Xác định hàm lượng vitamin b2 bằng phương pháp trắc quang

Chun ngành Hố phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

KHOA HOÁ HỌC



XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN B2
BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRẮC QUANG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGÀNH HOÁ
HỌC
KHOÁ 39, 1998 - 2002

Giáo viên hƣớng dẫn:

Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Thọ - 39A Hoá

Vinh, 5-2002
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

LỜI CẢM ƠN

Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:

Thầy giáo hướng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ đã
giao đề tài và hướng dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi
điều kiện thuận lợi trong q trình thực hiện đề tài.
Để hồn thành được đề tài này em cịn được sự
giúp đỡ và góp ý của các thầy cô giáo : TS Nguyễn
Khắc Nghĩa; Ths Võ Thị Hồ; cơ Phạm Thị Đức - cán
bộ phụ tá phịng thí nghiệm, cùng nhiều thầy cơ
giáo khác trong khoa.
Vinh, tháng 5 năm 2002
NGUYỄN VĂN THỌ

Sinh viên lớp 39 A - Hoá



1
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

MỞ ĐẦU
Có thể định nghĩa về vitamin một cách tóm tắt nhƣ sau: vitamin là một
nhóm các hợp chất hữu cơ có khối lƣợng phân tử bé, có cấu tạo hố học rất
khác nhau và có các tính chất lí học cũng nhƣ hố học rất khác nhau. Chúng
đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống bình thƣờng của bất kì
một cơ thể nào. Trong các cơ thể sinh vật, vitamin hoàn thành các chức năng
xúc tác.
Nhờ sự cố gắng của nhiều nhà hố sinh học và nhiều nhà sinh lí học mà
gần 100 năm này trong nhành vitamin học ngƣời ta đã chiết xuất và phân lập

đƣợc trên 30 loại vitamin khác nhau. Ngƣời ta cũng đã tổng hợp đƣợc một số
lớn các vitamin bằng con đƣờng tổng hợp hoá học trong phịng thí nghiệm.
Căn cứ vào tính hồ tan của vitamin mà ngày nay ngƣời ta chia vitamin ra
làm các nhóm sau:
+ Các vitamin hồ tan trong nƣớc (B1, B2, B5, B6, B12, C, B3, H...)
+ Các vitamin hoà tan trong chất béo (A, D, E, K, Q, ...)
Việc cung cấp không đầy đủ các vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hƣởng xấu
khơng những đối với sự làm việc của hệ thần kinh mà còn đối với một số loại
cơ quan khác ở bên trong cơ thể. Vì thế, trong khẩu phần ăn của con ngƣời phải
có giá trị hồn chỉnh khơng những về phƣơng diện calo, về phƣơng diện chất
đạm, mà còn về phƣơng diện vitamin nữa.
Đối với vitamin B1, B2 nói riêng cũng có vai trị rất quan trọng. Để cung
cấp đầy đủ và hợp lí đối với cơ thể thì vấn đề đặt ra là cần phải biết đƣợc hàm
lƣợng của nó trong các mẫu thuốc, các loại thức ăn. Do đó, cần phải tìm ra các
phƣơng pháp xác định hàm lƣợng của chúng.
Vitamin B1, B2 có thể đƣợc định lƣợng bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ:
phƣơng pháp sinh vật học, phƣơng pháp hoá học, phƣơng pháp lí học, ...
Phƣơng pháp định lƣợng vitamin B1, B2 hầu hết chỉ tiến hành bằng phƣơng
pháp hoá học.
2
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Trong điều kiện thực tế của phịng thí nghiệm hiện nay, chúng tơi định
lƣợng vitamin B2 bằng phƣơng pháp trắc quang. Phƣơng pháp này khá phổ biến
vì có tính chính xác cao nếu nhƣ tìm đƣợc các thuốc thử thích hợp và xác định
đƣọc các điều kiện tối ƣu cho phép phân tích.
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi định lƣợng vitamin B 2 theo 2 phƣơng

pháp:
+ Phƣơng pháp dựa trên thiết bị quang phổ tử ngoại của TT Kiểm nghiệm
Dƣợc phẩm.
+ Phƣơng pháp cổ điển: xây dựng quy trình để định lƣợng hàm lƣợng
vitamin B2 ở phịng thí nghiệm khoa Hố học.
Từ kết quả của 2 phƣơng pháp có thể rút ra so sánh nên sử dụng phƣơng
pháp nào để định lƣợng vitamin, từ đó ứng dụng để định lƣợng vitamin B 2
trong một số thực phẩm và dƣợc phẩm trên thị trƣờng hiện nay.

3
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Phần I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. PHÂN LOẠI VITAMIN B - NGUỒN GỐC VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG.

Vitamin B có nhiều loại, mỗi loại có vai trị riêng, có ý nghĩa rất quan
trọng đối với sự sống.

1.1. Vitamin B1 (Tiamin).
Cơng thức cấu tạo:

NH2

H3C

N
C

C
N

HC
C 2
N+
HC
CH

S

C
C

CH3
H2C

CH2OH

(dạng có vịng thiazon)
+ Vai trò, chức năng sinh học:
Khi kết hợp với hai gốc photphat, vitamin B1 sẽ tạo thành tiamin
pyrophotphat (TPP). Đó là coenzym của enzym đecacboxylaza và transxetolaza
(các enzym này tham gia vào quá trình trao đổi gluxit).
Thiếu vitamin B1 sẽ ảnh hƣởng đến sự trao đổi gluxit, viêm dây thần kinh,
bị bệnh tê phù (beri - beri). Khi mắc bệnh, hàm lƣợng axit piruvic và xetoglutaric trong máu cao hơn mức bình thƣờng.
+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B1 có nhiều trong thực vật nhƣ men bia, cám gạo, gạo chƣa xát,
ngô, đặc biệt nhiều hơn trong đỗ tƣơng, lạc, ngồi ra cịn có trong các loại rau
nhƣ bắp cải, rau dền, xà lách. Trong động vật, vitamin B 1 có nhiều trong gan,
sữa, lịng trắng trứng.
Nhu cầu vitamin B1 của ngƣời lớn là 1,5 - 3mg, đối với trẻ em là 0,5 2mg.

1.2. Vitamin B2 (riboflavin, lactoflavin).
+ Công thức cấu tạo: (trang sau)
4
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

+ Vai trị, chức năng sinh học:
Vitamin B2 là thành phần cấu tạo nên các coenzym sau:
Flavin mono nucleotit (FMN)
Flavin ađenin đinucleotit (FAD)
Đó là các coenzym tham gia vào q trình oxy hố - khử. Vì vậy, thiếu
vitamin B2, sự sinh trƣởng của cơ thể diễn ra khơng bình thƣờng. Ngồi ra nó
cịn ảnh hƣởng đến sự phát triển của nhiều mô khác trong cơ thể nhƣ da, màng
nhầy, bào thai, máu.
CH2 -(CHOH)3-CH2OH
N

H3C

O

N

NH

H3C

N

O

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu: Vitamin B2 có nhiều trong nấm men, trong
rau quả nhƣ rau dền, dƣa hấu, hành tây, súplơ, đậu, thịt, sữa, gan, lòng đỏ trứng.
Nhu cầu vitamin B2 hàng ngày của ngƣời là 2 - 2,5mg. Đối với động vật
nhai lại, nhờ các vi sinh vật đƣờng ruột có thể tổng hợp đƣợc vitamin B 2 cung
cấp cho cơ thể nên chúng khơng có nhu cầu hấp thụ B2 từ ngồi.

1.3. Vitamin B3 (axit pantoteric):
+ Cơng thức cấu tạo:
O
O

-

C

CH2

CH2

H
N

CH3

C

H
C

O

OH CH3

C

CH2OH

+ Vai trò, chức năng sinh học:
Vitamin B3 là một thành phần cấu tạo của coenzym A tham gia vào sự
chuyển hoá lipit trong cơ thể. Thiếu vitamin B3 sẽ bị bệnh viêm da.
+ Nguồn cung cấp: Trong thực vật, vitamin này có nhiều trong nấm men,
trong lớp alơron của hạt lúa, trong chồi cây linh lăng, hạt lạc, đỗ tƣơng, cà
chua, gấc, ...
5
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

1.4. Vitamin PP (vitamin B5)
+ Cơng thức cấu tạo:

COOH

axit nicotinic (niaxin, vitamin B5, PP)
N

+ Vai trò, chức năng sinh học:
Vitamin PP ngăn ngừa đƣợc bệnh da sần sùi. Thiếu vitamin này da sẽ bị
viêm loét, sẫn sùi, nhất là những nơi tiếp xúc nhiều với ánh sáng. Vitamin PP là
thành phần cấu tạo nên các coenzym:
Nicotinait ađenin đinucleotit (NAD+).
Nicotinamit ađenin đinucleotit photphat (NADP+)
Đó là những coenzym tham gia vào q trình oxy hố - khử, vì vậy thiếu
vitamin này thì q trình oxy hố - khử trong cơ thể bị vi phạm.
+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:
Vitamin PP có nhiều trong gan, thịt, trứng, hạt đậu đỗ, gạo, bánh mì, nấm
men. Nhu cầucủa ngƣời đối với vitamin PP trong một ngày khá cao: 15 - 25mg.
Tuy nhiên, một số lồi vi sinh vật có thể tổng hợp đƣợc vitamin PP từ axit amin
không thay thế là triptophan.

1.5. Vitamin B6 (piriđoxin)
+ Cơng thức cấu tạo:

CH2OH

CHO
CH2OH

OH

oxy hố

CH3

CH2NH2
CH2OH

CH2OH
OH

OH
NH3

CH3
N

piriđoxin

N

piriđoxal

CH3
N

piriđoxemin

+ Vai trò, chức năng sinh học:

6

Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Khi piriđoxal đƣợc hoạt hố bởi ATP để tạo thành photphopiriđoxal, nó sẽ
tham gia vào nhóm ngoại của enzym aminotransferaza, xúc tác cho sự chuyển
hố nhóm NH2 từ axit amin đến axetoaxit. Nhờ đó các xetoaxit mới và axit
amin mới đƣợc tạo thành.
Thiếu vitamin B6 sẽ biểu hiện các triệu chứng nhƣ viêm thần kinh, các
bệnh ngồi da, nơn mửa, đau cơ, suy nhƣợc.
+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:
Vitamin B6 có nhiều trong thịt, sữa, lịng đỏ trứng, cá, men bia và các hạt
ngũ cốc. Nhu cầu vitamin B6 hàng ngày của ngƣời lớn là 1,5 - 2,8mg, trẻ em là
0,5 - 2mg.

1.6 Vitamin B12 (cobalamin)
Cấu tạo của vitamin B12 rất phức tạp.
+ Vai trò, chức năng sinh học:
Vitamin B12 có tác dụng chữa bệnh thiếu máu ác tính, nó giúp cho sự hình
thành huyết cầu tố và hồng cầu, nó tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp
các nucleotit, giúp cho các phản ứng metyl hố.
+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:
Có trong thịt, cá, trứng, sữa, ...
Ở ngƣời, vitamin B12 đƣợc dự trữ ở gan (vài mg), đƣợc tổng hợp nhờ hệ vi
khuẩn đƣờng ruột, vi khuẩn này cũng thấy ở ao, hồ, trong nguồn nƣớc thải nhà
máy.
Nhu cầu 10 - 20  /ngày.
2. TÍNH CHẤT HỐ HỌC CỦA THIAMIN - KHÁI QT VỀ PHƢƠNG
PHÁP ĐỊNH LƢỢNG.

2.1. Tính chất
+ Điểm nóng chảy: 246 - 2500C cho đến khi phá huỷ.
+ Độ hoà tan:: 100g/100ml nƣớc.
1g/100ml etanol 960.
không tan trong hexan, ete, axeton.
+ Trong môi trƣờng kiềm, thiamin rất dễ bị phá huỷ. Phần thiazol trong
phân tử rất dễ dàng bị phá huỷ. Thiamin trong mơi trƣờng trung tính và đặc biệt
là trong mơi trƣờng axit tƣơng đối vững bền.
7
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Ngồi khơng khí bình thƣờng, thiamin trong dung dịch rất dễ bị oxy hoá.
Sự oxy hoá dần dần phát sinh ra dạng đisunfua, có tác dụng về phƣơng diện
sinh vật học. Bằng cách dùng các thuốc thử oxy hoá mạnh nhất phát sinh ra
thiocrom là một chất có huỳnh quang xanh lơ rất rõ. Phản ứng này coi nhƣ
đƣợc dùng cơ bản cho phƣơng pháp định lƣợng thiamin rất nhạy và tƣơng đối
đơn giản.

2.2. Khái quát về phƣơng pháp định lƣợng
Phƣơng pháp định lƣợng thiamin có thể phân chia thành 3 nhóm:
+ Phƣơng pháp định lƣợng sinh vật học và vi trùng học.
+ Phƣơng pháp hoá học.
+ Phƣơng pháp lý học.
Phƣơng pháp định lƣợng thiamin trên súc vật, trên cơ sở làm chứng (test)
về sự trƣởng thành nhanh chóng. Việc thiếu vitamin B 1 ở chuột ốm gây nên
một sự bại liệt phần dƣới mà sau đó đƣợc điều trị bằng cách cho mẫu chuẩn

đồng thời với mẫu thử. Độ nhạy của phƣơng pháp vi sinh vật giảm đi đáng kể,
điều đó đƣợc xác định rằng đôi khi do ảnh hƣởng của vi sinh vật tạo nên
thiamin ở bộ máy tiêu hoá của chuột.
Thực tế khi định lƣợng thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên hay
trong các chế phẩm dƣợc, hầu hết ngƣời ta dùng phƣơng pháp định lƣợng hoá
học. Phƣơng pháp hoá học để định lƣợng thiamin dựa trên sự đo huỳnh quang
của sản phẩm oxy hố của thiamin (thiocrom). Sau đó ngƣời ta dùng phƣơng
pháp so màu để định lƣợng. Phƣơng pháp này cho sản phẩm ngƣng kết của
thiamin với những amin thơm. D.Melnik và H. Field nghiên cứu phƣơng pháp
này dùng sản phẩm ngƣng kết với p-aminoaxetophenon. Màu phát sinh đem lắc
với butanol, xylen hay axeton. Nồng độ màu tăng lên khi có mặt etanol hay
phenol. Phƣơng pháp này đƣợc cải tiến bằng cách dùng axit sunfanilic điazo
hố và kaliferixianua. Cơng trình này làm tăng độ nhạy của phản ứng bởi vì sự
có mặt của kaliferixianua tác dụng với axit sunfanilic điazo hoá trong nguyên
liệu có amin giao thoa với thiamin. Từ nồng độ màu trƣớc và sau khi cho
ferixianua, có thể định lƣợng một cách tƣơng đối chính xác lƣợng thiamin.
Về các phản ứng màu khác đối với thiamin có thể cho biết một cách đơn
sơ. Vitamin B1 với p- đimetylamino benzaldehyd tạo nên một kết tủa đỏ gạch
8
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

khi cho bốc hơi trong mơi trƣờng axit. Với 2,6- đibromquinon clorimit trong
môi trƣờng dung dịch đệm borat pH 9,6 thiamin cho màu da cam.
Định lƣợng vitamin B1 bằng phƣơng pháp cân có thể tiến hành theo B.
Naiman bằng cách tủa dung dịch thiamin với iodo bitmuto kali. Tủa màu da
cam tạo thành thực tế không tan trong nƣớc. Sau khi lấy đƣợc, đem sấy khô và
cân. Phƣơng pháp này tuy vậy đôi khi dùng để định lƣợng thiamin trong các

chế phẩm dƣợc.
Định lƣợng thiamin tự do bên cạnh dạng este hố dựa trên độ hồ tan khác
nhau của sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza với thiamin. Từ mơi trƣờng kiềm
thiocrom có thể lấy đƣợc hẳn để định lƣợng bằng cách lắc với izobutanol, trong
khi đó, sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza vẫn ở trong pha nƣớc. Định lƣợng
thiamin đã đƣợc cân sẵn đáp ứng từ một lƣợng lớn cocacboxylaza đƣợc tiến
hành trên cơ sở định lƣợng thiamin trƣớc và sau sự thuỷ phân enzym.
2.2.1. Phương pháp lý học để định lượng thiamin

2.2.1.1. Phương pháp quang phổ
Phƣơng pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lƣợng thiamin
trong các chế phẩm dƣợc, đặc biệt trong thuốc tiêm. Quang phổ hấp thụ vùng tử
ngoại của thiamin rất đặc hiệu và chịu sự thay đổi đáng kể trong môi trƣờng
nƣớc ỏ các pH khác nhau. Sự thay đổi sâu xa về quang phổ theo pH rất điển
hình với nhân pyrimidin. Trong môi trƣờng HCl 0,1N thiamin cho một quang
phổ hấp thụ đơn giản với độ cực đại ở bƣớc sóng 253nm. Trong mơi trƣờng
đệm axetat pH 3,5 có 2 cực đại ở các bƣớc sóng 245 nm và 261nm. Trong mơi
trƣờng đệm photphat pH 6,6 có 2 cực đại ở cách xa nhau mà ở đó độ tắt của cực
đại ở khoảng 265nm thấp xuống đáng kể.

2.2.1.2. Phương pháp cực phổ
K. Wiesner là ngƣời đầu tiên nghiên cứu định lƣợng thiamin bằng phƣơng
pháp cực phổ đã nhận thấy trong dung dịch thiamin có 2 loại sóng cực phổ:
sóng xúc tác trong dung dịch đệm, và sóng anot trong mơi trƣờng kiềm. Dung
dịch đệm photphat pH 7,3 thích hợp cho việc định lƣợng. Cịn về độ nhạy, thì
pH này rất thích hợp bởi vì có thể dùng nồng độ thiamin ở mg/ml. Tuy vậy,
việc lựa chọn phƣơng pháp này cũng rất ít vì tất cả chất gây tác nhân phát hiện
hiđro trên điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt đều cho làn sóng giống nhau. Vì thế chỉ
9
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học

Chun ngành Hố phân tích

dùng phƣơng pháp này cho việc định lƣợng các chế phẩm dƣợc, trong khi khả
năng định lƣợng trong các nguyên liệu thiên nhiên bị hạn chế.

2.2.1.3 Phương pháp sắc kí định lượng thiamin
Phƣơng pháp sắc kí là phƣơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lƣợng
thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên. Và nhƣ vậy kể cả phƣơng pháp sắc
kí hấp phụ trên cột đến phƣơng pháp sắc kí mới nhất trên giấy.
Trong sự chọn lọc các phƣơng pháp định lƣợng thiamin trong nguyên liệu
thiên nhiên, phƣơng pháp trao đổi ion từ nhóm zeolit do L.R. Cevecedo và D.J.
Henessy đã dùng chất này để chiết thiamin từ chất dƣợc liệu.
Trong thời gian gần đây, việc dùng phƣơng pháp sắc kí trên giấy rất thích
hợp và có giá trị đối với việc định lƣợng thiamin trong ngun liệu thiên nhiên.
Phƣơng pháp sắc kí giấy có khả năng dễ tách thiamin khỏi các cocacboxylaza.
Vấn đề này đƣợc đặt ra do A. Baldantoni, M. Spaoloni. Dung môi đƣợc dùng là
hỗn hợp izo- butanol, pyridin với nƣớc, với tỷ lệ 1 : 1 : 1 và 1,1% axit axetic kết
tinh đƣợc, ngƣời ta tiến hành phát hiện phản ứng thiocrom sau khi oxy hoá
thiamin và cocacboxylaza bằng ferixianua kali. Vị trí của vết thiocrom đƣợc
phát hiện do huỳnh quang phát triển dƣới ánh sáng tia tử ngoại. Việc chuyển
dạng thiocrom thƣờng hay đƣợc dùng để phát hiện thiamin trong sắc kí giấy.
Nghiên cứu khả năng mới định lƣợng các vitamin bằng cách phối hợp các
phƣơng pháp lí học với sắc kí trên giấy thì cần sử dụng đến khả năng phân chia
lớn của phƣơng pháp sắc kí trên giấy, và độ nhạy đáng kể của một vài phƣơng
pháp lí học để định lƣợng một lƣợng nhỏ vitamin.

2.2.1.4. Định lượng thiamin pyrophotphat bằng phương pháp
manomet.

Năm 1937 - 1938, A. S. Shultle, L. Atkin và các đồng nghiệp đã công bố
phƣơng pháp định lƣợng thiamin rất nhạy và đặc hiệu dựa trên việc đo thể tích
CO2 phát sinh khi có sự lên men của glucoza trong giai đoạn đecacboxyl hoá
axit pyrotactrric. Nếu ta cho vào men cocacboxylaza (pyrophotphat thiamin)
chất này sẽ kết hợp với thành phần anbumin của cacboxylaza (men ngoại lai)
dựa trên chức năng hoạt động của cacboxylaza gây xúc tác cho sự khử
cacboxyaxit pyrotactrric. Đo bằng áp kế lƣợng CO2 phát sinh, và từ lƣợng đó
xác định đƣợc lƣợng cocacboxylaza trong mẫu nguyên liệu đem thử. G.K.
Westenbrink và các đồng nghiệp nghiên cứu phƣơng pháp này để định lƣợng
10
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

thiamin pyrophotphat trong máu, trong các mơ và các men. Đó là một trong
những phƣơng pháp rất nhậy để định lƣợng vitamin.
2.2.2. Phương pháp hoá học định lượng thiamin.

2.2.2.1. Khái quát chung
Trong các phƣơng pháp hoá học định lƣợng thiamin, phƣơng pháp
thiocrom đƣợc xếp lên hàng đầu. Phƣơng pháp này dựa trên sự đo cƣờng độ
huỳnh quang xanh lơ của sản phẩm oxy hoá của thiamin là thiocrom:
N

N

C

CH3

CH2CH2OH

CH3

N

N

S

Thiocrom đƣợc phát sinh do thiamin bị oxy hoá trong môi trƣờng kiềm.
Đạt đƣợc những điều kiện tốt nhất để đo huỳnh quang khi ta dùng tia tím - tử
ngoại ở bƣớc sóng vào khoảng 365nm. B.C.P. Jansen là ngƣời đầu tiên dùng
phƣơng pháp huỳnh quang để định lƣợng thiamin. Jansen đã oxy hố nƣớc
chiết có chứa thiamin bằng dung dịch muối màu đỏ máu. Sau đó sản phẩm oxy
hoá vừa đƣợc tạo ra đem lắc với izobutanol. Nguyên tắc này nói chung là dùng
cho phƣơng pháp huỳnh quang. Độ nhạy của phƣơng pháp đƣợc nâng lên với
thời gian.
D.J. Henessyt và các cộng tác viên đã dùng zeolit tổng hợp (pecmutit) để
tách thiamin từ các nguyên liệu thiên nhiên, đã nghiên cứu nâng cao chủ yếu độ
nhạy của phƣơng pháp, và loại trừ ảnh hƣởng của huỳnh quang của các chất
phụ khác.
Sự hấp phụ thiamin trên nguyên liệu này đƣợc tiến hành trong môi trƣờng
axit. Henessy và cộng sự tiến hành giải phóng thiamin từ chất trao đổi ion bằng
dung dịch amoni nitrat. Tiếp theo là sự cải tiến phƣơng pháp ban đầu của
Jansen khi xác định rằng bên cạnh thiamin tự do cịn có cả este của axit
pyrophotphoric, ví dụ trong men bánh mì và trong một vài mô tế bào động vật.
Tác dụng vi sinh vật của thiamin pyrophotphat tƣơng đƣơng với tác dụng của
thiamin tự do. Khi định lƣợng bằng phƣơng pháp thiocrom, cần phải lắc sản
phẩm oxy hố của cocacboxylaza từ mơi trƣờng kiềm với izo - butanol, do lí do

trên nên cần phải tiến hành giải phóng thiamin khỏi liên kết của este. Muốn
11
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

vậy, phải dùng một loại enzym khác để thuỷ phân nhƣ: photphataza,
takadiastaza và amylaza cũng cho hiệu quả nhƣ nhau.

2.2.2.2. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp thiocrom theo "Hội
những nhà hoá học về vitamin".
Phƣơng pháp này tiến hành theo các bƣớc sau:
+ Chiết: cân một mẫu có chứa khoảng 10 - 40mg thiamin, cho vào bình
cầu 100ml, thêm 75ml dung dịch HCl 0,1N và đun sôi cách thuỷ 30 phút. Một
mặt trong môi trƣờng axit thì ít nhất thiamin cũng bị oxy hố, mặc khác có thể
dùng phƣơng pháp này để chiết tồn bộ thiamin vào dung dịch. Đối với những
mẫu thử không chứa thiamin liên kết thì có thể khơng cần thuỷ phân bằng
enzym, mà tiến hành ngay sắc kí phân chia.
+ Thuỷ phân bằng enzym: nhằm giải phóng thiamin khỏi dây nối este bằng
axit pyrophotphoric. Tiến hành thuỷ phân bằng cách dùng sản phẩm
takadiastaza. Sau khi thuỷ phân xong, để nguội ở nhiệt độ phịng, pha lỗng cho
vừa đủ 100ml nƣớc cất, lắng và lọc li tâm để có đƣợc dung dịch trong.
+ Sắc kí: để đẩy nƣớc trong có lơ lửng chất pecmutit đã chuẩn bị sắc vào
cột sắc kí ở dƣới đáy có lót bơng thuỷ tinh. Dùng ống hút nhỏ 25 ml dung dịch
lọc axit hay nƣớc chiết để cho chảy từ từ . Nƣớc lọc chảy ra bỏ đi. Rửa cột 3
lần, mỗi lần bằng 10ml nƣớc nóng. Trong điều kiện này thiamin đƣợc giữ trong
cột trao đổi ion. Thiamin giải phóng sau đó đƣợc tiến hành lấy bằng dung dịch
KCl.
Tiến hành chiết thiamin bằng cách rửa cột hai lần với 10ml dung dịch axit

kaliclorua cho dung dịch chiết vào bình câù 25ml và đổ đầy dung dịch axit kali
clorua đến ngấn.
Hút 5ml dịch chiết axit vào 2 ống nghiệm có kích thƣớc thích hợp. Trong
ống nghiệm thứ nhất, hút 3 ml dung dịch kiềm kali ferixianua, trộn thêm 15ml
izobutanol và lắc mạnh trong 90 giây. Bằng phƣơng pháp oxy hố này, có thể
cho oxy hố tồn bộ thiamin thành thiocrom và đem lắc vào trong lớp
izobutanol. Trong ống nghiệm thứ hai, hút 3 ml dung dịch NaOH vào mẫu
trắng và sau đó 15ml izobutanol. Lắc mạnh trong 90 giây; tiến hành những
bƣớc nhƣ vậy với dung dịch thiamin mẫu chuẩn.

12
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

+ Tách dung dịch thiocrom: tiến hành phân chia izobutanol với lớp nƣớc;
có thể dễ dàng phân tách 2 lớp ấy bằng ly tâm. Rút lớp nƣớc, thêm vào lớp
chiết izobutanol 23g natri sunfat khan và lắc trong 30 giây.
+ Đo huỳnh quang: để tiến hành định lƣợng, thƣờng tiến hành xác định kết
quả theo đƣờng cong đồ thị. Để tính đƣợc nồng độ thiamin trong mẫu cần phải
biết kết quả của 4 lần đo.
2.2.3. Định lượng thiamin bằng phương pháp so màu
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa trên việc đo màu sắc của dẫn xuất
azo của thiamin phát sinh trong quá trình ngƣng tụ thiamin với các thuốc thử
điazo hoá khác nhau. Năm 1934 H. Kinersley và R. Pekers dùng axit
điazobenzen sunfonic làm các chất điazo hoá. Chất azo đƣợc tạo nên màu đỏ và
đƣợc đem lắc với butanol và đem so màu. Phƣơng pháp này tiếp tục đƣợc M.
Itvenberg và cộng sự cải tiến tốt hơn, và thực tế họ đã dùng phƣơng pháp so
màu này rất tốt để định lƣợng thiamin.

2.2.4. Định lượng thiamin bằng phương pháp cân
Thiamin cho những hỗn hợp rất khó tan với axit silicovonframic.
D.Adamson và J. Handisyde đã dùng phản ứng này để định lƣợng thiamin bằng
phƣơng pháp cân trong các chế phẩm dƣợc. Thiamin tạo nên một tủa rất khó
tan với reineckat amoni nhƣ một vài chất amin dự phòng và các muối bậc 4.
Phản ứng này do B. J. Bandelin đầu tiên dùng để tách thiamin ra khỏi các chế
phẩm dƣợc. Ngƣời ta cân trọng lƣợng các kết tủa này để định lƣợng thiamin.
3. TÍNH CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG RIBOFLAVIN
(VITAMIN B2)

3.1. Tính chất
+ Độ hoà tan: trong nƣớc ở 250C: 0,012g trong 100ml.
trong cồn etylic tuyệt đối: 0,0045g trong 100ml.
trong ete: không tan.
trong benzen: không tan.
trong hexan: không tan.
+ Độ quay cực:
[]D25 = -1140 (trong NaOH 0,1N).
+ Riboflavin tƣơng đối vững bền trong mơi trƣờng axit, trong mơi trƣờng
kiềm nó rất dễ bị phá huỷ nhanh. Thuốc thử oxy hoá mạnh nhƣ KMnO 4, lại
13
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

càng làm phá huỷ nhanh. Các chất khử nhƣ H hoạt động, NaHSO 3, TiCl2 khử
nó một cách thuận nghịch thành hợp chất leuco(II) theo công thức dƣới.
Riboflavin dƣới ảnh hƣởng của ánh sáng bị phân huỷ
R

N

CH3

N

O
+2e + 2H+

NH

CH3

N

CH3

CH3

O

R
N

H
N

O
NH

N
H

O

II

Trong môi trƣờng kiềm, phần lớn tạo ra lumiflavin (III) là 6,7,9trimetylizoalloxazin trong môi trƣờng axit tạo ra lumicrom (IV) 6,7đimetylizoalloxazin. Huỳnh quang màu vàng xanh là tính chất đặc biệt của
riboflavin, là đƣợc dùng làm phƣơng pháp định lƣợng trong các nguyên liệu
thiên nhiên. R. Kuhn và G. Moruzzi xác định bằn huỳnh quang của riboflavin
phụ thuộc rất đáng kể vào việc dùng dung môi và pH của dung dịch. Mức tối đa
của huỳnh quang nằm trong giới hạn pH từ 6 - 7.
CH3
N

CH3

N

O
NH

CH3

N

III

CH3
CH3

O

N

H
N

O
NH

N
O

IV

3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng riboflavin
Phƣơng pháp định lƣợng riboflavin hầu hết chỉ tiến hành bằng phƣơng
pháp hố học, vì phƣơng pháp sinh vật học phụ thuộc một cách đáng kể vào
tính chất của động vật và tƣơng đối ít chính xác.
+ Phƣơng pháp sinh vật: ngƣời ta hay dùng nhất là thí nghiệm sự lớn trên
chuột ốm. Phƣơng pháp vi sinh vật học trong những năm gần đây thƣờng đƣợc
dùng dể định lƣợng riboflavin trong những nguyên liệu hiếm về yếu tố đó. E. E.
Snell và F.M. Strong và các đồng nghiệp đã viết về phƣơng pháp dựa trên việc

14
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

theo dõi sự phát triển của việc nuôi cấy lactobacillus casei. M. F. Clark và đồng
nghiệp đã nghiên cứu một trong những cải tiến sau này của phƣơng pháp đó.
+ Về phƣơng pháp lí học, dùng quang phổ tử ngoại và cực phổ để định
lƣợng riboflavin. Ý nghĩa của phƣơng pháp này đến nay cũng chƣa đƣợc đánh
giá đầy đủ.
+ Phƣơng pháp so màu dựa trên sự đo màu của dung dịch riboflavin cũng
là phƣơng pháp phổ biến, tuy nhiên độ nhạy thực tế rất ít.
+ Phƣơng pháp định lƣợng riboflavin bằng huỳnh quang dựa trên sự đo
huỳnh quang màu của chất đó. Nhƣ vậy, cần phải loại trừ ảnh hƣởng do các
chất huỳnh quang mang lại, có thể tiến hành bằng phân tách và sắc kí hoặc định
lƣợng riêng biệt từng phần huỳnh quang trƣớc và sau khi khử riboflavin.
Phƣơng pháp huỳnh quang rất nhạy và tƣơng đối đặc biệt rõ rệt. Vì vậy, ngƣời
ta dùng để định lƣợng riboflavin trong một nguyên liệu thiên nhiên. Phƣơng
pháp định lƣợng lumiflavin dựa trên sự chuyển riboflavin trong môi trƣờng
kiềm bằng những nguồn chiếu sáng mạnh thành những sản phẩm quang học có
huỳnh quang màu vàng rất dễ tan trong clorofoc, khác với riboflavin không tan
trong dung môi này. Phƣơng pháp này rất đặc hiệu, nhƣng cũng có phần thiếu
sót rất cơ bản là sự phân tích bằng ánh sáng khơng xảy ra hồn tồn đƣợc và
hơn thế nữa sản phẩm phân tích do ánh sáng lumichrom và lumiflavin sẽ bị
phân huỷ tiếp ở ánh sáng nhƣ phƣơng pháp sắc kí giấy đã chứng minh.
Sau đây là các phƣơng pháp lí học và hố học để định lƣợng riboflavin.
3.2.1. Phương pháp lí học để định lượng riboflavin
Trong các phƣơng pháp lí học có thể dùng chủ yếu là các phƣơng pháp
quang phổ trong vùng tia tím tử ngoại và phƣơng pháp cực phổ để định lƣợng
riboflavin.

3.2.1.1. Phương pháp quang phổ
R. Kuhn và đồng nghiệp là những ngƣời đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ
của riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nƣớc riboflavin 4 cực đại hấp thụ,

cực đại chính trong vùng 265nm đến 267nm. C. Daglish, M. Baxter xác định
rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc một cách đáng
kể vào pH, và khi xác định kết quả về định lƣợng cần phải đo quang phổ của
mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm nhƣ nhau.
15
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Để chuẩn bị cho dung dịch riboflavin đo quang phổ, cần phải đảm bảo
điều kiện mẫu phải sấy thật khô (sấy khô trên P2O5 hay ở 1000C trong tối), đem
cân và đem hoà tan trong 1ml axit axetic kết tinh, thêm 100ml nƣớc nóng, thêm
nƣớc vừa đủ 1000ml. Pha loãng dung dịch để đo quang phổ bằng HCl 0,01N
làm sao để có pH khoảng 3,0. Nồng độ thích hợp để ghi quang phổ là khoảng
4mg%. Để xác định trị số về định lƣợng, tốt nhất là đo ở bƣớc sóng cực đại
267nm. Quang phổ hấp thụ vùng tím tử ngoại là tiêu chuẩn cần thiết của dung
dịch riboflavin tinh khiết, đƣợc dùng khi định lƣợng bằng phƣơng pháp sinh vật
học và phƣơng pháp hoá học. Sau này phƣơng pháp quang phổ hấp thụ vùng tử
ngoại đƣợc dùng coi nhƣ một phƣơng pháp thử đặc hiệu để xác định các
nguyên liệu riboflavin cũng nhƣ các dƣợc phẩm.

3.2.1.2. Cực phổ
Việc nghiên cứu định lƣợng vitamin B2 bằng cực phổ đã bổ sung rất tốt
tính chất đặc hiệu về hố học của nó. R.Brolica và E. Knobloch là ngƣời đầu
tiên nghiên cứu phƣơng pháp cực phổ để định lƣợng riboflavin và đã nghiên
cứu sự phụ thuộc của việc khử riboflavin vào pH. Trong phƣơng pháp cực phổ
các tác giả đã nghiên cứu theo dõi sự khử của riboflavin thành dạng leuco trong
mơi trƣờng kiềm có dùng NaHSO3. Trong mơi trƣờng axit dùng chất TiCl2.
Công tác nghiên cứu cực phổ xác nhận rằng riboflavin là một chất khử oxy

hoá thuận nghịch. Khi khử riboflavin thành một chất leucolactoflavin cũng
không làm thay đổi thế oxy hoá khử cực, do vậy nên các đƣờng cong cực phổ
đều là những đƣờng cong điện thế tƣơng đối hoàn chỉnh.
Trên đƣờng cong cực phổ của riboflavin, ngƣời ta theo dõi những bƣớc
đầu đặc biệt mà khơng thấy có ở phƣơng pháp điện thế. Phƣơng pháp cực phổ
đƣợc coi nhƣ để nghiên cứu sự phân tích do ánh sáng của riboflavin.
Lumiflavin đƣợc khử ở điện thế giống nhƣ riboflavin, do vậy, hai chất này
không thể định lƣợng cạnh nhau đƣợc bằng phƣơng pháp cực phổ. Lumicrom
bị khử trên điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt ở thế âm hơn riboflavin và cũng vì vậy
có thể định lƣợng nó bằng phƣơng pháp cực phổ cạnh riboflavin.
Phƣơng pháp cực phổ đƣợc dùng có hiệu quả để định lƣợng riboflavin
trong các dƣợc phẩm. Phƣơng pháp này không phù hợp để định lƣợng
riboflavin trong các nguyên liệu sinh vật học, một mặt là vì riboflavin có trong
16
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

các ngun liệu thiên nhiên với nồng độ rất nhỏ, một mặt khác riboflavin ở đó
dƣới dạng kết hợp, nên phƣơng pháp cực phổ khơng có tác dụng.
Khi dùng phƣơng pháp cực phổ để định lƣợng các chế phẩm dƣợc, vì
riboflavin ít hồ tan trong nƣớc, nên cần cho thêm một chất làm tăng sự hoà tan
của nó. Chẳng hạn dung dịch natri salixilat 10% làm tăng sự hồ tan của
riboflavin, sự có mặt của chất này không làm ảnh hƣởng đến việc định lƣợng
riboflavin bằng phƣơng pháp cực phổ.
Việc dùng phƣơng pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lƣợng
riboflavin có trong chế phẩm polivitamin, trong đó có thể tiến hành định lƣợng
thẳng hỗn hợp vitamin nhóm B cịn lại. Để dịnh lƣợng riboflavin bằng phƣơng
pháp cực phổ, việc chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh là rất cần thiết. Trong thí

nghiệm dùng phƣơng pháp cực phổ để định lƣợng riboflavin một cách chính
xác và đặc hiệu nhất trong cơng nghiệp dƣợc thì dùng 100% mẫu chuẩn.

3.2.1.3. Sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký có một giá trị để định lƣợng riboflavin trong các
nguyên liệu thiên nhiên, gồm cả phƣơng pháp pháp sắc ký hấp phụ, và sắc ký
phân chia. Trong đó phƣơng pháp sắc ký trên giấy có giá trị đặc biệt nhất. F.
Weygemel và K. Wacker dùng frankonit làm chất hấp phụ để định lƣợng
riboflavin trong nƣớc tiểu. W. Neuweiler dùng đất sét nung để định lƣợng trong
sữa. Trong những chất hấp phụ khác nhau cịn dùng sunfua chì, floridin và một
vài loại đất sét hấp phụ khác dùng trong kỹ nghệ (đất sét dùng trong kĩ nghệ
chất béo). Để định lƣợng riboflavin cạnh thiamin R.T. Conner và G.J. Straub
dùng sự phân chia thành 2 hệ hấp phụ, pecmutit (thiamin) và floridin
(riboflavin). Huỳnh quang màu vàng xanh đậm của riboflavin đƣợc coi nhƣ
chất phát hiện trong phƣơng pháp sắc kí. Để nghiên cứu việc tìm chất flavinađenin nucleotit trong các tế bào động vật, J. L. Clamen lần đầu tiên dùng kĩ
thuật sắc kí giấy để làm phƣơng pháp phân tích riboflavin. Sau đó phƣơng pháp
này đƣợc tiếp tục để định lƣợng riboflavin trong các nguyên liệu thiên nhiên
dạng kết hợp khác nhau và trong các môi trƣờng nuôi cấy vi trùng. Vấn đề
thuận lợi là có thể theo dõi bằng phƣơng pháp sắc kí trên giấy sản phẩm phân
huỷ bằng ánh sáng của riboflavin, bởi vì một trong những sản phẩm phân huỷ
chính có một huỳnh quang (xanh lơ) khác riboflavin.
3.2.2. Phương pháp định lượng riboflavin bằng huỳnh quang và so màu
17
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

3.2.2.1. Phương pháp huỳnh quang
Đo huỳnh quàng màu vàng xanh của riboflavin đƣợc coi nhƣ là một

phƣơng pháp cơ bản hay dùng nhất để định lƣợng chất này trong các nguyên
liệu thiên nhiên. Nồng độ của huỳnh quang phụ thuộc vào pH của dung dịch, độ
cực đại nằm trong vùng pH 6 - 7. Huỳnh quang giảm mạnh nhất ở pH dƣới 3,8
và pH >7,7. Nồng độ huỳnh quang giảm khi có mặt của các halogen, xianua,
rodanua, sunfua và muối sắt. Leucolactoflavin khơng có huỳnh quang. Độ
chính xác của phƣơng pháp đo huỳnh quang dựa trên cơ sở điều kiện chiết và
loại trừ các huỳnh quang phụ có ảnh hƣởng khi đo.
Riboflavin có trong thiên nhiên phần lớn kết hợp với anbumin dƣới dạng
este của axit photphoric, và dạng này khi chiết cần phải tách ra. Phần lớn các
tác giả chiết bằng axit vơ cơ lỗng (H2SO4 0,2N). Có ngƣời lại xác định bằng
đun nóng nguyên liệu chiết với axit photphoric hay đun nóng dƣới áp suất trong
môi trƣờng HCl 0,1N. M. L. Wagner và A.R. Kemmerer lại tiến hành thuỷ
phân bằng men enzym tatradiastaza hay bằng các photphataza khác. Thông
thƣờng để khỏi làm ngăn cản huỳnh quang, ngƣời ta thƣờng tiến hành oxy hoá
bằng dung dịch KMnO4 lỗng trong mơi trƣờng axit. Lƣợng KMnO4 thừa đƣợc
loại một cách nhanh chóng bằng cách cho thêm nƣớc oxy già. W. Koschara là
ngƣời đầu tiên dùng phƣơng pháp này. Các tác giả tiến hành chiết bằng
hyđrounfit, nhƣ vậy sẽ loại tất cả các thành phần, và trong phƣơng pháp coi nhƣ
chỉ có mình lactoflavin là có tính chất oxy hố thuận nghịch bởi oxy khơng khí.
A. Emmerie trong khi hoàn thiện phƣơng pháp đã tiến hành bằng metanol,
hấp phụ lactoflavin kết hợp và tự do với sunfua chì và tiến hành chiết bằng
dung dịch nƣớc pyridin trong axit axetic (nƣớc - pyridin - axit axetic = 7,8 : 2 :
0,2). Dịch chiết lấy đƣợc loại trừ các huỳnh quang phụ bằng cách oxy hoá với
KMnO4. G. Luade, H. Kringstael và A. Olsen hấp phụ riboflavin từ dịch chiết
với frankomit, ngăn cản các màu phụ đi theo bằng KMnO4 và sau đó tiến hành
khử bằng hyđrosunfit. Từ huỳnh quang trƣớc và sau khi khử có thể tính đƣợc
hàm lƣợng riboflavin.Lactoflavin ở trong các mô động vật phần lớndƣới dạng
kết hợp với anbumin; chất đƣợc tạo nên này không phát quang, vì thế khi định
lƣợng hàm lƣợng tồn phần cần phải giải phóng riboflavin ra khỏi dạng kết
hợp. Thơng thƣờng tiến hành chiết bằng axit, hay bằng cách đun chế phẩm

trong nồi hấp.
18
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Khi tiến hành theo A.Z. Hudson và L. C. Norvise và tốt hơn là theo V.A.
Najjar, riboflavin đƣợc chuyển sang dạng khử và dạng này có thể bị oxy hố
ngƣợc lại bằng oxy khơng khí trên riboflavin. Các tác giả đều xác nhận rằng
các chất màu và huỳnh quang đi theo đều khơng bị oxy hố bởi oxy. Để sắp xếp
theo V. Najjar cần phải đo sự khác nhau về huỳnh quang trƣớc và sau khi khử.
Đồng thời chú ý ảnh hƣởng cuả môi trƣờng đối với nồng độ của huỳnh quang
đo đƣợc, cần phải tiến hành mẫu chuẩn.
Huỳnh quang đƣợc đo bằng các loại máy huỳnh quang so màu khác nhau.

3.2.2.2. Phương pháp so màu riboflavin
Định lƣợng riboflavin bằng so màu là phƣơng pháp cũ nhất để định lƣợng
chất này trong các nguyên liệu thiên nhiên và dựa trên cơ sở đo cƣờng độ màu
vàng của dung dịch riboflavin. Phƣơng pháp này chỉ dùng cho một vài nguyên
liệu, khi biết là các chất màu phụ rất ít, ở mức tối thiểu.
Việc cải tiến của các tác giả bao gồm việc chiết nguyên liệu để thử với
axeton 75% loại các chất màu phụ bằng nƣớc oxy gìa 30% và đo sự hấp thụ của
ánh sáng màu vàng của dung dịch trƣớc và sau khi khử riboflavin bằng
NaHSO3. Sau đó từ những sự hấp thụ khác nhau, ngƣời ta xác định đƣợc nồng
độ của riboflavin. F. Weygand và K. Wacker đã cải tiến để định lƣợng
riboflavin bằng phƣơng pháp so màu trong nƣớc tiểu. Bên cạnh sự oxy hố, tác
giả cịn đề cập đến phƣơng pháp sắc kí với frankomit thành dạng leuco để có
thể chiết ra định lƣợng đƣợc. Sau khi chiết lại oxy hoá một lần nữa bằng oxy
khơng khí dạng leuco chuyển sang riboflavin. Các chất màu phụ kèm theo đƣợc

oxy hoá bằng KMnO4. Tiến hành đo bằng máy quang sắc kế Pulfric với kính
lọc S.45. J. Effern đã nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng so màu đơn giản
trong sữa bò và W. Neuweiler đã nghiên cứu một cải tiến rất thông dụng trong
lâm sàng để định lƣợng sữa mẹ.
4. PHÂN TÍCH TRẮC QUANG

4.1. Cơ sở của phƣơng pháp phân tích trắc quang
Phƣơng pháp này dựa trên sự hấp thụ năng lƣợng ánh sáng của một chất
xác định ở một vùng phổ nhất định. Chất phân tích đƣợc chuyển thành một chất
màu có khả năng hấp thụ năng lƣợng và hàm lƣợng chất phân tích đƣợc xác
định bằng cách đo sự hấp thụ ánh sáng của chất màu. Nhƣ vậy, phản ứng hoá
19
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

học chiếm vị trí chủ chốt trong phân tích trắc quang. Thời gian tiến hành phân
tích, độ nhạy, độ chính xác và tính chọn lọc của phƣơng pháp phụ thuộc chủ
yếu vào việc lựa chọn phản ứng hoá học và các điều kiện tối ƣu để tạo thành
chất màu.
Phƣơng pháp phân tích trắc quang gắn liền với các hợp chất màu, dùng
màu sắc để phân tích đối tƣợng nghiên cứu. Nó đƣợc tiến hành theo các bƣớc
sau:
+ Đƣa đối tƣợng nghiên cứu vào dung dịch.
+ Tạo hợp chất màu với thuốc thử thích hợp (nếu chất nghiên cứu không
phải là chất màu).
+ Chọn các điều kiện tối ƣu để phép đo đƣợc chính xác.
+ Mật độ quang (xác định cƣờng độ chất màu nghiên cứu).
+ Đánh giá kết quả phân tích (tính nồng độ và nhận xét).

Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa vào định luật hấp thụ ánh sáng của
Bughe - Lambe - Bia.
Biểu thức định lƣợng:
D = .l.C
Trong đó: D - mật độ quang của dung dịch nghiên cứu tìm đƣợc trên máy so
màu.
D = lg(I0/I)
I0 - cƣờng độ dòng sáng tới; I - cƣờng độ dòng sáng sau khi bị hấp thụ.
- hệ số hấp thụ phân tử gam (phụ thuộc bản chất của chất màu.
C - Nồng độ của dung dịch nghiên cứu.
l - bề dày của dung dịch màu.
Nhƣ vậy, để xác định C ta phải đo mật độ quang trên máy. Tuy nhiên, khi
phân tích trắc quang phải chú ý đến các yếu tố làm sai định luật Bughe - Lambe
- Bia và khoảng nồng độ của nó phụ thuộc tuyến tính.
Một số yếu tố làm sai lệch định luật Bughe - Lambe - Bia
+ Sự có mặt của chất điện giải lạ trong dung dịch chất màu của chúng đã
làm biến dạng các phần tử hoặc các ion có màu và do đó làm sai lệch khỏi định
luật Bia.
+ Sự solvat hoá hay sự hyđrat hoá làm giảm dung mơi tự do, do đó làm
thay đổi nồng độ chất màu.
20
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

+ Hiệu ứng liên hợp: đó là một số trƣờng hợp có sự tƣơng tác giữa các tiểu
phân mang màu tạo ra tiểu phân polime, do đó làm thay đổi chất màu.
+ Ảnh hƣởng của mức độ đơn sắc của ánh sáng.
+ Ảnh hƣởng pH của dung dịch. Sự thay đổi có thể dẫn đến thay đổi cấu

tạo và thành phần của chất màu và do đó làm thay đổi nồng độ hoặc khả năng
hấp thụ ánh sáng của chất màu.
+ Ảnh hƣởng của sự pha lỗng: khi pha lỗng dung dịch màu thì có thể
làm chuyển dịch cân bằng trong dung dịch có cân bằng của chất màu. Do đó
làm thay đổi thành phần của chất màu.

4.2. Các phƣơng pháp xác định nồng độ trong phân tích trắc
quang
Sau khi đã chọn các điều kiện tối ƣu và loại bỏ đƣợc các ảnh hƣởng cho
phép đo quang, ta tiến hành xác định nồng độ của chất màu theo các cách sau.
4.2.1. Phương pháp dãy tiêu chuẩn
Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm chứa dung dịch chuẩn của chất màu cần
phân tích với các nồng độ khác nhau. Sau đó chuẩn bị dung dịch phân tích với
điều kiện nhƣ dung dịch chuẩn, rồi đem so màu của dung dịch phân tích với
dãy màu tiêu chuẩn. Dung dịch phân tích có màu bằng màu của dung dịch
chuẩn nào thì có hàm lƣợng bằng hàm lƣợng của dung dịch chuẩn đó.
4.2.2. Phương pháp cân bằng
Từ biểu thức
D = .l.C
ta thay đổi l thì có thể tìm đƣợc một vị trí mà tại đó có 2 dung dịch màu có màu
nhƣ sau:
Cx = (l1C1)/lx
l1, C1 là bề dày và nồng độ của dung dịch chuẩn;
lx, Cx là bề dày và nồng độ của dung dịch nghiên cứu.
4.2.3. Phương pháp thêm
Lấy cùng một lƣợng dung dịch cần phân tích (Cx) vào 2 bình định mức (1
và 2) thêm vào bình (2) một lƣợng chất chuẩn của chất phân tích (Ca). Thực
hiện phản ứng màu ở cả hai bình trong các điều kiện tối ƣu đã chọn hoàn toàn
nhƣ nhau. Đem đo mật độ quang hai dung dịch với cùng một bƣớc sóng thích
hợp và cùng một loại dung dịch so sánh. Theo định luật Bia ta có:

21
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Da = .l.C
Da = .l(Cx + Ca)
Cx = (Dx.Ca)/(Da - Dx)
Phƣơng pháp này loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của các chất lạ.
4.2.4. Phương pháp đường chuẩn
Phƣơng pháp đƣờng chuẩn là phƣơng pháp đƣợc dùng trong phân tích
hàng loạt mẫu, cho phép phân tích, tính tốn kết quả khá nhanh.
+ Trƣớc hết pha một dãy dung dịch chuẩn có lƣợng dung dịch chuẩn tăng
dần, cịn các điều kiện khác nhƣ nhau. Sau đó đo mật độ quang của các dung
dịch chuẩn và lập đồ thị:
D = f(C)
Đồ thị này đƣợc gọi là đƣờng chuẩn. Khi đó, sử dụng dung dịch so sánh là
dung dịch trắng chứa tất cả các cấu tử nhƣ dung dịch chuẩn, trừ cấu tử cần định
lƣợng.
Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu với các điều kiện nhƣ dung dịch chuẩn,
sau đó đo mật độ quang của dung dịch nghiên cứu (Dx) rồi dựa vào đồ thị chuẩn
tính đƣợc nồng độ của chất nghiên cứu. Để dùng đƣợc phƣơng pháp này thì sự
hấp thụ ánh sáng của dung dịch phải tuân theo định luật Bughe - Lambe - Bia,
nghĩa là có sự tuyến tính giữa C và D.
4.2.5. Phương pháp vi sai
Phƣơng pháp vi sai dùng để tăng nồng độ chính xác của phép phân tích
khi cần xác định lƣợng lớn. Phƣơng pháp này cịn cho phép sử dụng trong
trƣờng hợp định luật Bia bị vi phạm khi nồng độ chất màu lớn.
Trong phƣơng pháp trắc quang vi sai thì dung dịch so sánh khơng phải là

dung môi nguyên chất, mà dùng một trong các dung dịch sau:
+ Dung dịch có nguyên tố cần xác định với nồng độ bé hoặc lớn hơn nồng
độ của nó trong dung dịch nghiên cứu đƣợc dùng làm dung dịch so sánh.
+ Dùng một phần dung dịch nghiên cứu làm dung dịch so sánh.
+ Dung dịch có chứa tất cả các cấu tử, trừ ion cần xác định làm dung dịch
so sánh. Cơ cấu lý thuyết của phƣơng pháp trắc quang vi sai là do C. Hiskey và
cộng sự đề xƣớng. Phƣơng pháp này có 2 cách thực hiện sau:
Cách 1:
22
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Dung dịch có ngun tố cần xác định với nồng độ bé hơn nồng độ của nó
trong dung dịch nghiên cứu đƣợc dùng làm dung dịch so sánh. Ta xác định mật
độ quang của dung dịch nghiên cứu theo dung dịch so sánh, nồng độ của chất
nghiên cứu trong dung dịch cần phân tích đƣợc xác định theo cơng thức sau:
Cx = Dx.F + C1
trong đó: Cx - nồng độ dung dịch phân tích.
C1 - nồng độ của chất cần xác định trong dung dịch so sánh.
F =  C/D'2 với C = C2 - C1
D2' = D2 - D1
Cách 2:
Ta dùng một phần dung dịch nghiên cứu làm dung dịch so sánh. Trong
trƣờng hợp này ta chuẩn bị 3 dung dịch nghiên cứu:
+ Dung dịch thứ nhất: là một phần dung dịch nghiên cứu với thể tích V 1
(ml) làm dung dịch so sánh.
+ Dung dịch thứ hai: cũng là dung dịch nghiên cứu, với thể tích V2(ml),
V2>V1. Dung dịch này cần có hàm lƣợng chất cần xác định là Cx.

+ Dung dịch thứ 3: là dung dịch nghiên cứu, có hàm lƣợng chất cần xác
định là Cx với thể tích V2(ml) và thêm một lƣợng nhỏ nguyên tố cần xác định
có hàm lƣợng đã biết Ca.
Sau khi tiến hành đo giá trị mật độ quang của các dung dịch thứ hai và thứ
ba theo dung dịch thứ nhất, ta có:
Dx =.l. Cx
 (Dx + Da) = .l.(Cx + Ca)
 Cx = (Dx.Ca)/Da
Trong đó: Dx: mật độ quang của dung dịch thứ hai so với dung dịch thứ
nhất (dung dịch so sánh)
Da: mật độ quang của dung dịch thứ ba so với dung dịch thứ hai.
Bằng cách đo nhƣ vậy ta xác định đƣợc dễ dàng hàm lƣợng chƣa biết Cx.

23
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học


Chun ngành Hố phân tích

Phần II

THỰC NGHIỆM
Để tiến hành định lƣợng riboflavin theo phƣơng pháp so màu đã nói ở
trên. Trƣớc hết chúng tôi định lƣợng trƣớc riboflavin tại Trung tâm kiểm
nghiệm dƣợc phẩm Hà Tĩnh, dựa trên máy quang phổ tử ngoại. Từ số liệu thu
đƣợc của phƣơng pháp định lƣợng này, chúng tơi lại dùng nó xem nhƣ là mẫu
chuẩn, dựa vào mẫu này để xây dựng quy trình định lƣợng riboflavin theo
phƣơng pháp cổ điển đã nêu và tiến hành thực hiện taị phịng thí nghiệm khoa
Hố - Đại học Vinh.
1. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN B2 BẰNG PHƢƠNG PHÁP

QUANG PHỔ (tại Trung tâm kiểm nghiệm dƣợc phẩm Hà Tĩnh).

1.1. Dụng cụ hố chất:
+ Bình định mức 1000ml;
+ Nƣớc cất.
+ Thiết bị đun cách thuỷ;
+ Thuốc viên vitamin B2(XNDP TW2 với hàm lƣợng ghi sẵn là 2mg).
+ Máy quang phổ tử ngoại Varian Cary IE.
+ Dung dịch NaOH 0,1N.
+ Axit axetic băng.

1.2. Tiến hành định lƣợng
Cân chính xác một lƣợng tƣơng ứng 10mg vitamin B 2. Cho vào bình định
mức 1000ml. Cho vào 5ml axit axetic băng, thêm 100ml nƣớc. Đun cách thuỷ
1h, sau đó đem lắc đều để hồ tan mẫu. Pha lỗng với nƣớc. Để nguội, sau đó
cho thêm 30ml dung dịch NaOH 0,1N - thêm nƣớc đến vạch, lắc đều. Sau đó
lọc bỏ cặn. Đo mật độ quang D ở  = 444  1nm. A11 = 323. Ta thu đƣợc hàm
lƣợng vitamin B2 trong mỗi viên thuốc là 1,96mg.
+Nhận xét:
24
Luận văn tốt nghiệp cử nhân sư phạm ngành Hoá học