Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT
TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN
LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG
TRONG BẢO QUẢN THỊT

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S. Phạm Minh Nhựt
Sinh viên thực hiện
MSSV: 105111082

: Phạm Khánh Hưng
Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


LỜI CẢM ƠN
Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việc
làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cách
làm việc một mình cũng như trong tập thể. Tuy có những thành cơng và cũng khơng
tránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths. Phạm
Minh Nhựt. Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đã
giúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học. Những lời khuyên, kinh
nghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà cịn giúp
em ngày càng hồn thiện mình hơn trong cuộc sống. Em cảm ơn thầy!
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang. Chính lịng
nhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của một
người làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quá
trình làm đồ án. Em cảm ơn chị rất nhiều!
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinh
học – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths. Huỳnh Văn Thành đã tạo điều
kiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phịng thí
nghiệm.
Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thời
gian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn.
Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quá
trình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua. Xin gửi lời cảm ơn đến
hai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viên
trong suốt quá trình làm đồ án.
Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã ln sát cánh
bên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian
qua. Con xin chân thành cảm ơn mọi người!


Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014
Sinh viên

Phạm Khánh Hưng

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nghiên cứu nào khác. Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về nghiên cứu của
mình.
Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014
Sinh viên,

Phạm Khánh Hưng


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của con
người ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhu
cầu ăn uống của con người cũng được nâng cao. Cũng từ đó, cơng tác bảo quản thực
phẩm ln là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng. Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâm
nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người.
Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiều
phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,
việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, do sự
thiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng các
hóa chất khơng được phép sử dụng hoặc dùng q liều lượng quy định. Trong khi
đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu,
đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và địi hỏi quy trình cần nhiều thời gian.
Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng
phương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và mơi

trường.
Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảo
quản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thì
hướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an tồn và
đặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. Do đó, việc
nghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thực
phẩm ngày được quan tâm phát triển.
Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm.
Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản
thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng khơng xa lạ với
chúng ta, đó là vi khuẩn lactic, những vi khuẩn này được con người chúng ta sử

1


Đồ án tốt nghiệp

dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay. Bacteriocin là hợp chất
kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩn
Gram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh
mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Ngồi bacteriocin,
các chủng LAB trong q trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môi
trường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic,
acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng
và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thực
phẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừng
khẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao.
Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sát
yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn
Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi
khuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống. Kết quả đã phân lập
được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền
thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định được
thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng
khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã thu được dịch ni cấy L.
plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính
kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa được
xác định. Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
các hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể
làm tiền đề cho các ứng dụng sau này.
Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn
từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt”. Nghiên cứu
này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chất
bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực

2


Đồ án tốt nghiệp

phẩm. Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Khoa Cơng
nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng nghệ Tp. Hồ Chí
Minh.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả
bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum
SC01.
3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn
Lactobacillus plantarum SC01.
- Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn
Lactobacillus plantarum SC01.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất
kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang
(2013).
- Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus
plantarum SC01 đối với thịt heo.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan vi khuẩn lactic

1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
1.1.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic
Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thích
được q trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic.
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên tách
được acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002).
Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của
chuỗi phản ứng của quá trình lên men.
Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt

động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt
tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt,
2001).
Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu.
Cơng nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881
(Nguyễn Lân Dũng, 2002).
Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mơ lớn. Do đó, các
chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao. Trong
đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và
Streptococcus.
Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩm
chính trong q trình chuyển hóa cacbon hydrat.
Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau,
củ, quả, thịt, cá, tơm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc
miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt, trong sản các sản
phẩm muối chua như dưa cà muối, tơm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi

4


Đồ án tốt nghiệp

khuẩn lactic. Ngồi ra, có một số lồi vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút
các chất tiết từ mơ cây (Salmen và Deighton, 1998).
Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L. bulgarius, L. helviticus, L.
casei, L. ferment, L. brevis. Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải
tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau

quả, trái cây: L. plantarum, L. delnikii, L. ferment, L. brevis.
- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L. acidophilus, S.
faecalis, S. bovis, S. salivanius, S. pyogenes.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngồi ra
hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic cịn phụ thuộc vào mơi trường,
điều kiện ni cấy và sự có mặt của oxi.
- Giống Streptococcus có dạng tế bào hình trịn hoặc hình ovan đường kính
khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đơi hoặc chuỗi dài.

Hình 1.1. Tế bào Streptococcus
- Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu
khuẩn.

5


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Tế bào Pediococcus
- Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đơi khi có hình que, có lúc
lại có hình ovan.

Hình 1.3. Tế bào Bifidobacterium
- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5
– 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và khơng tạo thành đám tập trung.

Hình 1.4. Tế bào Leuconostoc

6

Đồ án tốt nghiệp

- Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que
ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm).
Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến
nhất.

Hình 1.5. Tế bào Lactobacillus
1.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa
Mặc dù khơng đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thống
nhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau:
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm
này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử.
Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên men
được saccharose và một số khác không lên men được maltose. Một số vi khuẩn
lactic khơng có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có lồi
L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột).
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổng
hợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase.
Vi khuẩn lactic khơng có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thành
phần của chuỗi hô hấp), do đó chúng khơng thể tạo ra ATP. Các LAB chỉ có thể tạo
ra ATP bằng q trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn

7


Đồ án tốt nghiệp

cacbon. Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng có
thể phát triển trong điều kiện hiếu khí.
Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là con
đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate. Con
đường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó con
đường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol,
acetate… (Khalid, 2011).
1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển được
trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+. Vi khuẩn lactic
cần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho q trình sinh trưởng và phát triển.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn
(glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbon
khác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau.
Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic là
monosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào
và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic...
(Tortora và Funke, 1992).
Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp
được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và
phát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong mơi trường. Chỉ có
một số ít lồi có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vơ cơ.
Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm
(Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994):
- Nhóm cần phức hợp các acid amin.
- Nhóm phát triển tốt trên mơi trường chỉ có cistein và muối amon.
- Nhóm phát triển tốt trên mơi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy
nhất.

8


Đồ án tốt nghiệp

Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton,
peptit, cazein...
Đối với nguồn vitamin có vai trị đồng xúc tác trong nhiều phản ứng. Các vi
khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai
trị coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả
năng sinh tổng hợp được vitamin. Vitamin thường được bổ sung vào môi trường
bằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men...
Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acid
pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin... Các acid nicotinic và acid pantotenic
đặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998).
Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ,
độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy.
Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng có
ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩn
này. Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng:
- Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin...
- Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin...
- Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic.
Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic. Chúng vừa có vai trị
cung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các
acid amin tự do.
Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người ta
thường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vai
trị là chất đệm. Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) cịn có hoạt

tính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch.
Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt là
magiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic.
Trong đó, mangan có vai trị ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi
có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom. Mangan và magiê còn là

9


Đồ án tốt nghiệp

yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme. Magiê cịn có tác dụng làm tăng khả
năng hấp thu đường của vi khuẩn lactic. Phức hợp các chất khống cịn có tác dụng
làm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần Thanh
Thủy, 2003).
1.1.3. Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic. Tùy
theo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lên
men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình.
Lên men lactic là q trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic
và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng,
2002).
Tùy từng lồi, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men
lactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phương
thức trên.
1.1.3.1. Lên men lactic đồng hình
Lên men lactic đồng hình là q trình lên men cho sản phẩm chính là acid
lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB
(Embden – Meyerhof – Parnas). Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân

tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớn
trong cơng nghiệp thực phẩm.
Phương trình tóm tắt:
C6H6O6 + 2ADP + 2Pv

Vi khu ẩn lactic
Lên men đồng hình

10

2CH3-CHOH-COOH + 2ATP


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình
Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.
acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricus, L .casei, Streptococus, S. cremoris, S.
thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002).
1.1.3.2. Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là q trình lên men trong đó ngồi sản phẩm acid
lactic thì chúng cịn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,
etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành các
sản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997).
Phương trình tóm tắt:
2C6H6O6

2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q

Trong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol

20%, acid acetic 10%, các chất khí cịn lại 20%.
Q trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat).
Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và
trizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con
đường PP. Sau đó, q trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra
tương tự như lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật,
môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999).

11


Đồ án tốt nghiệp

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides,
L. oenos, L. cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Bifidobacterium bifidum.
Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2
như sự lên men lactic dị hình thơng thường.

Hình 1.7. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình
1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
1.2.1. Phân loại
Theo Orla – Jensen (1919) và Bergey (1923) vi khuẩn Lactobacillus
plantarum thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Chi: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus plantarum

12


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum
L. plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 –
1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm. Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic
và đã được giải mã hoàn toàn. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năng
chịu nồng độ NaCl 5,5 %.
Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng
lên men.
- Nhóm I chỉ lên men hexose duy nhất thành axid lactic và không thể lên men
gluconate hay pentoses.
- Nhóm II vừa có thể lên men hexose thành axid lactic, vừa có thể lên men
gluconate hay pentose.
- Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2.
Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa
của con người. L. plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong
quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phơ mai, kim chi, dưa cải… L.
plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như
một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến.
L. plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid. Chúng khơng có
khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường
khác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid. Việc sinh ra NO giúp ngăn
chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter
pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011).
L. plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy. Khi có oxy, L. plantarum
có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide. Khi khơng có oxy, L. plantarum sẽ

lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình).
L. plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng. Mangan giúp cho L. plantarum
chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2.
H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganese
cofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983).

13


Đồ án tốt nghiệp

L. plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều
kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non. Kí
sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng
tích cực đến tế bào vật chủ.
L. plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên
men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn
(Molin, 2010).
1.2.3. Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum
Cũng như các chủng LAB khác, L. plantarum đều trải qua quá trình lên men
lactic. Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo ra
chiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic,
ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic,
acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của
nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm.
Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con
đường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong q trình tăng trưởng hiếu khí và
diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate.
Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L. plantarum,
plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh

tổng hợp protein nhờ ribosome. Trong tế bào L. plantarum có mang các gene mã
hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins. Qua quá trình
phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo ra
plantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn.
1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum sản sinh ra
1.3.1. Plantaricin
Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L. plantarum sản xuất ra ít nhất 6
bacteriocins khác biệt. Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền
chất có chứa glycine. L. plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen
PlnE và PlnF. Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và

14


Đồ án tốt nghiệp

PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt
(PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai
vùng điều hòa PlnC và PlnD. Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L.
plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với
L. plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và
Propionobacteria.
Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau. Chúng gồm
30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương
tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau. Các bacteriocins hoạt động
với tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ. Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻ
hoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả.
Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide
phân lập từ L. plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh. Các gen cấu trúc chỉ
ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motif

đơi. Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino. Plantaricin S được coi là kiểm
sốt q trình lên men và bảo quản ơ liu. Một bacteriocin gồm hai peptide khác là
plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Các thành phần
lantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự
(Zacharof và Lovitt, 2012).
1.3.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác
Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L.
plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản
sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus…
Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với mơi trường acid
bên ngồi, H+ từ mơi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào
giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho
vi khuẩn bị mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đường
phân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các

15


Đồ án tốt nghiệp

anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ức
chế sinh trưởng hoặc có thể chết.
Ngồi các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con
đường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong q trình tăng trưởng
hiếu khí của L. plantarum. Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác
động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát
triển. Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các
vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị
tiêu diệt.
1.4. Bacteriocin và q trình thu nhận, tách chiết, tinh sạch các hợp chất

kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic
1.4.1. Hợp chất bacteriocin
Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên vào năm 1925 trong quá trình
nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của cơng trình này đã thúc đẩy sự
phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt vi
khuẩn E. coli.
Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ở
riboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin có hoạt tính
kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số
vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng khơng có hoạt tính kháng
sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật.
Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động
của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, khơng gian sống…Các
bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp. Đặc tính diệt
khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi
các dung môi hữu cơ. Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷ
phân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính. Do có bản chất protein nên

16


Đồ án tốt nghiệp

bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể
người và các vấn đề sức khoẻ khác.
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên, việc
phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Bacteriocin được phân loại với
nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng
và trì nh tự chuỗi amino acid. Bacteriocin được chia thành 3 lớp:

- Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (<
5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic
bacteriocin lớp I được chia thành 2 lớp phụ:
+ Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất. Nisin
thuộc nhóm này.
+ Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, khơng linh động, tích điện
âm hoặc khơng tích điện. Đại điện: Meracidin.

Hình 1.8. Bacteriocin lớp I
- Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên,
ổn định nhiệt, chứa những amino acid thơng thường. Nhóm này được chia thành 3
lớp nhỏ:

17


Đồ án tốt nghiệp

+ Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại
diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P. Các
bacteriocin nhóm này có nhiều ứng dụng trong cơng nghiệp.
+ Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, những
peptid này ít hoặc khơng hoạt động. Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là:
Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK.
+ Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin không
đồng nhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau. Đại diện:
Divergicin A và Acidocin B.
- Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, không
bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khả
năng bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Đại diện gồm có Acidofilicin

A và Lactacins A, B.
- Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngồi protein cịn có thêm thành
phần lipid và cacbohydrate. Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức
năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch.
1.4.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus,
Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram
âm kém vì màng ngồi của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin.
Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàm
lượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm.
Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng.
Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngồi tế bào. Khơng gây nguy hiểm
sinh lý tế bào.
- Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong
tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn.

18


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của Bacteriocin
Trong đó:
- Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotic gồm những phân tử lưỡng tính dài có thể
tiêu diệt các tế bào bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất.
- Lớp II (Sakasin): mang điện dương trong mơi trường trung tính và chứa
một vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực. Dẫn đến làm thay đổi tính thấm của màng
tế bào.
- Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào.

1.4.3. Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng
khuẩn
Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm. Đặc
biệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiện
sản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp. Lợi thế của việc sản xuất invitro là
do khơng có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế,
bất hoạt bởi protease. Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm sốt các quy trình lên men thì
sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến

19


Đồ án tốt nghiệp

các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon và
Phumkhachorn, 2010).
Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tử
bacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học. Ngồi ra, nhiệt
độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trị quan trọng
trong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làm
giảm khả năng sản xuất. Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đến
sản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối.
Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộc
vào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và q trình chuyển hóa
của LAB.
Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thể
được phân biệt:
- Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammonium
sulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao
áp.

- Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủa
ammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược pha
lỏng cao áp.
- Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cơ lập thơng qua một quy
trình duy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độ
hấp thụ bacteriocin có sẵn thơng qua điều chỉnh pH của mơi trường lên men thô.
Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phương
pháp đầu tiên.
Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh
sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus
amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium
RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi
Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007).

20


Đồ án tốt nghiệp

1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn
a. pH
Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0. Hoạt tính kháng khuẩn
của bacteriocin vẫn hoạt động trong mơi trường có tính acid hoặc trung tính. Sự ổn
định của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thực
phẩm. Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốt
trong pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong mơi trường có pH 8,0 - 12,0.
b. Nhiệt độ
Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phịng, hoạt tính kháng khuẩn
của bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ được
hoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạt

động yếu ở nhiệt độ thấp.
c. Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme
Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tính
kháng khuẩn của bacteriocin. Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin và
trypsin khơng gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ các
chủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001).
d. Các chất hoạt động bề mặt
Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khả
năng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau. Đối với hợp chất
kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS,
Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5
mM vẫn khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv,
2011). Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lại
làm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA
và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất
từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013).

21