Nghiên cứu một số tính chất phân tử của bệnh ung thư vòm họng ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LAO ĐỨC THUẬN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT PHÂN TỬ CỦA
BỆNH UNG THƯ VÒM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh - Năm 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LAO ĐỨC THUẬN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT PHÂN TỬ CỦA BỆNH
UNG THƯ VÒM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 62420201
Phản biện 1: TS. BS. Đặng Huy Quốc Thịnh
Phản biện 2: TS. BS. Đỗ Đức Minh
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Bảo Quốc
Phản biện độc lập 1: PGS. TS. Nguyễn Đình Thắng
Phản biện độc lập 2: TS. Trần Gia Bửu
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy
2. TS. BS. Nguyễn Hữu Dũng

MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... v
LỜI CÁM ƠN ................................................................................................................vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... xv
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... xviii
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.

Định nghĩa, dịch tễ ung thư vòm họng ......................................................................1

1.1.1.

Định nghĩa .........................................................................................................................1

1.1.2.

Dịch tễ ................................................................................................................................1

1.1.3.

Các nguyên nhân của UTVH .......................................................................................3

1.1.3.1. Yếu tố môi trường ...........................................................................................................4
1.1.3.2. Yếu tố nhiễm: sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus ............................................5
1.1.3.3. Yếu tố di truyền ...............................................................................................................5

1.2.

Sinh học phân tử - bộ gene của Epstein-Barr virus ................................................7

1.3.

Tan và tiềm tan của EBV ..............................................................................................9

1.4.

Chức năng các gene của EBV ....................................................................................11

1.4.1.

EBNA-1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1) .............................................................12

1.4.2.

EBNA-2 (Epstein-Barr nuclear antigen-2).............................................................15

i


1.4.3.

LMP-1 (Latent membrane protein-1).......................................................................16

1.4.4.

LMP-2 (Latent membrane protein-2).......................................................................22

1.5.

Epigenetic: cơ chế thứ nhất – Sự methyl hóa bất thường trên các gene ức chế

khối u

............................................................................................................................................23

1.5.1.

Con đường tín hiệu RAS và RASSF1A (Ras association domain family 1

isoform A) ........................................................................................................................................30
1.5.2.

DAPK (Death Associated Protein Kinases) - nhân tố điều hịa con đường tín

hiệu apoptosis và cơ chế tự thực bào (autophagy) ................................................................34
1.5.3.

ZMYND-10 (MYND-type containing 10, Blu) – nhân tố điều hịa chu trình

tế bào

............................................................................................................................................37

1.5.4.

p16INK4α: điều hịa chu trình tế bào ...........................................................................39

1.6.

Epigenetic: cơ chế thứ hai - sự biểu hiện của microRNA ............................ 41

1.6.1.

Quá trình sinh tổng hợp miRNA ...............................................................................42

1.6.2.

Cơ chế điều hòa của miRNA......................................................................................45

1.6.3.

miRNAs biểu hiện trong ung thư vòm họng ..........................................................48

1.6.3.1. MiR-155 ...........................................................................................................................50
1.6.3.2. MiR-21 .............................................................................................................................51
1.6.3.3. MiR-141 ...........................................................................................................................52
1.7.

Tình hình nghiên cứu về sinh học phân tử UTVH tại Việt Nam......................52

Chương 2. Vật liệu, phương pháp nghiên cứu
2.1.

Y Đức - thu nhận mẫu nghiên cứu ............................................................................53

2.2.

Quy trình tách chiết DNA từ mơ, dịch phết ...........................................................54

ii


2.3.

Quy trình tách chiết RNA ...........................................................................................55

2.4.

Phương pháp PCR và realtime PCR khảo sát tính chất hiện diện và biểu hiện

của các gene mục tiêu ...................................................................................................................56
2.5.

Phản ứng bisulfite và phản ứng Nested-Methylation specific PCR ................59

2.6.

Phương pháp tách chiết miRNA và phát hiện miRNAs .....................................62

2.7.

Thống kê, phân tích số liệu thực nghiệm ................................................................63

Chương 3. Kết quả và biện luận
3.1.

Đặc điểm bộ mẫu nghiên cứu.....................................................................................65

3.2.

Khảo sát sự hiện diện, biểu hiện của các gene mục tiêu EBNA-1, EBNA-2,

LMP-1 và LMP-2 ...........................................................................................................................69
3.2.1.

Phân tích các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................................69

3.2.2.

Kết quả phân tích sự hiện diện của EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và LMP-2 ....75

3.2.3.

Phân tích sự biểu hiện của các gene mục tiêu EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và

LMP-2 ............................................................................................................................................89
3.3.

Khảo sát tính chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u: RASSF1A, p16INK4α,

DAPK, ZMYND-10 ......................................................................................................................105
3.3.1.

Phân tích các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ...............................................105

3.3.2.

Kết quả phân tích sự methyl hóa trên các gene ức chế khối u ZMYND-10,

p16INK4α, RASSF1A và DAPK ...................................................................................................113
3.4.

Khảo sát tính chất biểu hiện miR-21, miR-141 và miR-155 trên bệnh nhân

UTVH 129
3.5.

Tính chất phân tử trên các mẫu mơ sinh thiết giai đoạn bệnh sớm ................141

Chương 4. Kết luận và đề nghị
iii


4.1.

Kết luận ..........................................................................................................................144

4.2.

Kiến nghị .......................................................................................................................145

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ......................................................... 146
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 151
PHỤ LỤC 1. GIẤY CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG
NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC BỆNH VIỆN CHỢ RẪY........................................ 190
PHỤ LỤC 2. PHIẾU ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU ................................ 195

PHỤ LỤC 3. DANH SÁCH MẪU SINH THIẾT UNG THƯ VÒM HỌNG - KẾT
QUẢ THÍ NGHIỆM .................................................................................................. 196
PHỤ LỤC 4. DANH SÁCH MẪU LÀNH DỊCH PHẾT VỊM HỌNG - KẾT QUẢ
THÍ NGHIỆM ............................................................................................................ 204
PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP .............................................. 213

iv


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập của cá nhân tôi,
được sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy và TS. BS. Nguyễn Hữu
Dũng. Các kết quả nghiên cứu, phân tích trong trong luận án là chưa từng được cơng bố
ở bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác. Luận án này do chính bản thân tơi biên soạn,
khơng sao chép từ bất kỳ cơng trình khoa học, bài viết của cá nhân hay tổ chức nào khác.
Trong q trình viết bài có sự tham khảo các tài liệu được trích dẫn nguồn gốc rõ ràng.
Tơi chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
Nghiên cứu sinh

Lao Đức Thuận

v


LỜI CÁM ƠN
Luận án này không chỉ là kết quả của một q trình khơng ngừng nổ lực của bản
thân mà còn được sự hướng dẫn, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và người thân.
Chân thành cám ơn hai Thầy Cô hướng dẫn: PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy và TS.
BS. Nguyễn Hữu Dũng đã hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, phương pháp và kinh
nghiệm nghiên cứu trong suốt quá trình thực hiện luận án. Đồng thời, chính Thầy Cơ đã

là những người ln khơi gợi và giữ vững niềm đam mê nghiên cứu trong bản thân tôi,
luôn động viên, ủng hộ tôi trong học tập, công việc và cuộc sống.
Trân trọng cám ơn TS. BS. Nguyễn Trọng Minh - Trưởng phòng khám Tai Mũi
Họng, Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh và các Anh Chị hiện đang cơng tác
tại phịng khám đã cung cấp mẫu nghiên cứu, rất nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q
trình thực hiện luận án.
Chân thành cám ơn sự hỗ trợ kinh phí thực hiện của Bộ Giáo Dục và Đào Tạo,
Sở Khoa Học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ
Chí Minh thơng qua các đề tài nghiên cứu khoa học.
Trân trọng cám ơn sự giúp đỡ, góp ý và ủng hộ của:
-

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

-

Ban Giám Đốc Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh.

-

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia
Thành phố Hồ Chí Minh

-

Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Mở Thành phố
Hồ Chí Minh.

-

Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa
Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.

vi


-

PGS. TS. Đặng Thị Phương Thảo, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học phân
tử và môi trường - Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại Học
Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.

-

Các Thầy Cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ
Chí Minh.

-

Các Thầy Cơ Khoa Sinh học và Cơng nghệ sinh học, Phịng Đạo tạo Sau Đại
Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ
Chí Minh.

-

Các Thầy Cơ đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian đi
học.

-

Các Anh chị em phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại Học Mở
Thành phố Hồ Chí Minh.

Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn Ngoại, Bố Mẹ và em đã luôn là chỗ dựa tinh
thần vững chắc, và ln động viên, ủng hộ trong suốt q trình học tập.

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CDK

Cyclin Dependent Kinase

CDKN2A

cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

DAPK

Death-associated protein kinase

DNA

Deoxyribose Nucleic Acid

DNMTs

DNA methyltransferases

EBERs

Epstein-Barr virus (EBV)-encoded small
RNAs

EBNAs

Epstein-Barr nuclear antigens

EBV

Epstein-Barr Virus

F primer

Forward primer

GAPDH

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

HLA

Human Leukocyte Antigen Gene

LMPs

Latent membrane protein 1

MI

Methylation Index

miRNA, miR

MicroRNA

MSP

Methylation-Specific PCR

NC

Negative control

Mồi xuôi

Chứng âm

viii


Nested-MSP

Nested-Methylation-Specific PCR

NPC

Nasopharyngeal carcinoma

Ung thư vòm họng

OR

Odds ratio

Tỷ suất chênh

PC

Positive control

Chứng dương

PI

PCR Index

Pre-miR

Precusor miRNA

PTEN

Phosphatase and tensin homologue

R primer

Reserve primer

RAS

Ras-signalling pathway

RASSF1A

Ras association domain family 1 isoform A

RNA

Ribose Nucleic Acid

RPI

Realtime-PCR Index

RR

Relative risk

Nguy cơ tương đối

Se

Sensitivity

Độ nhạy

Sp

Specificity

Độ chuyên biệt

TR

Terminal Repeat

Lặp lại vùng cuối

UTR

Untranslated region

Vùng khơng dịch mã

Mồi ngược
Con đường tín hiệu
RAS

ix


Ung thư vòm họng

UTVH
ZMYND-10

Zinc Finger MYND-Type Containing 10

β-actin

Beta-actin

κ

Kappa value

Giá trị Kappa

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc họng và vị trí khối u vịm họng
Hình 1.2. Tỷ lệ mắc bệnh của sáu loại ung thư phổ biến ở Việt Nam
Hình 1.3. Sơ đồ mơ tả các ngun nhân chính của UTVH
Hình 1.4. Bộ gene của EBV
Hình 1.5. Sự tăng biểu hiện IL-10 bởi sự tái hoạt động của EBV sang chu kỳ tan
Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc protein EBNA-1
Hình 1.7. Cấu trúc vùng oriP của plasmid EBV
Hình 1.8. Cấu trúc của protein USP7 và vị trí TRAF nằm ở đầu N
Hình 1.9. Con đường điều hịa tín hiệu của EBNA-2/ Notch
Hình 1.10. Cấu trúc protein LMP-1
Hình 1.11. LMP-1 hoạt hóa con đường tín hiệu NF-κB khơng kinh điển
Hình 1.12. Con đường tín hiệu JNK: LMP-1 methyl hóa vượt mức gene ức chế khối u
E-cadherin.
Hình 1.13. Cấu trúc khác biệt giữa LMP-2A và LMP-2B
Hình 1.14. Cơ chế hóa học của DNMTs xúc tác cho q trình methyl hóa
Hình 1.15. Sự methyl hóa/ khơng methyl trên gene ức chế khối u ở tế bào bình thường

và tế bào ung thư
Hình 1.16. Vai trị của DNMT1, DNMT3 liên quan đến việc hình thành, duy trì tính chất
methyl hóa trên phân tử DNA
Hình 1.17. Tần số methyl hóa vượt mức, giảm methyl hóa ở các loại ung thư khác nhau
Hình 1.18. Con đường tín hiệu RAS (Ras-signalling pathway)

xi


Hình 1.19. Cấu trúc protein của các thành viên RASSF
Hình 1.20. Cấu trúc protein DAPK
Hình 1.21. Con đường tín hiệu apoptosis và sự tự thực bào cảm ứng bởi DAPK
Hình 1.22. Sơ đồ cấu trúc các exon ở hai dạng isoform của protein ZMYND10
Hình 1.23. Mơ hình cho cơ chế methyl hóa vùng promoter gene ZMYND10 bởi sự tương
tác của nhân tố E2F
Hình 1.24. Con đường tín hiệu p16INK4α/Rb trong điều hịa chu trình tế bào
Hình 1.25. Cấu trúc phân tử Drosha ở người
Hình 1.26. Cấu trúc của phân tử Dicer
Hình 1.27. Con đường sinh tổng hợp miRNAs
Hình 1.28. Vai trị của miRNA
Hình 1.29. Sự bắt cặp giữa mạch “guide” của miRNA với mạch mRNA mục tiêu
Hình 2.1. Nguyên tắc biến đổi bisulfite: chuyển Cytosine thành Uracil
Hình 2.2. Cơ chế phản ứng MSP
Hình 2.3. Nguyên tắc phản ứng Nested-MSP
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra tính chuyên biệt các cặp mồi khuếch đại các gene mục tiêu
EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2 và chứng nội Beta-actin, GAPDH
Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gene (A) (a) EBNA-1, (b) EBNA-2, β-actin; (B) (a) LMP1, (b) LMP-2, β-actin.
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự (thể hiện một phần) của các gene mục tiêu (A) EBNA-1;
(B) EBNA-2; (C) LMP-1; (D) LMP-2

xii


Hình 3.4. Kết quả phân tích Real-time RT-PCR của gen mục tiêu: (A) EBNA-1, (B)
EBNA-2; (C): LMP-1; (D) LMP-2; (E) GAPDH
Hình 3.5. Sự biểu hiện của gene mục tiêu và gene chứng nội trên mẫu bệnh và mẫu lành
Hình 3.6. Tính chất biểu hiện của các gene mục tiêu EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và LMP2 giữa các giai đoạn bệnh
Hình 3.7. Mối liên hệ giữa EBV và các đặc điểm UTVH
Hình 3.8. Kết quả phân tích các cặp mồi khảo sát sự methyl hóa trên các gene ức chế
khối u.
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP trên gene ZMYND-10 trên một số mẫu
sinh thiết mơ UTVH
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP trên gene DAPK trên một số mẫu sinh
thiết mơ UTVH
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP trên gen RASSF1A trên một số mẫu
sinh thiết mơ UTVH
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm Nested-MSP trên gene p16INK4α trên một số mẫu
sinh thiết mô UTVH
Hình 3.13. Kết quả giải trình tự sản phẩm hypermethylation của các gene ZMYND-10,
DAPK, RASSF1A và p16INK4α
Hình 3.14. Kết quả giải trình tự sản phẩm khơng hypermethylation của các gene
ZMYND-10, DAPK, RASSF1A và p16INK4α
Hình 3.15. Kết quả khuếch đại gene chứng nội U6snRNA ở các mẫu thí nghiệm (A) chu
kỳ khuếch đại; (B) Đường cong nóng chảy của gene U6snRNA
Hình 3.16. Kết quả Real-time RT-PCR (A) miR-155, (B) miR-21, và (C) miR-141 trên
một số mẫu thực nghiệm
xiii


Hình 3.17. Sự biểu hiện của miR mục tiêu và gene chứng nội trên mẫu bệnh và mẫu lành

Hình 3.18. Tính chất biểu hiện (Ct) của các miR-21, miR-141 và miR-155 ở các giai
đoạn bệnh UTVH

xiv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc UTVH và tỷ lệ tử vong do UTVH ở các Châu lục trên thế giới ghi
nhận vào năm 2018
Bảng 1.2. Sự tương quan giữa các yếu tố nguy cơ với UTVH
Bảng 1.3. Chức năng một số protein mã hóa từ các gene của EBV
Bảng 1.4. Tóm tắt chức năng của các vùng domain phân tử LMP-1
Bảng 1.5. Các gene ức chế khối u bị methyl hóa vượt mức định vị tại vùng nhiễm sắc
thể 3p
Bảng 1.6. Cơ sở dữ liệu một số miRNAs biểu hiện bất thường trong UTVH
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng của PCR
Bảng 2.2. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng của PCR
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng của Reverse Transcriptase PCR
Bảng 2.4. Sơ đồ nhiệt của phản ứng của Reverse Transcriptase PCR
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng Realtime PCR
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime định lượng gene mục tiêu
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng biến đổi bisulfite
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cho định lượng miRNA
Bảng 2.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime định lượng miRNA
Bảng 3.1. Thông tin đặc điểm bộ mẫu sinh thiết thu nhận tại phòng khám Tai Mũi Họng
– Bệnh viện Chợ Rẫy, Tp. HCM
Bảng 3.2. Tỷ lệ các dạng UTVH thống kê theo WHO, 2005 ở một số nước trên thế giới
Bảng 3.3. Kết quả phân tích các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

xv

Bảng 3.4. Kết quả phân tích sự bắt cặp giữa cặp mồi và trình tự gene đích bằng Annhyb
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sự tương đồng của sản phẩm khuếch đại
Bảng 3.6. Kết quả phân tích thống kê sự hiện diện của các gene EBNA-1, EBNA-2, LMP1, LMP-2
Bảng 3.7. Hệ thống điểm của giá trị kappa trong y học (Medcalc © 2018)
Bảng 3.8. Hệ thống điểm của giá trị OR trong y học (Medcalc © 2018).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích thống kê sự hiện diện của một trong các gene EBNA-1,
EBNA-2, LMP-1, LMP-2 (PI ≥ 0,25)
Bảng 3.10. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự hiện diện các gene mục tiêu và
các yếu tố lâm sàng
Bảng 3.11. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự hiện diện một trong các gene mục
tiêu và các yếu tố lâm sàng
Bảng 3.12. Kết quả phân tích sự biểu hiện của EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2
Bảng 3.13. Giá trị trung bình Ct của các mẫu thí nghiệm và giá trị 2-Ct
Bảng 3.14. Kết quả phân tích thống kê sự biểu hiện của một trong các gene EBNA-1,
EBNA-2, LMP-1, LMP-2 (RPI ≥ 0,25)
Bảng 3.15. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự biểu hiện các gene mục tiêu và
các đặc điểm lâm sàng.
Bảng 3.16. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự biểu hiện một trong các gene mục
tiêu và các yếu tố lâm sàng
Bảng 3.17. Tính chất biểu hiện (Ct) của các gene EBNA-1, EBNA-2, LMP-1 và LMP-2
ở các giai đoạn bệnh UTVH

xvi


Bảng 3.18. Kết quả phân tích các đặc tính mồi khảo sát tính methyl hóa trên các gene
mục tiêu
Bảng 3.19. Kết quả phân tích thống kê tính chất methyl hóa cao bất thường trên các gene

ZMYND-10, DAPK, RASSF1A và p16INK4α trên mẫu sinh thiết mô UTVH
Bảng 3.20. Kết quả phân tích thống kê sự methyl hóa trên ít nhất một gene RASSF1A,
p16INK4α, DAPK và ZMYND-10 (MI ≥ 025).
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát tính chất methyl hóa trên các gene ức chế khối u với các
đặc điểm lâm sàng
Bảng 3.22. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự methyl hóa trên ít nhất một gene
với các yếu tố lâm sàng
Bảng 3.23. Tính chất biểu hiện của miR-155, miR-21 và miR-141 ở UVTH và mẫu lành
Bảng 3.24. Giá trị trung bình Ct của các mẫu sinh thiết mơ UTVH và giá trị 2-Ct trong
đánh giá biểu hiện các miR-21, miR-141, miR-155 so với chứng nội U6snRNA
Bảng 3.25. Kết quả phân tích sự biểu hiện ít nhất một trong ba miR mục tiêu
Bảng 3.26. Kết quả thể hiện tính tương quan giữa miR-155, miR-21, miR-141 với các
đặc điểm lâm sàng, trên mẫu sinh thiết mơ UTVH
Bảng 3.27. Tính chất biểu hiện (Ct) của các miR-21, miR-141 và miR-155 ở các giai
đoạn bệnh UTVH
Bảng 3.28. Tính tương quan giữa tính chất biểu hiện của miR-155 và tính chất chất biểu
hiện LMP-1, LMP-2
Bảng 3.29. Tính chất phân tử trên các mẫu bệnh giai đoạn sớm

xvii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u vịm họng xuất phát từ lớp biểu mơ vịm
họng. Trên thế giới, UTVH thường gặp nhất tại các nước khu vực Châu Á, như Trung
Quốc, Ấn Độ, Việt Nam. Tại Việt Nam, theo thống kê Globocan, 2018, số ca mắc bệnh
và tử vong lần lượt là 6.212 và 4.232 trường hợp được ghi nhận. Đây là loại ung thư
được xếp thứ sáu trong các loại ung thư ở Việt Nam. Ba nhóm ngun nhân chính gây
nên UTVH đã được xác định, bao gồm: (1) Yếu tố môi trường (Environmental factors/
carcinogens); (2) Yếu tố di truyền (Genetic factors); (3) Yếu tố nhiễm: sự xâm nhiễm

của Epstein-Barr virus (EBV). Điều đáng lo ngại là bệnh nhân thường đến khám và được
chẩn đoán ở giai đoạn muộn của bệnh. Điều này gây trở ngại trong việc điều trị và ảnh
hưởng đến khả năng sống cịn của bệnh nhân. Do đó, việc tìm kiếm các dấu chứng sinh
học cho bệnh UTVH hướng tới việc sử dụng chúng như một chỉ thị hỗ trợ trong sàng lọc,
chẩn đoán sớm và kể cả nghiên cứu thử nghiệm các hình thức trị liệu mới là rất cần thiết.
Việc nghiên cứu các tính chất phân tử của UTVH đặt nền tảng và cơ sở khoa học
cho việc tìm kiếm và xây dựng các dấu chứng sinh học cho UTVH. Cho đến nay, các
nghiên cứu liên quan đến các tính chất phân tử của UTVH chủ yếu tập trung thực hiện ở
các nước trên thế giới như Trung Quốc, Malaysia, Ấn Độ, … Tuy nhiên, các cơng trình
nghiên cứu về các tính chất phân tử trên UTVH tại Việt Nam cịn hạn chế, mang tính rải
rác, chỉ chú ý đến một hay hai gene tiềm năng. Với mục đích để góp phần tìm hiểu thêm
về bản chất phân tử của UTVH, đồng thời góp phần tìm kiếm và xây dựng dấu chứng
sinh học đặc trưng cho UTVH ở người Việt Nam, luận án “Nghiên cứu một số tính chất
phân tử của bệnh ung thư vòm họng ở người Việt Nam” được tiến hành thực hiện.
Mục tiêu tổng quát
Khảo sát một số tính chất phân tử của bệnh ung thư vòm họng trên người bệnh
Việt Nam, nhằm hiểu rõ hơn bản chất bất thường của khối u, và những hiểu biết này sẽ
là những tiền đề khoa học quan trọng cho việc tiến hành các thử nghiệm lâm sàng nhằm

xviii


tìm ra các phương thức hỗ trợ chẩn đốn, sàng lọc bệnh hay điều trị mới, hoặc phòng
ngừa bệnh như tiếp cận bằng vaccine.
Mục tiêu cụ thể
Các tính chất phân tử của bệnh ung thư vòm họng trên người bệnh Việt Nam được
tìm hiểu bao gồm:
(1) Yếu tố nhiễm (Epstein-Barr virus (EBV)) bằng việc khảo sát sự hiện diện của
các gene EBNAs (EBNA-1, EBNA-2), LMP (LMP-1, LMP-2), và sự biểu hiện
các gene EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2 ở mức mRNA;

(2) Yếu tố epigenetics bằng việc khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức trên
vùng promoter của các gene tiềm năng RASSF1A, p16INK4α, DAPK, ZMYND10 và khảo sát sự biểu hiện của miR-21, miR-141, và miR-155.
Các khảo sát trên sẽ được tiến hành trong sự so sánh giữa nguồn mẫu bệnh (mẫu
sinh thiết mơ khối u vịm họng) so với các mẫu lành (mẫu dịch phết tế bào vịm họng,
khơng mắc bệnh UTVH). Từ đó, kết quả đạt được sẽ được phân tích đồng thời nhằm
hiểu rõ bản chất bất thường của khối u trong ung thư vịm họng. Những tính chất đặc
trưng này được nghiên cứu trên chính người bệnh Việt Nam và chúng sẽ là những tiền
đề khoa học quan trọng cho việc tiến hành các thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra các
phương thức hỗ trợ chẩn đốn, sàng lọc bệnh hay điều trị mới, hoặc phòng ngừa bệnh
như tiếp cận bằng vaccine, trên người bệnh Việt Nam trong một tương lai gần.
Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
Để có thể tiếp cận được xu hướng y học cá thể (personalized medicine) – xu
hướng mà hiện nay thế giới đang rất quan tâm và phát triển, bên cạnh việc xây dựng và
tích lũy các cơ sở dữ liệu lớn (big data), thì việc tìm hiểu chức năng, ảnh hưởng của mỗi
gene, hoạt động của mỗi gene đến tính trạng trên con người, để rồi qua đó, việc chăm
sóc sức khỏe cho mỗi cá nhân sẽ dần được thực hiện dựa trên chính thơng tin của các

xix


gene của cá nhân đó, là điều rất cần thiết. Cho nên, những nghiên cứu về hoạt động của
gene cần phải được tiến hành trên mỗi quần thể, mỗi dân tộc đặc trưng, để tìm ra những
điểm riêng, phản ánh tính tương tác giữa kiểu gene đó, với các điều kiện sinh mơi mang
tính đặc trưng của mỗi đất nước, mỗi vùng miền, ảnh hưởng đến căn bệnh đang nghiên
cứu.
Nghiên cứu được đặt ra trong luận án đã đi theo xu hướng đó, bố trí các thực
nghiệm ca – chứng trên người bệnh Việt Nam, tập trung vào các yếu tố nhiễm (Epstein
Bar virus), các đặc tính epigenetics (hypermethylation và biểu hiện của một số miRNA
quan trọng) trong quá trình bệnh sinh ung thư vịm họng, từ đó góp phần làm sáng tỏ cơ
chế hình thành của các khối u trong cơ thể người bệnh và phát triển thành ung thư. Những

dữ liệu khoa học này là rất quan trọng, cần tiếp tục được tích lũy, nhằm hiểu rõ bản chất
của khối u, và sẽ là những tiền đề khoa học quan trọng cho việc tiến hành các thử nghiệm
lâm sàng nhằm tìm ra các phương thức chẩn đốn, sàng lọc bệnh hay điều trị mới, hoặc
phòng ngừa bệnh như tiếp cận bằng vaccine cho ung thư vòm họng, trên người bệnh Việt
Nam.
Tính mới của luận án
Trên thế giới, các nghiên cứu mang thuộc tính phân tử về ung thư vòm họng hầu
như đã nở rộ vào đầu những năm 2000, tập trung chủ yếu vào các bất thường gene liên
quan đến EBV như EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2... Sau này, cùng với sự phát triển
mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học, các nghiên cứu đã đi sâu vào các bất thường ở mức
độ tổng thể (-omics), hay các bất thường mang thuộc tính epigenetics như sự biểu hiện
bất thường của các phân tử micro-RNA, hay sự methyl hóa bất thường của các gene chủ
yếu là gene ức chế khối u.
Luận án này tập trung “Nghiên cứu một số tính chất phân tử của bệnh ung thư
vòm họng ở người Việt Nam“ đang đi theo mơ hình nghiên cứu của nhiều tác giả trên
thế giới, nhưng đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sinh học phân tử một cách có

xx


hệ thống và được thực hiện trên bệnh nhân Việt Nam. Tính mới của luận án vì vậy được
thể hiện rất rõ từ việc nghiên cứu và công bố với thế giới về các đặc điểm hiện diện, biểu
hiện của các đại diện họ gene gồm EBNAs và LMPs thuộc bộ gene virus EBV, trên người
bệnh Việt Nam; cùng với các đặc điểm epigenetics trên người bệnh Việt Nam bao gồm
tính chất methyl hóa bất thường của các gene ức chế khối u ZMYND-10, RASSF1A,
p16INK4α, DAPK cũng như sự biểu hiện của các phân tử miR-21, miR-141, và miR-155
như các onco-miRNA trong bệnh UTVH, người bệnh Việt Nam. Những kết quả quan
trọng này vì vậy đã và đang được chúng tơi lần lượt cơng bố trên các tạp chí chun
ngành quốc tế (hơn 10 cơng trình) và trong nước. Chính điều này cũng là những minh
chứng thể hiện rõ tính mới và tính độc đáo của nghiên cứu này.

xxi


Chương 1. Tổng quan tài liệu


1.1. Định nghĩa, dịch tễ ung thư vòm họng
1.1.1. Định nghĩa
Ung thư vòm họng (UTVH) (Nasopharyngeal carcinoma) là khối u ác tính xuất
phát từ biểu mơ của vùng vịm họng (epithelia of nasopharynx) (Hình 1.1). UTVH lần
đầu tiên được mơ tả vào năm 1912 bởi Regaud và Schmincke [25, 204, 215].

Hình 1.1. Cấu trúc họng và vị trí khối u vòm họng
1.1.2. Dịch tễ
Mặc dù UTVH là loại khối u ác tính hiếm gặp trên thế giới, tuy nhiên đây lại là
loại ung thư đặc hữu ở một số quốc gia trên thế giới [35, 213]. Theo dữ liệu công bố về
tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong về ung thư vào năm 2018 của Tổ chức nghiên cứu ung thư
Quốc tế (The International Agency for Research on Cancer) [24, 74] cho thấy:
(1) Tỷ lệ mắc bệnh: 129.079 trường hợp UTVH được ghi nhận năm 2018. Trong
đó, 93.416 trường hợp ghi nhận ở nam, và 35.663 trường hợp ghi nhận ở nữ
(Tỷ lệ theo giới: nam/nữ = 2,62). Tỷ lệ mắc bệnh ở các Châu lục trên thế giới
cũng khác biệt rõ ràng, trong đó tỷ lệ mắc UTVH ở Châu Á cao nhất chiếm
109.221 trường hợp (chiếm 84,62%). Trong đó, 79.714 trường hợp ghi nhận

1