Khoá luận tốt nghiệp: Xác định vị trí của hai loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (D. costatus) trong họ Dầu Dipterocapaceae ở Việt Nam trên cơ sở giải mã vùng gen matK

MỞ ĐẦU
Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) là những cây rừng phổ biến và đóng vai
trị quan trọng về giá trị sinh thái và kinh tế. Có khoảng trên 45 lồi cây họ Dầu với 6 chi
được tìm thấy ở Việt Nam, phần lớn là cây bản địa và đặc hữu. Do giá trị thương mại và
nhu cầu của người dân địa phương các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức. Hơn nữa,
trong nhiều năm, dưới áp lực tăng trưởng kinh tế nhanh, hậu quả là sự suy giảm diện tích
rừng và tăng mức độ phân cắt của các mảnh rừng còn lại, làm ảnh hưởng đến nơi sống
của cây họ Dầu. Hiện tại, 33 loài cây họ Dầu đang bị đe doạ ở mức độ toàn cầu. Hai loài
cây họ Dầu: Dầu nước (Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (Dipterocarpus costatus) đang
được khai thác sử dụng rộng rãi trong xây dựng và đồ dùng gia đình. Chúng cũng được
sử dụng như là nguồn tinh dầu có giá trị. Chúng cũng được sử dụng vì mục đích thương
mại. Các cây họ Dầu phân bố ở trong rừng mưa nhiệt đới núi thấp ở Việt Nam. Theo xếp
hạng của IUCN tới năm 2004 hai loài cây họ Dầu này đã được đưa vào danh sách các loài
đang bị đe doạ ở mức độ EN A1cd, B1+2c. Ở Việt Nam, do mức độ suy giảm nơi sống và
khai thác quá mức, chúng đều ở mức độ nguy cấp.
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã mở ra một phương pháp
nghiên cứu mới cho phân loại học đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp này sử
dụng các dữ liệu về câu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến
hoá giữa các lồi sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài
và trong phạm vi lồi. Nó ứng dụng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử vào mục
đích nghiên cứu phân loại. Mặc dù mới ra đời nhưng đã sớm trở thành một phương pháp
nghiên cứu rất có hiệu quả. Tuy chưa thể trở thành phương pháp phân loại chính thống,
xong phân loại học phân tử đang hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại. Nhằm phát
triển kỹ thuật phân loại phân tử ở Việt Nam, luận văn này nghiên cứu đề tài: “Xác định vị
trí của hai lồi Dầu nước (Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (D. costatus) trong họ Dầu
Dipterocapaceae ở Việt Nam trên cơ sở giải mã vùng gen matK”. Mục tiêu của đề tài là
nghiên cứu khả năng phân loại bằng các trình tự DNA ngắn, mang thơng tin tiến hố trên
2 lồi cây họ Dầu thuộc chi Dipterocarpus bao gồm D. Costatus và D. alatus, đồng thời bổ
sung mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxa trong chi Dipterocarpus. Kết quả đồng
thời góp phần cung cấp các dữ liệu DNA cho các loài, phục vụ cho việc lưu giữ và bảo
tồn loài tại Việt Nam.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cây họ Dầu trên thế giới
1.1.1 Thực vật học và hình thái
Ashton (1982) phân chia họ Dầu (Dipterocaparceae) thành 3 phân họ (họ phụ ) như sau:
 Dipterocarpoideae: có các lồi gặp ở vùng nhiệt đới châu Á và Malesia, đặc trưng bởi
bao phấn đính gốc, lá đài cùng phát triển thành cánh, quả có 2 hoặc thường 3 ngăn với 2
hạt trong mỗi ngăn.
 Monotoideae: có các lồi của nhiệt đới châu Phi và Madagasca ,có bao phấn lắc lư lá
đài ít phát triển cùng và chỉ đơi khi thành cánh, quả có 2 và ít khi 4 ngăn với 1-2 nỗn
mỗi ngăn.
 Pakaraimoideae: Đặc hữu của vùng cao Guayana, nhiệt đới Nam Mỹ, gần gũi với họ
phụ Monotoideae nhưng có cánh hoa ngắn hơn lá đài và khơng có cuống hoa lưỡng tính,
quả có 4-5 ngăn, mỗi ngăn có 2-4 nỗn.
Một số nhà nghiên cứu hiện nay chia họ Dầu thành 2 họ khác biệt, là họ Dầu
(Dipterocarpaceae B1) với 13 chi và ước khoảng trên 600 lồi, cịn họ kia là:
Monotaceae với 4 chi và khoảng 40 loài. Hiện nay họ Dầu được chia thành 3 phân họ:
Monotoideae (Monotes và Marquesia); Pakaraimaeoideae (Pakaraimeae) và
Pseudomonotoideae (Pseudomonotes).
Các nhà khoa học đề thống nhất là các cây họ Dầu nhóm Pakaraimaea của Nam Mỹ là
cổ xưa hơn các loài Monotoideae ở châu Phi và tiên tiến nhất vẫn là các cây họ Dầu ở
châu Á.
Maury-Lecon và Curtet (1998) cho rằng họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Phân họ
Dipterocarpoideae) là thuần nhất ở châu Á trong khi họ Dầu có 3 phân họ là :
Dipterocarpoideae ở châu Á; Pakaraimaeoideae ở Nam mỹ và Monotoideae ở châu Phi và
Nam Mỹ.
Ashton (1982) và Maury-Lecon và Curtet (1998) mô tả cây họ Dầu châu Á là cây có
nhựa, có kích thước từ nhỏ tới lớn, thường có bạnh vè. Đặc điểm điển hình là lá đơn, mọc
cách với các lá kèm phát triển để bảo vệ chồi và mọi phần của cây được một lớp lơng che

phủ. Hoa tự hình chùy có nhiều chùm. Trên hoa, cánh hoa dài hơn lá đài và có lơng tơ ở
các mức độ khác nhau, đài có 3 hoặc 5 lá đài lớn ra làm các cánh trên quả, tạo thành ống
bao lấy quả hay một phần, hợp sinh hoặc tự do; khi tự do chúng thường xếp gối lên nhau.


Bao phấn thường có hai túi phấn (ít khi 4). Buồng trứng có 3 (ít khi 2) ngăn, mỗi ngăn
chứa 2 noãn. Đặc trưng của cây họ Dầu châu Á về giải phẫu là sự có mặt của các ống
nhựa trong gỗ và các tia gỗ xếp theo nhiều hang về mặt hóa học là sự có mặt của Dầu
nhựa damaranic, các triterpen và sesquiterpen trong nhựa, trong khi đó lại thiếu vắng các
monoterpen.
Đặc điểm hình thái và giải phẫu ở đây có lien quan đến chức năng sinh học và các chức
năng này lại gắn với các quần xã sinh vật và các đặc điểm khí hậu mà chúng ảnh hưởng
đến thụ phấn của hoa, phát tán hat và thụ phấn của hạt.
Ashton (1982) cho rằng nhiều taxon tam bội trong họ Dầu có thể có nguồn gốc lai dưới
lồi, đã nghiên cứu hình thái và phân bố cây lai họ Dầu ở Thái Lan trên cơ sở các mẫu vật
thu thập cho thấy có 3 dạng lai tự nhiên giữa các loài là Dipterocarpus costatus x
D.obtusifolius từ Doi Suthep, Chiang Mai; D.tuberculatus x D.intricatus từ Sakearat và
D.gracilis x D.costatus từ Phangnga.
1.1.2 Phân loại
Maury-Lecon and Curtet (1998) đã liệt kê chi tiết các thông tin lien quan đến phân loại
của cây họ Dầu mà t heo họ có thể có 15, 16 hoặc 19 chi với 4710-480 lồi ở châu Á và
châu Phi với số liệu chưa chắc chắn. Họ cũng đã kết luận những thay đổi lien quan đến
cây họ Dầu là:
 Thiết lập các phân chi Shorea, Anthoshorea, Richetia và Rubroshorea
 Thiết lập 11 nhóm trong Shorea bao gồm cả chi Doona và Pentacme trước đây
 Lập lại chi Vateriosis
 Phát hiện pakaraimaea ở Nam Mỹ
 Phát hiện ra loài Pseudomonotes tropenposi trong phân họ Monotoideae gần gũi với
Monotes và Marquesia châu Phi
Ashton (1982) đã đưa ra tiêu chí cho việc xác định các nhóm phân loại trên lồi đó là:

1, Có ít nhất một cặp tính trạng khơng có quan hê qua lại về chức năng
2, Các tính trạng này phải là chung cho mọi lồi trong nhóm
3, Chúng cũng là những gián đoạn về biến dị giữa các taxon
4, Mục tiêu quan trọng nhất của phân loại là có được sự ổn định về tên gọi.


Kết hợp với những kết quả của Maury-Lecon (1979), cây ho Dầu châu Á có thể được
ghép thành hai nhóm lớn dựa vào sắp xếp cơ bản lá đài trên quả và số nhiễm sắc thể, đó
là:
 Nhóm Valvate-Dipterocarpi: Vateria, Vaterisis, Stemonoporus, Vatica, Cotylelobium,
Upuna, Anisoptera, Dipterocarpus với số lượng cá thể nhiễm sắc cơ bản n=11.
 Nhóm Imbricate-Shoreae: Shorea, Parashorea, Hopea, Balanocarpus với số lượng cá
thể nhiễm sắc cơ bản n=7
Số lượng loài
Châu Á là trung tâm của các loài cây họ Dầu và hiện có nhiều lồi nhất. Ba khu vực đáng
được quan tâm ở vùng này là đảo Borneo, Sumatra và bán đảo Malaixia.
Bảng 1.1 Số loài cây họ Dầu ở châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ
(Maury-Lecon and Curtet,1998)
Vùng/nước
Malesia
*Malaya
* Borneo
* Sumatra
* Philippin
* Sulawesi
*Moluccas
* New Guinea
Đông Nam Á
* Myanmar
* Thái Lan

* Lào
* Cam-pu-chia
* Việt Nam
Nam Á
* Bắc Ấn Độ
* Nam Ấn Độ
* Andamans
* Ấn Độ + Andam
Sri Lanca
Seychelles
Trung Quốc
Châu Phi + Madagaxca

Số chi
10
14
13
11
4
3
3
8
6
8
6
6
6
9
4
5

2
5-6
7
1
5

Số Loài
465
155-168
267-276
106
50-52
7
6
15
76
33
66
20
28
36
58
10
14
8
31
44-45
1
24

Tác giả
Ashton, 1982
Symington, 1943
Symington, 1943
Ashton, 1982
Ashton, 1982
Ashton, 1982
Ashton, 1982
Ashton, 1982
Smitinand et al. 1990
Smitinand et al. 1990
Smitinand et al. 1990
Smitinand et al. 1990
Smitinand et al. 1990
Smitinand et al. 1990
Kostermans, 1992
Jacobs, 1981
Jacobs, 1981
Jacobs, 1981
Tewary, 1984
Ashton, 1977
Parkinson, 1932
Huang, 1973

3

11
49

Xu and Yu, 1982

Shaw, 1973


* Châu Phi
* Madagaxca
Nam Mỹ

3
1
1

48
1
1

Shaw, 1973
Shaw, 1973
Maguire and Ashton 1980

1.1.3 Phân bố và vấn đề bảo tồn gen cây họ Dầu
1.1.3.1 Phân bố
Maury-Lecon và Curtet (1998) đã chia khu phân bố cây họ Dầu châu Á thành 5 vùng
chính:
1, Malesia: Bán đảo Malaixia, Sumatra, Java, quần đảo Sunda, Borneo, Philippin,
Celebes, Moluccas, New Guinea, Bismarck Archipelago
2, Lục địa Đông Nam Á: Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam và Nam
Trung Quốc
3, Nam Á: Ấn Độ, quần đảo Andaman, Bănglađét, Nêpan
4, Sri Lanca
5, Seychelles

Đồng thời, các tác giả này cũng xem xét kỹ lưỡng hai giả thuyết về nguồn gốc địa lý
cây họ Dầu, đó là:
1, Giả thuyết của Aubreville: đề xuất hai trung tâm kỷ Đệ tam cây họ Dầu là (i)
Indo-Malesia có nguồn gốc Laurasia và (ii) Africa-India có nguồn gốc Gondwana.
2, Giả thuyết Vozenin-Serra và Salard-Cheboldaef: xác định các liên kết lục địa
trực tiếp giữa Đông Nam Á và Laurasia và hang loạt các khối nhỏ tách ra khỏi
phần đông bắc của Gondwana, di chuyển qua Tethys và tạo thành quần đảo cùng
với các liên kết tạo mảng Đông Nam Á khác nhau.
Ashton (1982) cho rằng phân bố cây họ Dầu có trung tâm tại Đơng Nam Á và đặc biệt
nhiều rừng mưa Malaixia, khơng tìm thấy lồi họ Dầu chống chịu lửa hoặc dụng lá ở
Malaixia trong khi chúng lại dễ nhận thấy ở lục địa Đông Nam Á trong các rừng cây họ
Dầu rụng lá theo mùa.
Theo Ashaton, cây họ Dầu tập trung ở vùng khí hậu nhiệt đới với lượng mưa bình quân
lớn hơn 1000 mm và mùa mưa dưới 6 tháng, phần lớn các laoif không phân bố trên độ
cao quá 100m so với mục nước biển, New Guinea và Borneo có sự đặc hữu rất cao, theo
thứ tự là 73% của 15 loài ở New Guinea và 59% của 267 loài ở Borneo, trong khi ở bán
đảo Malaixia chỉ là 19% của 156 loài. Các loài phân bố rộng bao gồm các loài chung cho


các vùng khí hậu thay đổi theo mùa, như các loài Shorea assamica, Dipterocarpus
gracilis, D.kerrii và Anisoptera.
Smitinand chia cây họ Dầu ở Thái Lan vào hai loại rừng là thường xanh và rụng lá,
trong đó 5 lồi đại diện cho rừng rụng lá là Dipterocarpus obtusifolius, D.tuberculattus,
D.intricatus, Shorea obtuse và S.siamensis và chúng có thể tìm thấy ở độ cao 1.300 m trừ
D.intricatus.
Theo Thái Văn Trừng (1986) thì De Candolle phát hiện ở châu Phi và Madagaxca có
chi Monotes với 36 loài; sau này Gilg phát hiện them chi Marquasia với một vài lồi,
them 2 mẫu hóa thạch của Dipterocarpus ở Bắc Phi tạo cho họ Dầu có them phân họ mới
là Monotoideae và mở rộng phân bố tới châu Phi. Năm 1977, Naguiro và Ashton lại tìm
thấy ở phía Nam Guyana, châu Mỹ La Tinh một chi độc nhất loại khác là Pakaraimaca và

đặt thành phân họ thứ ba là Pakaraimoideae, song cũng có nhà khoa học Kostermans
khơng nhất trí xếp nhóm này vào họ Dầu.
Về độ cao so với mực nước biển, thong thường các loài cây họ Dầu có phân bố dưới
1000 m, song cũng có một số loài Shorea gặp trên độ cao 1700 m ở Sumatra và loài
Hopea beccariana ở Brunei (Borneo) cụng trên độ cao này.
1.1.3.2 Vấn đề bảo tồn gen cây họ Dầu
Đối với chương trình bảo tồn nguồn gen, đa dạng di truyền ở các lồi cây họ Dầu có thể
được duy trì trong rừng trồng thơng qua thu hái hạt giống. Khi so sánh với các loài cây lá
kim, chúng ta thấy có những khac biệt cần được quan tâm. Cây lá kim thường tạo thành
các quần thụ lớn và thụ phấn nhờ gió, nên khi thu hái hạt, thường chỉ thu hái hạt của 5
cây mẹ cho mỗi vùng là đủ vì nó đảm bảo đa dạng di truyền thơng qua thụ phấn chéo
nhờ gió với nguồn phấn hoa rất phong phú.
Ngược lại, cây họ Dầu cho thấy có một tỷ lệ các cây không thụ phấn chéo và thụ phấn
giữa hai cây mẹ gần nhau vì cơn trùng thường quen thụi phấn cho các cây trong cùng khu
vực trước mà chưa thể bay đi xa. Do vậy, đa dạng di truyền nằm trong lượng hạt thu thập
được chưa đủ đại diện cho cả quần thể như các loài cây lá kim. Để bảo tồn ex situ cây họ
Dầu, nên thu hái hạt từ nhiều cây mẹ cách xa nhau.
1.1.4 Giá trị kinh tế
Các loài cây họ Dầu là nguồn cung cấp gỗ quan trọng của vùng Đông Nam Á cho tiêu
thụ nội địa và xuất khẩu. Gỗ các loài cây họ Dầu được sử dụng vào các cơng trình có cấu


trúc chịu tải lớn như dầm, xà nhà, khung cửa, cầu thang, sàn nhà, thùng xe… Sau khi
được xử lí thuốc bảo quản, chúng còn được dùng làm cột điện, tà vẹt đường sắt, cầu
tàu… Nhiều sản phẩm đồ mộc xuất khẩu của nước ta được chế biến từ gỗ cây họ Dầu
nhập nội. Bên cạnh đó các lồi cây họ Dầu còn làm cây cảnh và cây bong mát trên đường
phố.
Nhiều sản phẩm ngoài gỗ được khai thác từ các loài cây họ Dầu như nhựa – dầu chai
(oleoresin), nhựa cứng (dammar hay hard resin), camphor, mỡ bơ và tannin. Phương pháp
chích nhựa truyền thống đã được áp dụng lâu đời trong đó chi Dipterocarpus cung cấp

dầu nhựa chính trong vùng.
Dầu nhựa gồm chủ yếu là tinh dầu (essential oil và nhựa (réin). Khi trưng cất dầu nhựa
bằng hơi nước, người ta nhận được tinh dầu với hàm lượng đạt 30%-70% tùy theo u
lồi. Thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu là các hợp chất sesquiterpen có tác dụng
diệt nấm, vi khuẩn, và mối mọt. Hợp chất nhựa chứa chủ yếu là các dipterocarpol từ
10%-40% thuộc nhóm triterpennoid, được dùng để sản xuất sơn bong, vécni, sơn dầu.
Dầu nhựa từng là sản phẩm quan trọng ở miền nam và nhiều nước Đông Nam Á khác.
Đầu thế kỷ XX, miền Nam đã khai thác khoảng 1000 tấn dầu nhựa hàng năm từ các loài
cây họ Dầu. Do rừng cây họ Dầu bị tàn phá nên sản phẩm nhựa dầu cũng giảm xuống
nhanh chóng. Năm 1984, Thái Lan khai thác khoảng 1.700.000 tấn dầu nhựa, nhưng đến
năm 1989 chỉ cịn 640.000 lít và năm 1990 cịn 293.000 lít.
Nhựa (dầu chai) chiết xuất từ Dipterocarpus alatus là quan trọng nhất ở khu vực. Nó
được dùng vào cơng nghiệp sản xuất sơn, vécni, sơn mài còn tinh dầu được dùng làm
chất định hương trong nước hoa. Nhụa còn được dùng làm chất chống thấm vỏ thuyền.
Nhựa thanh từ Shorea và Hopea cịn dùng làm đuốc. Ngồi ra hoa của Vatica
diospyroides và Shorea roxburghii có mùi thơm có thể dùng để chế tạo nước hoa.
Tannin thường được chiết xuất từ lá và vỏ cây như vở cây Hopea parviflora,
Dipterocarpus tuberculatus và lá khô của Hopea Odorata.
1.2 Các loại cây họ Dầu ở Việt Nam
1.2.1 Phân loại
Theo các tài liệu đã được công bố, Việt Nam có trên 40 lồi cây họ Dầu thuộc 6 chi,
chưa kể các loài chưa được xác định lại một cách chắc chắn như: Dầu thanh (D.gracilis),


Dầu cà luân hay Dầu ke (D.kerii) mà theo các nhà phân loại nó hiện có thể khơng tồn tại
ở nước ta.
Dựa vào các công bố trước đây và các công bố mới (FIPI, 1996; Phân viện điều tra quy
hoạch II, 1994; Phạm Hoàng Hộ, 1999; Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2003; Trung tâm Tài
Nguyên & Môi Trường, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Viện Sinh Thái & Tài nguyên sinh
vật, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2003) danh sách các loài cây họ Dầu của

nước ta hiện nay gồm các chi sau:


Chi Anisotera



Chi Dipterocarpus : 12 loài



Chi Hopea

: 11 loài



Chi Parashorea

: 2 loài



Chi Shorea

: 8 loài



Chi Vatica

: 8 loài

: 1 loài

Đặc điểm quả cây họ Dầu
Họ Dầu bao gồm các lồi có lá đơn mọc cách, hoa lưỡng tính, quả ngủ phân đều, quả
cịn mang lá đài tồn tại cho đến khi chín rụng. Quả và hạt khó tách rời nhau về phương
diện gây trộng (quả chứa luôn hạt). Có 3 nhóm quả với các chi đặc trưng như sau:


Quả có 2 cánh tồn tại:
Lá đài hình ống : Dipterocarpus (Dầu), Anisoptera (Vên Vên)
Lá đài rời

:Hopea (Sao), Vatica (Táu)



Quả có ba cánh: Shorea (Chai), Pentacme (Cẩm liên)



Quả có năm cánh: Parashorea (Chò chỉ).

1.2.2 Phân bố cây họ Dầu
Dựa vào các tài lệu phân chia thảm thực vật rừng Việt Nam của GS.TS. Thái Văn
Trừng, xét về lượng mưa và điều kiện khơ hạn, có thể chia rừng cây họ Dầu thành 3 vùng
phân bố chủ yếu sau:
* Vùng rừng khơ cây họ Dầu (rừng khộp)

Các lồi chịu được khơ hạn và lửa rừng là lồi Cà chắc (Shorea obtusa), Cẩm lien
(Shorea siamensis), Sến mủ (Shorea roxburghii), Dầu trà beng (D.obtusifolius), Dầu đồng
(D.tuberculatus), Dầu lông (D.intricatus). Đây là những lồi có vỏ dày, 3 lồi sau có vỏ


nứt thành rãnh, rụng lá mùa khô, mọc thuần và chiếm ưu thế ở những vùng đất bằng hay
vùng núi, keo dài từ Ấn Độ qua Myanma, Thái Lan, Lào tới Việt Nam. Đây là lồi rừng
khộp điển hình thường gặp ở Tây Nguyên.
Rừng Săng đá (Hopea ferrea), Sao mạng Cà Ná (Hopea reticulata) ở vùng khô Phan
Rang cũng là một dạng rừng đặc biệt.Bên cạnh hai loài cây họ Dầu thường xanh là Săng
đá và Sao mạng, cịn có Cẩm lien rụng lá mùa khơ, các lồi cây họ Đậu đặc trưng cho
vùng khô.
* Vùng rừng thường xanh/nửa rụng lá mùa khơ
Các lồi cây chủ yếu là thường xanh ít rụng lá hoặc rụng lá một phần.
Ven biển miền Trung tới Đơng Nam Bộ cịn có lồi rừng cây họ Dầu mọc thuần loại
hoặc hỗn giao trên đất cát ven biển. Cây họ Dầu ưu thế là Dầu cát (D.caudatus aff
condorencis) tái sinh tự nhiên tốt, bên cạnh là Sến cát (Shorea roxburghii) cũng mọc
thành quần thụ hoặc dải rác từng cây, ngồi ra Dầu cịn có Dầu nước (D.alatus), Vên vên
(A.costata), Cẩm liên (S.siamensis), Táu duyên hải (Vatica mangachapoi). Có thể gặp
kiểu rừng này ở khu bảo tồn Bình Châu – Phước Bửu (Bà Rịa – Vũng Tàu) và khu bảo
tồn sinh thái Takou (Bình Thuận) và các đám rừng cịn sót lại dọc bờ biển. Ngồi ra cịn
có rừng Chai lá cong (S.falcata) và Sao lá hình tim (Hopea cordata) ở Cam Ranh (Khánh
Hòa), đám rừng Chai lá cong cịn sót lại ở Phú n.
* Rừng kín ẩm thường xanh mưa mùa:
Đây là nơi mà hầu hết cây họ Dầu thường gặp như ở Đông Nam Bộ. Lượng mưa
thường trên 2000 mm với một mùa khô dài ngắn tùy theo vùng. Khơng có những lồi
rụng lá và chịu lửa rừng. Chúng có khuynh hướng mọc thành đám, thành cum như lồi
Vên vên (A.costata), Dầu mít (D.costatus), Dầu song nang (D.dyeri) mọc thành đám ở
vùng Đông Nam Bộ trong khi Sao đen (Hopea odorata) và Dầu nước (D.alatus) mọc
thành quần thụ lớn gọi là “láng dầu”, “láng sao” nhất là nơi mực nước ngầm cao như ven

song, suối hay vùng đất trũng.
Vùng Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng có lượng mưa trên 2000 mm và mùa
khơ ngắn hơn nên cũng có điều kiện cho rừng thường xanh phát triển được. Nơi đây có
Sao đen mọc thành cụm, Dầu dọt tím (D.grandiflorus), Chị đen (Parashorea stellata) và
Kền kền (Hopea pierrei).
1.3 Hiện trạng của cây họ Dầu


Việt Nam là một nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú và đa
dạng, trong đó các loài cây rừng chiếm tỷ lệ đáng kể. Với 20 triệu ha rừng và đất rừng,
khoảng 60% diện tích tồn quốc, đây là nguồn tài ngn vơ cùng q. Tuy nhiên,, trong
những năm gần đây do nhiều nguyên nhân khác nhau mà diện tích rừng ngày càng giảm,
ước tính có khoảng trên dưới 100.000 ha rừng bị mất đi mỗi năm. Chính vì vậy mà việc
bảo tồn nguồn gen cho các loài cây này đang được đặt ra cấp bách.
Trong các loại cây rừng, cây họ Dầu là một trong số những lồi cây có ý nghĩa lớn đối
với hệ sinh thái rừng nhưng chúng cung là loài cây có tỷ lệ phá hủy nhiều.Các lồi cây họ
Dầu (Dipterocarpaceae) đã tạo ra nên một họ thực vật độc đáo và nổi tiếng nhất của vùng
nhiệt đới. Hiện nay, gỗ cây họ Dầu đang chimes thị phần lớn trên thị trường gỗ trên thế
giới nên chúng đang đóng một vai trò quan trọng đối với nhiều nước, nhất là các nước
châu Á mà đặc biệt là các nước Đông Nam Á. Ngồi việc cung cấp gỗ, rừng cây họ Dầu
cịn đem lại nhiều sản phẩm có gia trị khác phục vụ đời sống của con người.
Rừng tự nhiên có cây họ Dầu phân bố đã bị suy giảm mạnh sau nhiều thập niên khai
thác và chuyển mục tiêu sử dụng đất cho cây trồng nông nghiệp. Vào năm 1972 rừng cây
họ Dầu ở Philippin chiếm 15 triệu ha, đến năm 1990 giảm xuống chỉ còn 4,148 triệu ha.
Nghiên cứu phục hồi rừng tự nhiên và các cố gắng trồng lại rừng đã bắt đầu từ lâu ở
nhiều nước song vẫn chỉ là nhỏ lẻ, chưa được khâu nối trên phạm vi tồn cầu và cịn gặp
nhiều hạn chế. Hiểu biết của nhân loại về cây họ Dầu là không nhiều và hầu hết chưa có
nghiên cứu lồi cây họ Dầu nào được nghiên cứu toàn diện ,sâu sắc.
Hiện nay, các loài cây này chủ yếu là ở trong các khu rừng tự nhiên được bảo vệ, khu
bảo tồn đã được quy hoạch.Có những lồi như Chị nâu chỉ cịn thấy như những cá thể

đơn lẻ cịn xót lại ở n Bái, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Cạn. Trong đó có những lồi
khơng cịn tìm thấy ở rừng tự nhiên mà chỉ tìm thấy ở rừng tái sinh như Dầu song nàng.
Theo sách đỏ Việt Nam (1996) chỉ thơng báo có một điểm duy nhất có lồi Sao lá hình
tim đó là Mỹ Ca, nay thuộc phạm vi quân sự không thể tiếp cận. Do tính chất chưa Dầu
nên các cây họ Dầu này thường mất sức nảy mầm vì vậy số lượng cây ngày càng ít.
Vì vậy việc bảo tồn cây họ Dầu nước ta đã trở nên cấp thiết, nhằm mục đích cứu và giữ
lấy nguồn gen vơ cùng phong phú và quý giá này.
1.4 Chi Dipterocarpus


1.5 Đặc điểm sinh học và giá trị bảo tồn của hai loài thuộc chi Dipterocarpus
1.5.1 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus)
Tên khác: Dầu con rái, Dầu con rái trắng, Dầu rái.
Tên khoa học: Dipterocarpus alatus Roxb.ex G.Don
Tên đồng nghĩa:

D.genopterus Turcz
D.incanus Roxb. Ex Kurz
D.philipinensis Foxw.

Chi : Dầu (Dipterocarpus)
Đặc điểm sinh học - sinh thái
Dầu nước là cây gỗ lớn, chiều cao thơng thường 30-35 m, nhưng có khi đạt tới 40-45
m, đường kính ngang ngực đạt tới 250 cm. Dầu rái thường chiếm tầng cao, ưu thế của
rừng. Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp. Cây trước tuổi thành thục có tán lá hình chóp nhưng
khi trưởng thành và già, cây có tán lá hình lọng. Vỏ cây mỏng có màu ám trắng và nhẵn.
Lá đơn mọc cách, lá hình bầu dục hoặc trái xoan, dài 10-20 cm, rộng 5-15 cm; đầu hơi
nhọn; gốc lá hình nêm hay hình trịn. Phiến lá có mầu xanh thẫm ở mặt trên và màu xanh
nhạt, có lớp lơng mịn phủ ở mặt dưới. Gân bên 11-18 đơi. Lá kèm có lơng màu vàng xám
nhạt.

Quả gần hình cầu, có 5 cạnh nổi rõ, đừng kính 1-1,5 cm. Quả có 5 cánh đài nhẵn; hai
cánh to, cánh dài từ 10-14 cm, rộng 1,5-2 cm, xếp song song, có màu đỏ tươi khi quả non
và chuyển thành màu vàng khi quả chin già; 3 cánh nhở có kích thước 1,2-1,4 cm. Mỗi
quả có 1 hạt. Mùa quả chin là tháng 3-4 hàng năm, chin tập chung vào cuối tháng 3 đầu
tháng 4.
Dầu nước thường mọc thành từng đám còn gọi là các “láng dầu” hoặc dải rác ven sông
suối, trong các khu rừng tự nhiên nhiệt đới. Cây thường mọc xen với các loài cây họ Đậu
như Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa), Gụ mật (Sindora cochinchinensis), các loài Cẩm lai
(Dalbergia spp) và các loài cây lá rộng khác. Cây được sắp xếp vào nhóm có tăng trưởng
trung bình, cây 45 tuổi đạt đường kính ngang ngực 0.62 cm/năm và chiều cao vut ngọn
đạt 0.60 m/năm (Phân viện điều tra quy hoạch II, Bộ Lâm nghiệp 1994).
Dầu nước có phân bố rộng khắp Đông Nam Á kéo suốt từ Inđônêxia, Malaixia,
Philipin, Ấn Độ, Myanma, Thái Lan qua Lào và Campuchia sang Việt Nam.


Hiện trạng
Dầu nước chỉ còn gặp nhiều trong các khu bảo tồn đã được quy hoạch và trong những
năm vừa qua,do chiến tranh tàn phá,khai thác quá mức, mà diện tích cây họ Dầu hỗn giao
nói chung và Dầu nước nói riêng đã suy giảm nghiêm trọng. Theo Nguyễn Duy Chuyên
và Ngô An, Viện điều tra quy hoạch rừng (1995), ở thời điểm năm 1959,diện tích rừng có
cây họ Dầu ở Đơng Nam Bộ chiếm 49% diện tích tồn vùng, đến năm 1968 giảm xuống
còn 36%, năm 1982 còn 18% và 1992 chỉ cịn 8%. Xét ở quy mơ quốc gia,tài nguyên di
truyền của loài cây này đã bị suy kiệt mạnh
1.5.2 Lồi Dầu mít (Dipterocarpus costatus)
1.6 Một số phương pháp phân loại thực vật

Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật đều dựa trên nguyên tắc chung
đó là những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chất giống nhau, thực
vật càng gần nhau tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc
điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hố ..., một số phương pháp thường được sử

dụng như:
1.6.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống)

Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì cơ quan
này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay đổi.
Những thực vật càng gần nhau càng có nhiều đặc điểm chung về hình thái. Đây là
phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được dùng phổ biến, hạn chế của
phương pháp này đã được ghi nhận trên một số taxa, thực tế nhiều lồi khác nhau
nhưng có hình thái rất giống nhau và ngược lại. Phương pháp phân loại hình thái
thực sự gặp khó khăn khi phân loại ở các đơn vị taxon dưới loài.
Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu các đặc điểm hình thái nhưng các tính
trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp, nên đôi khi việc xác định sự tương
đồng là rất khó. Hiện tượng tiến hố hội tụ, tiến hố song song và tiến hoá ngược
dẫn đến các đặc điểm tương tự giữa các lồi có họ hàng rất xa nhau, nghĩa là các


đặc điểm giống nhau do tiến hoá độc lập từ các nguồn gốc khác nhau để thích nghi
với điều kiện môi trường giống nhau là khá phổ biến trong sinh giới. Việc phân
biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống
là không dễ dàng, nhất là ở các bậc phân loại thấp. Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp
giữa các bậc phân loại cao là rất khó, vì nhiều đặc điểm khơng cịn khả năng xác
định được sự tương đồng. Vì vậy hệ thống học truyền thống phải sử dụng các đặc
điểm, các khố định loại riêng cho những nhóm sinh vật nhất định. Ưu điểm lớn
nhất của hệ thống học truyền thống là có lịch sử phát triển lâu dài và đã xây dựng
được một hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ, tiện lợi trong nghiên cứu
ứng dụng. Nhưng hệ thống học truyền thống có nhược điểm là thiếu tính thống
nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần và nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn
chế khi nghiên cứu các biến đổi tiến hố nhỏ, khó xác định chính xác mối quan hệ
giữa các nhóm sinh vật ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài.
1.6.2 Phương pháp giải phẫu so sánh

Đến thế kỷ IXX, nhờ sự phát triển của kính hiển vi mà giải phẫu học thực
vật có điều kiện phát triển. Ngồi những đặc điểm hình thái bên ngồi, các nhà
phân loại học cịn sử dụng cả những đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình
thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc bên trong cơ thể, của mô, của tế
bào, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại. Việc sử dụng phương pháp này đã
nhận được các kết quả nghiên cứu chính xác và khách quan cho phân loại thực vật.
Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi khơng
những của các nhóm lớn, mà cả của các bậc taxon nhỏ, có thể xây dựng được
những tiêu chuẩn phân loại cho các chi, các lồi thuộc họ Labiaceae.
Phương pháp giải phẫu so sánh khơng đòi hỏi kỹ thuật quá phức tạp nhưng
cho kết quả khá chính xác. Đối với các lồi cây gỗ thường sử dụng đặc điểm giải
phẫu thân gỗ để định loại, ngược lại các loài thân thảo thường sử dụng đặc điểm
cấu trúc của biểu bì. Phương pháp này được sử dụng để định loại gỗ và các thanh
gỗ thành phẩm dùng để xuất khẩu.
1.6.3 Phương pháp hóa học


Có nhiều phương pháp phân tích hố học khác nhau được sử dụng trong nghiên
cứu và kiểm định nhất là đối với mẫu cây chứa các nhóm chất có hoạt tính sinh
học, các cây chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu...) dùng phương pháp sắc
ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm
chung của phương pháp hóa học là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho các
thơng số về cấu trúc hố học. Ưu điểm của phương pháp này là yêu cầu về tính
nguyên vẹn của mẫu vật không cao. Trên thế giới, phương pháp này đang được sử
dụng nhiều. Ở nước ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một
vài cơ sở.
1.6.4 Phương pháp phân loại học phân tử

Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự khác biệt các

cấu trúc phân tử để đạt được các thơng tin về mối quan hệ tiến hố giữa các lồi.
Kết quả của một phân tích hệ thống phân tử được thể hiện bằng cây phát sinh loài.
Phương pháp phân loại phân tử ra đời vào những năm 1960 với các nghiên cứu
của Emile và công sự (1999), Zuckerkandl , Emanuel Margoliash , Linus Pauling
và Walter M. Fitch. Những nghiên cứu hệ thống học phân tử được thực hiện đầu
tiên của tác giả Charles G. Sibley (nghiên cứu về chim), Herbert và cộng sự
(nghiên cứu về lưỡng cư) và Morris Goodman (nghiên cứu về linh trưởng) được
phát triển tiếp bởi các nhà nghiên cứu Allan C. Wilson, Robert K. Selander, John
C. Avise và đã thu được những thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề trong
phân loại và tiến hoá. Phân loại học phân tử được sử dụng ban đầu là phân tử
protein, với kỹ thuật điện di protein. Mặc dù khi thực hiện cách này đã không đem
lại nhiều hiệu quả xong đã thúc đẩy sự phát triển của phân loại học phân tử. Giai
đoạn từ 1974 – 1986, phân loại học phân tử chuyển sang sử dụng các đặc điểm của
vật chất di truyền (DNA) với kỹ thuật ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến là các
kỹ thuật phân tích bằng enzyme giới hạn và cuối cùng là kỹ thuật đọc trình tự
DNA.
Nguyên lý của phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa trên
nguyên lý mỗi sinh vật sống đều mang các phân tử DNA, ARN và protein, các


sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng cao trong cấu trúc phân tử
những chất này, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa nhau sẽ cho thấy những
đặc điểm cấu trúc khác nhau. Hiện nay, các phân tử có tính bảo thủ như DNA ty
thể, DNA lục lạp đang được sử dụng nhiều nhất cho phân loại và được coi là tích
luỹ các đột biến theo thời gian. Thêm vào đó nếu coi tốc độ đột biến không đổi,
chúng ta sẽ tạo ra được một đồng hồ phân tử cho biết thời gian diễn ra các đột
biến, nói cách khác chúng ta có thể ước lượng được thời gian hình thành lồi. Mặc
dù phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng đặc điểm cấu trúc của
các phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, tuy nhiên mãi cho đến
những thập kỷ gần đây, con người mới có khả năng tách chiết và xác định được

cấu trúc phân tử của những chất này.
Sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự DNA của Maxam – Gilbert (1977, 1980)
và Singer (1977) đã mở ra một ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử. Hiện
nay phân tích hay được sử dụng trong phân loại học phân tử là so sánh trình tự
DNA, sử dụng kỹ thuật sắp xếp phân tử (alignment) để xác định mức độ giống
nhau. Các biến đổi phân tử đơn giản hơn nhiều so với các biến đổi hình thái, vì vật
chất di truyền DNA chỉ cấu thành từ 4 loại nucleotide (adenine, guanine, thymine
và cytosine). Mặc khác, các biến đổi phân tử ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi
trường. Ưu thế lớn nhất của hệ thống học phân tử là có thể phân biệt rõ ràng các
đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự (Avise, 1994). Ngoài ra, nhiều phần
của vật chất di truyền có nguồn gốc và kiểu biến đổi chung cho mọi sinh vật, nên
có thể so sánh trực tiếp bất kể nhóm sinh vật nào với nhau. Các biến đổi tiến hoá
nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền giữa các quần thể sinh vật cũng thể
hiện qua các biến đổi phân tử rõ hơn so với các biến đổi hình thái.
Tính thống nhất cao là một trong những ưu điểm của hệ thống học phân tử,
sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho cả sinh giới, có lợi thế trong nghiên cứu
biến đổi tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao trong phân tích quan hệ
phát sinh chủng loại giữa các taxon ở bậc phân loại thấp, cũng như đa dạng di


truyền quần thể. Nhược điểm chính của hệ thống học phân tử là không tiện dụng
khi nghiên cứu và ứng dụng trong tự nhiên và hiện chưa hình thành một hệ thống
phân loại riêng.
Sự kết hợp giữa hai hệ thống phân loại phân tử và phân loại truyền thống sẽ
đem lại kết quả tốt nhất. Thực tế cũng chứng minh rằng hầu hết những gì hệ thống
học truyền thống đã giải quyết tốt, đều không mâu thuẫn với các kết quả nghiên
cứu của hệ thống học phân tử (Avise, 1994). Phân tích phân tử thường được sử
dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống cịn gặp khó khăn,
trong khi chỉ thị phân tử có lợi thế hơn. Hiện tại, hệ thống học phân tử là phương
pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống và cho kết quả khá

tin cậy.
1.7 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật
1.7.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp

Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae),
chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 10 2 – 104 bản sao trong mỗi tế bào.
Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyll) và là nơi thực hiện quá trình quang
hợp của cây. Genome lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc
tính di truyền theo dịng me, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ
đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng là sự
tích luỹ các đột biến theo thời gian, do vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hố giữa các lồi.


Hình : Hệ gen lục lạp của Arabidopsis Thaliana (Theo Sato et al., 1999)

Genome lục lạp (cpDNA) thực chất là một phân tử DNA vịng, sợi đơn,
mỗi gen thường khơng lặp lại. Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ
mã hoá cho các protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện
những protein này. Vùng DNA khơng mã hố trên hệ gen lục lạp là rất ít.
Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120 kb – 220 kb (hình 1.1), kích
thước này thay đổi do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau (Inverted
repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC).
Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi
một số gen di trú vào DNA nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp
có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn
khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong
nghiên cứu phân loại.
Hiện nay, các gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống
học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm psbA - trnH, tất cả
các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi khơng lớn hơn 2% giữa

các loài lân cận.
Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại
(Shaw et al, 2005). Vùng này có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành
cơng rất cao (100% với các lồi đã được nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự
nucleotide giữa các loài là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00 –
0.08% (Kress et al, 2005). Trình tự psbA - trnH cũng đã được cơng bố trên ngân
hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản
(liverwort).
Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất làm DNA
barcoding cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã


thu được sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ
92 – 100% (Mort et al., 2001).
Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine trong lục lạp, có
kích thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đâu. Gen này được sử dụng
nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử. Các kết quả thu được trong các nghiên
cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu
ích cho phân loại.
Ngồi các locus được nêu trên, các vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm trnL –
trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng cho phân tích.
Việc sử dụng mỗi đoạn gen cho những ưu nhược điểm khác nhau, kết quả phân
loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen.
1.7.2 Vùng ITS nhân

Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho
ribosome nhân gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (hình 1.2). Giữa các đơn vị
gen có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ
bản. Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen
nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer)

.


Hình: . Sơ đồ vùng gen ITS

Trong các nghiên cứu phân loại thực vật ở mức độ loài, vùng ITS là locus
được giải mã phổ biến nhất (Alvarez et al, 2003). Vùng ITS cho thấy có sự hiệu
quả cao trong nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật và nấm (ngoại trừ
dương xỉ), và đây là một locus được kiến nghị làm vùng DNA barcode cho thực
vật (kỹ thuật nhận biết các lồi sử dụng trình tự DNA ngắn) (Stoeckle et al, 2003).
Ở mức độ lồi, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần
gũi) và đã được chứng minh trong hầu hết các nghiên cứu. Thuận lợi của vùng ITS
là có thể nhân bản theo hai đoạn nhỏ hơn (ITS1 và ITS2) nằm hai bên với locus
5,8S, điều này rất có ý nghĩa khi nhân bản các mẫu bị hư hại. Vùng ITS cũng đã
được chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên trong loài (Baldwin et al, 1995).
Ngày nay với sự hiện diện của trên 60.000 trình tự ITS (tính đến 8/2010)
được công bố trên ngân hàng Genbank, đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra
những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định, số lượng các trình tự
vẫn tiếp tục được bổ sung hàng ngày.
1.8 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong nghiên cứu phân loại
1.8.1 Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Mullis và cộng sự mô tả
lần đầu tiên năm 1985 đã góp phần tạo nên một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử.
Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần lượng
mẫu ban đầu rất hạn chế (cỡ 10 -3µg). Kỹ thuật này có độ nhạy cảm rất cao và được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh, trong di truyền quần thể
và phân tích pháp y.
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn biến tính: ADN được biến tính ở nhiêt độ khoảng 92 0C-950C trong

khoảng thời gian từ 1-5 phút. Khi đó các liên kết hydro bị đứt ra và sợi ADN kép được
tách thành 2 sợi đơn.
+ Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 30 0C - 650C trong khoảng 30 giây đến 1 phút,
thì các cặp mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở 2 đầu đoạn ADN


cần nhân. Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, được tính tốn dựa vào
nhiệt độ nóng chảy Tm (Melting Temperature) của đoạn mồi.
Cơng thức tính nhiệt độ nóng chảy của đoạn mồi:
Tm = [4(G + C) + 2(A +T)]0C
Trong đó:
(G+C) là số nucleotit Guanine và Cytosine của trình tự mồi.
(A+T) là số nucleotit Adenine và Thymine của trình tự mồi.
+ Giai đoạn tổng hợp ADN: Ở nhiệt độ 72 0C trong khoảng thời gian từ 30 giây
đến vài phút, tùy thuộc đoạn ADN cần nhân bản. Khi đó enzyme Taq polymerase hoạt
động và q trình tổng hợp diễn ra trên những đoạn ở giữa vị trí của cặp mồi theo chiều từ
5’-3’.
Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR rất hữu hiệu cho việc xác định trình tự
nucleotit của các đoạn ADN được nhân, có thể sử dụng PCR để tách dịng đặc hiệu, nó
giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích gen từ các tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu
quá trình tiến hóa ở mức độ phân tử. Thậm chí giúp phục hồi những gen đã tồn tại cách
đây hàng chục triệu năm.
1.8.2 Kỹ thuật thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kít tinh sạch QIAEX II của hãng QIAGEN. Quy
trình này được thiết kế để tách chiết đoạn ADN có chiều dài từ 40bp đến 50kb từ Gel
agarose.
1.8.3 Đọc trình tự nucleotide
Phương pháp giải trình tự hiện nay được dùng phổ biến là phương pháp Dideoxy hay
còn gọi là phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) là một phương pháp
xác định trình tự ADN được Frederick Sanger phát triển vào năm 1975.

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme
ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN. Enzyme ADN polymerase xúc tác gắn
các nucleotit vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, khi
gặp nucleotit khơng có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của
phương pháp là sử dụng các loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN
một cách ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng đoạn ADN mồi là đoạn ADN mạch đơn có
kích thước 20 nucleotit.


Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có ADN khn, ADN
mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm
và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại
ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau. Các dideoxynucleotit bị mất 2
nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi mạch ADN đang tổng hợp bị
gắn 1 ddNTP thì khơng có nhóm 3'-OH ở nucleotit cuối cùng nên mạch đang tổng hợp
không được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Chính do lượng ddNTP được
đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được
sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp ADN dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp được các
đoạn nucleotit có kích thước dài ngắn khác nhau. Để xác định trình tự, người ta điện di
kết quả thu được trên gel polyacrylamit. Các đoạn oligonucleotit có kích thước khác nhau
sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel. Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình
phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn ADN bằng các vạch trên bản gel.
Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotit của đoạn gen.
Giải trình tự trên máy phần lớn tuân thủ theo các bước cơ bản như sau:
1) Chạy PCR để khuếch đại gen hoặc đoạn ADN mong muốn từ hệ gen của sinh
vật
2) Làm sạch sản phẩm PCR thu được, thường dùng là kít.
3) Chạy phản ứng Sequencing theo kit hỗ trợ của từng hãng bán máy.
4) Làm sạch sau phản ứng Sequencing có thể bằng cồn theo phương pháp truyền
thống hoặc bằng kít của hãng.

5) Chạy giải trình tự trên máy giải trình tự tự động.
1.9 Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử

Ngoài nước: trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang
được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa
dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân
tích DNA. Các chỉ thị AFLP (đa hình các đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độ
dài các đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình các đoạn được nhân bản ngẫu nhiên),
SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản
genome lục lạp), gen mã hoá 18S rRNA,… hay được sử dụng để đánh giá đa
dạng di truyền, nhận dạng các đoạn DNA hoặc các trình tự đặc trưng cho loài.


Với số lượng bản sao lớn trong hệ gen là điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR
(phản ứng chuỗi polymerase) với các cặp mồi (primers) thích hợp.
Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) đã lưu giữ
trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là (1) số liệu về
trình tự các nucleotit rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho
đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự
nucleotit đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn
đa dạng di truyền, trong nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì
nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể,
giữa cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác
lồi, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật khơng cịn ngun vẹn mà vẫn
xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết
quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi
trường hay con người gây ra.
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là
công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới,

giải quyết các nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di
truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hố của nhiếu lồi động thực vật và vi
sinh vật (Avise, 1994). Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp
phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và
khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt
Nam (Phillip, 1997).
Do có giá trị sử dụng và thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền
đối với một số loài cây gỗ quý của chi Dalbergia sử dụng các chỉ thị RAPD,
cpSSR, AFLP... cũng được nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu. Chẳng hạn,
Olivarimbola và cộng sự (2004) đã dựng mối quan hệ di truyền của 122 cá thể loài
Dalbergia monticola của Madagascar bằng việc phân tích với 60 chỉ thị RAPD và
03 chỉ thị cpSSR, kết quả nhận được cho thấy các quần thể cây ở vùng trung tâm
phía Bắc có nguồn gốc từ vùng Holocene của phía Nam. Tương tự, các nhóm tác
giả ở Pháp, Ấn Độ, Brasil... cũng đã sử dụng các chỉ thị RAPD, SSR... để nghiên
cứu mối quan hệ di truyền giữa các lồi, các quần thể và xác định trình tự các đoạn
gen đặc trưng cho một số loài cây thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Rout et al., 2003;


Benedic et al., 2006; Subhash et al., 2004; Juchum et al., 2007). Vì thế, riêng đối
với chi Dalberrgia trong ngân hàng Genbank cũng đã lưu dữ hàng trăm trình tự
nucleotit đặc trưng cho một số loài ở một số quốc gia (trang Web NCBI). Đây là
nguồn dữ liệu có giá trị để chúng tơi có thể khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi
này của Việt Nam.
Trong nước: nhìn chung, các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ
công tác bảo tồn đa dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm
và phát triển. Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước
tiếp cận. Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu DNA có tính hệ thống cao
mới được thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cho một số lồi
động vật q hiếm. Cịn đối với thực vật thì hầu như chưa có, hơn nữa trong thực
tế, sự tồn tại phân bố của nhiều lồi ở dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng

nguồn gen rất lớn mà chưa được nghiên cứu.
Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA ở thực vật đã và đang được
tiến hành nghiên cứu ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam,
Trường Đại học Lâm nghiệp và Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, nhưng mới chỉ
tập trung được vào vài đối tượng cây trồng (cây lạc, lúa, một số loài hoa lan, một
số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh và Giổi). Mặc dù các nghiên cứu
mới chỉ tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể nhưng cũng rất có
giá trị cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hoá và tái tạo nguồn gen.
Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa
dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã đạt
được nhiều kết quả có giá trị. Đối với một số lồi động thực vật là nhóm nghiên
cứu của Nơng Văn Hải đã dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ và
giám định DNA một số loài lan Hài, cây Bình vơi, chim (gà Lơi), cá (cá Vược) và
đã phát hiện ra mức độ tiến hóa của chúng. Hay nhóm tác giả của Đặng Tất Thế
(2003-2006) cũng sử dụng các nhóm gen này để phân tích sự tiến hóa phân tử và
phát sinh chủng loại của một số lồi thú, bị sát q hiếm của Việt Nam. Nguyễn
Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội và cs (2005) đã dùng chỉ thị ISSR và cpSSR để
nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài chi họ Dầu và Lạc của Việt Nam. Hay
nhóm tác giả của Nguyễn Minh Tâm đã dùng các chỉ thị SSR để đánh giá đa


dạng nguồn gen cây Vạn tuế của Việt Nam làm cơ sở cho công tác bảo tồn đa
dạng di truyền.
Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần
vào việc phân loại mẫu thực vật đang cịn rất ít. Đặc biệt đối với nhóm cây rừng
nói chung và lồi gỗ q có nguy cơ truyệt chủng nói riêng nên cần tập trung
nghiên cứu có hệ thống.

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU