồi. Các mồi dùng
trong RAPD thƣờng ngắn vì vậy dễ dàng tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên
mạch đơn ADN bộ gen. Do đó tính đa dạng thu đƣợc nhờ RAPD là đáng tin
cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp
hợp giữa mồi và ADN mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm
bớt điểm gắn mồi cũng nhƣ sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi
kích thƣớc đoạn ADN đƣợc khuếch đại.
Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kích
thƣớc khác nhau, kết quả này đƣợc thể hiện trên gel với nhiều băng (bADN) ở
những vị trí khác nhau, các băng đa hình đƣợc ghi nhận và từ đó có thể vẽ
đƣợc bản đồ trên một quần thể đang phân ly.
Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hồn tồn giống nhau, sẽ khuyếch đại
các đoạn ADN có kích thƣớc giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên

nào để chạy PCR. Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen _ đa
dạng về sinh học, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn ADN đƣợc
khuyếch đại sẽ có kích thƣớc khác nhau.

12


Mồi sử dụng trong kỹ thuật RAPD là đoạn ngắn oligonucleotide đơn
(10 nu) đƣợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lƣợng G+C từ 60-70%,
và khơng có đầu tự bổ sung.Để tìm sự khác biệt giữa các lồi, ngƣời ta thƣờng
sử dụng một số lƣợng lớn các mồi ngẫu nhiên.
Kỹ thuật RAPD đƣợc sử dụng để thiết lập bản đồ di truyền. Từ quần
thể cha mẹ F1 và quần thể phân ly F2, ngƣời ta có thể đánh giá các băng hiện
diện, sau đó dùng phần mềm phổ biến hiện nay là Mapmarker để thiết lập bản
đồ di truyền.
Sử dụng kỹ thuật RAPD có nhiều ƣu điểm nhƣ phát hiện nhanh tính đa
dạng di truyền, đơn giản, khơng địi hỏi kỹ thuật cao, tƣơng đối rẻ tiền so với
các phƣơng pháp khác nhƣ RFLP, SSR…và không dùng đồng vị phóng xạ.
Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD có nhƣợc điểm: sự xuất hiện các băng tính
trội, điều đó khơng phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử; Tính
lập lại khơng cao do primer là primer ngẫu nhiên và phụ thuộc điều kiện phản
ứng PCR; Trở ngại trong việc giải thích các băng có cùng tốc độ di chuyển.
1.4. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới
Nhờ sự phát triển của ngành công nghệ sinh học đặc biệt là sự phát
triển của sinh học phân tử với những bƣớc tiến đáng kể, trong những thập kỷ
đã qua có rất nhiều cơng trình nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ
quần thể hoặc ở các lồi khác nhau đƣợc cơng bố.
Muthusamy S. và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu
nhiên và kỹ thuật ISSR với 37 cặp mồi để nghiên cứu quan hệ di truyền của
10 giống đậu gạo thu đƣợc 987 băng ADN (trong đó có 719 băng đa hình) từ

kỹ thuật RAPD và 479 băng ADN (trong đó có 296 băng đa hình) từ kỹ thuật
ISSR, mức độ đa hình của RAPD và ISSR tƣơng ứng là 70,3% và 60,79% [25].
Năm 2009, Kumar và cs đã sử dụng chỉ thị ISSR nghiên cứu đa dạng di
truyền giữa 11 loài thuộc chi Dầu Mè (Jatropha) với 10 mồi ISSR đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu, có 8 mồi cho tỷ lệ đa hình là 100%. Sự sai khác về hệ
số tƣơng đồng di truyền dao động từ 0.346 - 0.807 [23].
13


Karwar và cs (2009) đã nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sugarcane
cultivars bằng chỉ thị RAPD thực hiện trên 17 mẫu nghiên cứu với 40 ngẫu
nhiên, kết quả thu đƣợc 325 băng, trong đó có 134 băng đa hình, hệ số sai khác
độ tƣơng đồng dao động từ 0,77 - 0,99, hệ số tƣơng đồng trung bình là 0,87 [28].
Mahmood và cs (2009) đã phân tích đa dạng di truyền của Gossypium
(thực vật thuộc Chi Bông) bằng kỹ thuật RAPD, với 63 mồi để phân tích 20
mẫu Gossypium, kết quả thu đƣợc 370 băng, trong đó có 310 băng đa hình,
mức độ tƣơng đồng di truyền dao động từ 3 - 64 % [35].
Elizângela Almeida Rocha và cs (2010) đã nghiên cứu đánh giá tính đa
dạng di truyền và xác định các giống khoai tây bằng các chỉ thị RAPD và SSR.
ADN gen của 16 giống khoai tây đƣợc khuếch đại với 25 mồi RAPD tạo ra 92 dải
đa hình và 20 cặp mồi SSR tạo ra 136 dải đa hình. Các giá trị PIC thể hiện hàm
lƣợng thơng tin cao của các mồi đƣợc sử dụng và 16 giống khoai tây đƣợc xác
định dựa trên sáu mồi RAPD và ba cặp primer SSR. Nhƣ vậy, bằng các dấu hiệu
RAPD và SSR, sự đa dạng di truyền đã đƣợc đánh giá và đã xác định đƣợc 16
giống khoai tây thƣơng mại đƣợc phân tích trong nghiên cứu [21].
Xingfeng Zhao và cộng sự (2012), đã nghiên cứu về loài Michelia
coriacea, một loài cây bị đe doạ nghiêm trọng tại tỉnh Vân Nam - Trung Quốc
bằng chỉ thị ISSR và SSR cho thấy sự đa dạng di truyền các loài này duy trì ở
mức độ di truyền tƣơng đối cao, tỷ lệ các dải đa hình PPB = 96,36% từ ISSR,
tỉ lệ loci đa hình PPL = 95,56% từ SSRs. Mức độ khác biệt về di truyền thấp

giữa các quần thể M. coriacea Đã đƣợc phát hiện bởi Gst của Nei = 0,187 đối
với ISSR và Wright's Fst = 0,090 đối với các điểm đánh dấu SSR [32].
Năm 2013, R. Basheer-Salimia và cs đã nghiên cứu 26 giống đậu Ngựa
lấy từ 8 địa phƣơng ở West Bank - Palestine với 37 mồi RAPD, kết quả thu
đƣợc 11 mồi cho tính đa hình cao, số phân đoạn đa hình từ 4 - 14, hệ số PIC
dao động từ 0,069 - 0,358 [29].
Kamran Ashraf và cộng sự (2014) đã phân tích đa dạng di truyền của
12 giống Gừng bằng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên, có 13 mồi tạo
14


đƣợc kết quả đa hình, thu đƣợc tổng cộng 275 băng, trong đó có 261 băng đa
hình chiếm 94,90%. Tỷ lệ đa hình của 12 giống Gừng dao động từ 88,23100% [22].
Sylwia Okon và cs (2014), đã đánh giá đa dạng sinh học lồi hoa cúc
(Arnica montana L.) thơng qua kỹ thuật RAPD, với 24 mẫu nghiên cứu sử
dụng 40 mồi RAPD thì có 12 mồi bắt cặp đƣợc thu đƣợc 120 băng, trong đó
112 băng đa hình chiếm tỷ lệ 92,5%. Hệ số tƣơng đồng dao động từ 0,535 –
0,945 [30].
Yadav J P và cs (2014) đã sử dụng kỹ thuật RAPD đánh giá đa dạng di
truyền của 19 loài Salvadora oleoides thu thập từ các vùng khác nhau của
Tây Bắc Ấn Độ với 16 mồi RAPD. Thu đƣợc 164 băng, tƣơng ứng với trung
bình 10,25 băng trên mỗi mồi với 146 băng cho thấy sự đa hình (90,09%). Hệ
số giống Jaccard dao động từ 0,21 đến 0,94. Nghiên cứu cho thấy sự đa dạng
di truyền là phong phú của S. oleoides ở Tây Bắc Ấn Độ [33].
Năm 2016, N. Prashanth và cs đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 18
giống Nghệ ở Telangana - Ấn Độ với 40 mồi RAPD, kết quả cho thấy có 15
mồi tạo ra tính đa hình đƣợc dùng để phân tích tất cả các mẫu, giá trị PIC dao
động từ 0.71 đến 0.96 [26].
Muhammad Faisal Anwar Malik và cs (2017), đã phân tích đa dạng di
truyền trong số 92 kiểu gen của Đậu tƣơng thu thập từ 5 nguồn khác nhau sử

dụng kỹ thuật RAPD. Trong số 20 mẫu thử nghiệm ngẫu nhiên với 6 xét
nghiệm, thu đƣợc 107 băng, trung bình 10,7 băng cho mỗi mồi. Tỷ lệ các dải
đa hình trong các kiểu gen dao động từ 0,47 đến 0,71. Các kiểu gen của
Pakistan và Hoa Kỳ có số lƣợng đa hình nhiều nhất (95%), trong khi kiểu gen
của Bắc Triều Tiên là thấp nhất (60%). Tần số băng tần trung bình của mồi
trong số các kiểu gen là 0,57 với khoảng từ 0,08-0,99 [24].
Một nghiên cứu mới đây của tác giả Zhang và cộng sự (2017) sử dụng
kỹ thuật ADN lục lạp và kỹ thuật đánh dấu Microsatellite Markers nghiên cứu
sự đa dạng di truyền của loài Michelia yunnanensis Franch ở tỉnh Vân Nam15


Trung Quốc, đã sử dụng 3 cặp dấu hiệu cpADN và 10 cặp đánh dấu
Microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền, tổng số 88 allele cho 10 vị trí đa
hình và 10 haplotypes cho tổng hợp 2,089 bp cpADN. Các quần thể M.
yunnanensis cho thấy sự đa dạng di truyền cao và sự khác biệt về di truyền thấp
( FST = 0.058) [34].
1.5. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở Việt Nam
Trong những thời gian đã qua việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể
mới chỉ tập trung vào một số đặc điểm hình thái, việc xây dựng đƣợc dữ liệu
về đa dạng di truyền ở mức độ phân tử, giúp cho công tác bảo tồn và tái tạo
nguồn gen quý hiếm ở Việt Nam là rất cần thiết.
Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) đã Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên
cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gị Quao, tỉnh Kiên
Giang đã sử dụng 4 mồi A02, A04, A11 và A13 trong phân tích đa dạng di
truyền; kết quả có 49 dấu phân tử đƣợc ghi nhận. Từ đó vẽ đƣợc giản đồ phả
hệ của các giống cây này [5].
Nguyễn Minh Quế (2009), sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để đánh giá mối
quan hệ di truyền của 5 giống dẻ bằng kỹ thuật RAPD tổng số phân đoạn đƣợc
nhân bản ngẫu nhiên là 46 phân đoạn. Trong đó có 14 phân đoạn cho tính đa hình
(chiếm 30,4%) và khơng cho đa hình là 32 phân đoạn (chiếm 69,9%) [16].

Năm 2009, Vũ Anh Đào nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền ở
mức phân tử của 16 giống Đậu tƣơng với 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹ thuật
RAPD tổng số phân đoạn ADN thu đƣợc là 766. Trong phạm vi vùng phân
tích có 56 phân đoạn ADN đƣợc nhân bản trong đó có 21 băng vạch cho tính
đa hình (tƣơng ứng 37,5%) [2].
Phân tích đa dạng di truyền lồi Giổi Xƣơng (Michelia baillonii
(Pierre) Fin. et Gagnep.) bằng chỉ thị phân tử RAPD Và cpSSR, Nguyễn
Hoàng Nghĩa và cs (2010) đã cho thấy các mẫu các xuất xứ Giổi có mối quan
hệ di truyền rất khác nhau (hệ số tƣơng đồng di truyền 30%) và chia thành 4
nhóm chính, quan hệ di truyền khác nhau tới 45%.
16


Nguyễn Thị Pha và cs (2012) đánh giá đa dạng sinh học một số loài
Lan Rừng thuộc chi Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả phân nhóm di
truyền 12 mẫu hoa lan thuộc chi Dendrobium cho thấy, sự khác biệt di truyền
dao động trong khoảng 0 - 42%. Xét ở khoảng tƣơng đồng 59% có thể chia
làm 3 nhóm chính [14].
Năm 2013, phân tích đa dạng di truyền của 7 mẫu lá của loài Du sam
núi đất phân bố tại Sơn La, Du sam đá vôi phân bố tại Bắc Cạn và Cao Bằng,
Trần Ngọc Hải và cs sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên bằng kỹ thuật RAPD đã thu
đƣợc 104 phân đoạn ADN trong đó có 72 loại phân đoạn đa hình và tổng số
thu đƣợc 463 băng ADN đƣợc nhân bản với 239 băng đa hình chiếm 51,6%.
Kết quả nghiên cứu cũng đã xác định đƣợc mức độ đa dạng di truyền giữa 7
các thể nghiên cứu là khá cao đạt từ 0,0866 - 0,4616, thiết lập đƣợc sơ đồ
hình cây biểu diễn mối quan hệ giữa 7 cá thể nghiên cứu trên [4].
Nguyễn Văn Giang và cs (2013) đã nghiên cứu di truyền lồi khoai
mơn - Sọ với 60 mẫu giống thu thập tại các địa phƣơng khác nhau bằng chỉ
thị RAPD và SSRs thu đƣợc kết quả 67 alen đƣợc nhân lên đối với 5 chỉ thị
RAPD, trong đó có 47 alen đa hình chiếm 70,1% và 20 alen đƣợc nhân lên

đối với 5 chỉ thị SSRs, có 9 alen đa hình chiếm 45%. 60 mẫu giống khoai
mơn - sọ đƣợc phân thành 12 nhóm với hệ số tƣơng đồng là 0,8 [3].
Nghiên cứu 20 cá thể của lồi Kim tuyến đá vơi thu thập tại Bát Đại
Sơn và Cán Tỷ thuộc huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang bằng kỹ thuật phân tử
RAPD với 8 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Thơ và cs (2014) nhận thấy 20 cá
thể Kim tuyến đá vơi nghiên cứu có mức độ sai khác di truyền trong khoảng
2-25%, trong đó mức độ sai khác giữa 18 mẫu Kim tuyến đá vôi ở Bát Đại
Sơn là 20-22%, hai mẫu Kim tuyến đá vơi ở Cán Tỷ có mức độ tƣơng đồng di
truyền rất cao (0,98) [18].
Trần Đức Vƣợng và cs (2014), đã đánh giá đa dạng di truyền của 31
cây Lai (Aleurites moluccana (L.) Willd) thuộc 5 xuất xứ khác nhau (Bắc
Cạn, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Gia Lai bằng chit thị RAPD, kết quả
17


cho thu đƣợc 960 băng, kích thƣớc các phân đoạn ADN nằm trong khoảng từ
100 – 950 bp với tỷ lệ băng đa hình dao động từ 53,34 - 64,38% [19].
Năm 2015, Hà Văn Huân và cs đã phân tích đa dạng và quan hệ di
truyền của quần thể Long Não đƣợc trồng thực nghiệm tại trƣờng đại học
Lâm Nghiệp Việt Nam, sử dụng 10 đoạn mồi ngẫu nhiên để phân tích 20 mẫu
Long Não đã thu đƣợc tổng số 631 băng ADN, trong đó có 351 băng đa hình,
trung bình tỷ lệ băng ADN chiếm 55,63%. Hệ số di truyền từng cặp mẫu 69%
- 100%, sự sai khác di truyền giữa các mẫu nằm trong khoảng từ 0 - 31%. Đã
xây dựng đƣợc sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 20 cá thể
Long Não [7].
Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự (2016) đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh
giá đa dạng di truyền quần thể Ba Kích tại Quảng Ninh. Nghiên cứu sử dụng
10 mồi ISSR để đánh giá mức độ đa dạng của 39 mẫu cây ba kích thu tại
Quảng Ninh. Kết quả cho thấy, quần thể nghiên cứu có sự đa dạng về mức độ
phân tử, có 6 mồi có thể sử dụng để đánh giá sự đa dạng ở quần thể cây ba

kích, trong 46 phân đoạn ADN thu đƣợc có 45 phân đoạn đa hình 39 mẫu ba
kích nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm lớn với hệ số tƣơng đồng di truyền
dao động trong khoảng 0,31 đến 0,88 [6].

18


Chƣơng II
MỤC TIÊU - NỘI DUNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung:
Nghiên cứu đa dạng di truyền loài cây Lim Xanh làm cơ sở cho công tác
chọn tạo, nhân giống và bảo tồn nguồn gen của loài.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể:
Đánh giá đƣợc đa dạng di truyền giữa các mẫu Lim Xanh tại khu vực
Núi Luốt – Trƣờng đại học Lâm Nghiệp.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tách chiết ADN tổng số của các mẫu Lim Xanh
- Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích đa dạng di truyền các
mẫu ADN tổng số thu đƣợc với 8 mồi RAPD
- Xây dựng cây phân loại thể hiện mối tƣơng quan di truyền của các
mẫuLim Xanh bằng phần mềm NTSYSpc (Rophlf, 1993).
2.3.Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu gồm 18 mẫu lá Lim Xanh đƣợc thu thập ngẫu
nhiên tại 3 khu vực khác nhau trong quần thể Lim Xanh thuộc Núi Luốt –
Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp. Khu vực 1 (KV1): đƣợc thu thập xung quanh
ngã tƣ 1, chiều cao cây khoảng 8,5-11m; Khu vực 2 (KV2): tại ngã tƣ 2 Núi
Luốt Lâm Nghiệp, cây đang phát triển và có độ tuổi khoảng 3 năm, chiều cao

vào từ 7 - 10 m; Khu vực 3 (KV3): hƣớng ngã tƣ 2 đi lên khoảng 200m, cây
cao từ 18 – 25m, đƣờng kính vào khoảng 25- 30 cm.
Chọn những lá tƣơi tốt, lấy lá bánh tẻ, không bị sâu bệnh, mỗi mẫu lấy
khoảng 4-6 lá, cho vào từng túi nilon riêng, đƣợc bảo quản trong silica gel.
Mẫu thu về đƣợc bảo quản ở tủ -20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp
theo.Các mẫu đƣợc ký hiệu trong bảng 2.1.
19