luận văn thạc sĩ khảo sát một số yếu tố liên quan đến chất lượng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn tại ngân hàng tế bào gốc, bệnh viện đa khoa tâm anh
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.33 MB, 98 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Bích
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI
NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Bích
KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI
NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Thẩm Thị Thu Nga
Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Trung Nam
Hà Nội - 2021
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn khoa học
của TS. Thẩm Thị Thu Nga và TS. Nguyễn Trung Nam. Các số liệu và kết
quả thu đƣợc trong luận văn hồn tồn trung thực và chƣa đƣợc ai cơng bố
trong bất kì cơng trình nào khác. Tồn bộ trích dẫn trong luận văn đều chỉ rõ
nguồn gốc.
Tôi xin chịu mọi trách nhiệm liên quan đến nội dung đề tài này.
Hà Nội, tháng 04 năm 2021
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Bích
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Thẩm Thị Thu
Nga – giáo viên hƣớng dẫn của tôi. Cảm ơn cô đã cho tôi cơ hội, hƣớng dẫn,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn này. Nhờ có sự hỗ
trợ của cơ tơi mới có đƣợc điều kiện tốt nhất để học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Thanh Mai, ngƣời đã
giải đáp cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên mơn trong q trình làm luận
văn.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Trung Nam, phó viện
trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt
Nam đã hƣớng dẫn, hỗ trợ trong quá trình hồn thiện luận văn.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả đồng nghiệp của tôi
tại Trung tâm Tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội đã hỗ trợ rất
nhiều trong công việc suốt 2 năm học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Học viện Khoa học và Công nghệ đã
tạo điều kiện học tập và giảng dạy tốt nhất cho học viên để hồn thành khóa
học thành công và hiệu quả.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện đa khoa Tâm Anh
Hà Nội đã tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian, kinh phí để tơi có thể hồn thành
nghiên cứu này.
Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã là
chỗ dựa tinh thần cho tôi khi gặp phải khó khăn, áp lực trong thời gian 2 năm
học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 11 tháng 04 năm 2021
Nguyễn Thị Bích
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chú giải
AABB
American Association of Blood Banks (Hiệp hội
truyền máu Hoa Kỳ)
AGM
Aorto-Gonado-Mesonephros
CD
Cluster of Differentiation (Cụm biệt hóa)
CFU
Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
CMV
Cytomegalo virus
DMSO
Dimethyl sulfoxide
EDQM
European Directorate for the Quality of Medicines &
HealthCare (Cục Quản lý Chất lƣợng Thuốc & Chăm
sóc sức khỏe Châu Âu)
FDA
Food and Drug Administration (Cục quản lý thuốc và
dƣợc phẩm Hoa Kỳ
GVHD
Graft versus host disease (Bệnh ghép chống chủ)
HLA
Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu
ngƣời)
HPC
Hematopoietic progenitor cell (Tế bào tiền thân tạo
máu)
HSC
Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu)
HSCT
Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Cấy ghép
tế bào gốc tạo máu)
iPSC
Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc đa năng
cảm ứng)
IT-HSC
Intermediate-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào
gốc tạo máu trung hạn)
LT-HSC
Long-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo
máu dài hạn)
MEP
Megakaryocyte/erythrocyte progenitors (Tế bào tiền
thân Megakaryocyte/erythrocyte)
MPP
Multipotent progenitors (Tế bào tiền thân đa năng)
NK
Natural Killer cell (Tế bào giết tự nhiên)
ST-HSC
Short-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo
máu ngắn hạn)
TNC
Total Nucleated Cell (Tế bào đơn nhân)
WBMT
Worldwide Network for Blood & Marrow
Transplantation (Hiệp hội ghép tủy toàn cầu)
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. TẾ BÀO GỐC.......................................................................................... 4
1.1.1.
Khái niệm ....................................................................................... 4
1.1.2.
Phân loại ......................................................................................... 4
1.2. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ...................................................................... 5
1.2.1.
Khái niệm ....................................................................................... 5
1.2.2.
Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu ...................... 6
1.2.3.
Q trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu ........................................... 6
1.2.4.
Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu ...................................... 10
1.3. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN ................................ 11
1.2.1.
Cấu tạo dây rốn ............................................................................ 11
1.2.2.
Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn .............................. 12
1.2.3.
So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xƣơng và máu ngoại vi..... 13
1.2.4.
Ƣu điểm của máu dây rốn trong cấy ghép ................................... 15
1.2.5.
Nhƣợc điểm của máu dây rốn trong cấy ghép ............................. 15
1.2.6.
Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn ............................................... 15
1.2.7.
Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn .............................................. 17
1.2.8. Nghiên cứu trên thế giới về các yếu tố liên quan đến chất lƣợng
máu dây rốn ................................................................................................. 20
1.2.9.
Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu tại Việt Nam .............. 22
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................... 24
2.2.1.
Đối tƣợng nghiên cứu................................................................... 24
2.2.2.
Hóa chất........................................................................................ 24
2.2.3.
Thiết bị ......................................................................................... 24
2.2.4.
Vật tƣ tiêu hao .............................................................................. 25
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 27
2.3.1.
Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 27
2.3.2.
Nội dung nghiên cứu .................................................................... 28
2.3.3.
Kỹ thuật thu thập máu dây rốn ..................................................... 29
2.3.4.
Kỹ thuật xử lý máu dây rốn .......................................................... 31
2.3.5.
Kỹ thuật đánh giá chất lƣợng máu dây rốn sau xử lý .................. 33
2.3.6.
Phân tích thống kê ........................................................................ 37
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 39
3.1.1.
Kết quả thu thập mẫu ................................................................... 39
3.1.2.
Đặc điểm thống kê các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn ......... 40
a)
Đặc điểm sản phụ ............................................................................ 40
b)
Đặc điểm trẻ sơ sinh ........................................................................ 42
c)
Đặc điểm chỉ số chất lượng máu dây rốn ....................................... 44
3.1.3.
Các yếu tố liên quan đến chỉ số chất lƣợng tế bào gốc tạo máu .. 48
a)
Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn ........... 48
b)
Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng TNC ...................... 50
c)
Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng tế bào CD34+ ....... 52
d)
Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với tỷ lệ tế bào CD34+ .............. 53
3.1.4. Tƣơng quan giữa các yếu tố sản phụ và chỉ số đánh giá chất lƣợng
của đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 54
3.1.5. Tƣơng quan giữa yếu tố trẻ sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất
lƣợng đơn vị máu dây rốn ........................................................................... 55
3.1.6.
Tƣơng quan của một số yếu tố khác ............................................ 56
3.1.7.
rốn
Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến chất lƣợng của đơn vị máu dây
57
a)
Ảnh hưởng của thể tích máu dây rốn đến số lượng TNC ................ 57
b)
Ảnh hưởng của thể tích máu đến số lượng tế bào CD34+ .............. 59
c)
Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu đến tỷ lệ tế bào sống ....... 60
3.1.8.
Mơ hình ƣớc lƣợng số lƣợng TNC ............................................... 61
3.2. THẢO LUẬN ........................................................................................ 64
3.2.1.
Các yếu tố sản phụ ....................................................................... 64
3.2.2.
Các yếu tố trẻ sơ sinh ................................................................... 67
3.2.3.
Thời gian bảo quản mẫu trƣớc xử lý ............................................ 70
3.2.4.
Các chỉ số chất lƣợng tế bào gốc máu dây rốn ............................ 71
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 75
4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 75
4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 77
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Sự khác biệt giữa tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác nhau ..... 14
Bảng 1.2. Tổng hợp các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn
......................................................................................................................... 20
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ......................................................................... 24
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị............................................................................ 24
Bảng 2.3. Danh mục dụng cụ, vật tƣ tiêu hao ................................................. 25
Bảng 2.4. Tóm tắt thơng tin nhuộm mẫu với kháng thể ................................. 36
Bảng 3.1. Thống kê các đơn vị máu dây rốn đƣợc tiến hành thu thập ........... 39
Bảng 3.2. Đặc điểm về độ tuổi của sản phụ .................................................... 40
Bảng 3.3. Đặc điểm sản khoa .......................................................................... 41
Bảng 3.4. Đặc điểm thống kê tuổi thai và cân nặng trẻ sơ sinh ...................... 42
Bảng 3.5. Đặc điểm thống kê của các chỉ số chất lƣợng máu dây rốn đạt tiêu
chuẩn sau khi xử lý.......................................................................................... 44
Bảng 3.6. Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập ......................... 48
Bảng 3.7. Một số yếu tố liên quan đến số lƣợng TNC ................................... 50
Bảng 3.8. Một số yếu tố liên quan với số lƣợng tế bào CD34+ ...................... 52
Bảng 3.9. Một số yếu tố liên quan với tỷ lệ tế bào CD34+ ............................. 53
Bảng 3.10. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sản phụ và các chỉ số đánh giá
chất lƣợng đơn vị máu dây rốn ....................................................................... 54
Bảng 3.11. Tƣơng quan giữa một số yếu tố sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất
lƣợng đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 55
Bảng 3.12. Tƣơng quan giữa một số yếu tố khác và các chỉ số đánh giá chất
lƣợng đơn vị máu dây rốn ............................................................................... 56
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của thể tích máu dây rốn lên số lƣợng TNC ............. 57
Bảng 3. 14. So sánh chỉ số TNC với ngƣỡng thể tích 80mL .......................... 58
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thể tích máu đến số lƣợng CD34+ ....................... 59
Bảng 3.16. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính giữa thể tích máu và số lƣợng
tế bào CD34+ ................................................................................................... 60
Bảng 3.17. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ tế bào sống ............ 60
Bảng 3.18. Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính đa biến cho số lƣợng TNC 62
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ q trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) ................ 9
Hình 1.2. Q trình biệt hóa HSC. (A) mơ hình biệt hóa rời rạc, (B) mơ hình
biệt hóa liên tục ................................................................................................. 9
Hình 1.3. Cấu tạo dây rốn ở ngƣời .................................................................. 11
Hình 1.4. Quy trình từ khi thu thập máu cho đến khi cấy ghép ...................... 17
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ................................................................ 27
Hình 2.2. Túi máu dây rốn sau khi thu thập .................................................... 31
Hình 2.3. Phân lớp các thành phần máu dây rốn trên một gradient FicollHypaque .......................................................................................................... 32
Hình 3.1. Phân bố độ tuổi của sản phụ............................................................ 40
Hình 3.2. Phân bố giới tính trẻ sơ sinh............................................................ 42
Hình 3.3. Phân bố tuổi thai.............................................................................. 43
Hình 3.4. Phân bố cân nặng trẻ sơ sinh ........................................................... 43
Hình 3.5. Phân bố thể tích máu dây rốn của các đơn vị đƣợc thu thập .......... 45
Hình 3.6. Phân bố số lƣợng TNC .................................................................... 45
Hình 3.7. Phân bố số lƣợng tế bào CD34+ ...................................................... 46
Hình 3.8. Phân bố tỷ lệ tế bào sống ................................................................ 47
Hình 3.9. Liên hệ tuyến tính giữa thể tích máu dây rốn và TNC ................... 58
Hình 3.10. Liên hệ tuyến tính giữa thời gian bảo quản mẫu và tỷ lệ tế bào
sống ................................................................................................................. 61
1
MỞ ĐẦU
Tế bào gốc tạo máu là tế bào gốc đa năng có chức năng quan trọng
trong việc sản xuất và duy trì tất cả các dịng tế bào máu trƣởng thành trong
suốt cuộc đời con ngƣời [1].
Tế bào gốc tạo máu đƣợc sử dụng trong điều trị lâm sàng có hiệu quả
đƣợc lấy từ ba nguồn khác nhau: tủy xƣơng, máu ngoại vi và máu dây rốn.
Ghép tế bào gốc tạo máu đòi hỏi sự phù hợp HLA rất chặt chẽ nên việc tìm
đƣợc ngƣời phù hợp hồn tồn về HLA là một khó khăn lớn. Khó khăn này
tăng thêm ở các quốc gia đa chủng tộc vì hệ HLA có những đặc trƣng riêng
theo từng chủng tộc. Theo báo cáo thƣờng niên năm 2019 về ghép tế bào gốc
tại châu Âu, năm 2018 trong số gần 18000 bệnh nhân tìm ngƣời cho khơng
cùng huyết thống chỉ có khoảng hơn 9000 ngƣời đƣợc ghép mặc dù có
khoảng 1.4 triệu ngƣời đăng ký hiến tế bào gốc tạo máu ở Châu Âu trong năm
2018, nâng tổng số ngƣời hiến lên hơn 14 triệu tại các nƣớc thành viên EU và
gần 37 triệu trên toàn thế giới [2, 3].
Ghép tế bào gốc tạo máu bao gồm ghép tự thân và ghép đồng loài.
Trong trƣờng hợp ghép đồng loài, ngƣời hiến tủy xƣơng hoặc tế bào gốc tạo
máu ngoại vi sẽ đƣợc huy động vào thời điểm bệnh nhân đã đƣợc điều trị hóa
chất đủ điều kiện ghép. Vì vậy, hiện nay nhiều quốc gia trên thế giới đã có
chƣơng trình đăng ký hiến tủy và hiến tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, tế
bào gốc sử dụng trong các trƣờng hợp này hồn tồn khơng cần phải lƣu trữ.
Tế bào gốc tạo máu sử dụng trong trƣờng hợp ghép tự thân đƣợc lƣu trữ đông
lạnh nhƣng chỉ trong một thời gian ngắn phải sử dụng ngay sau khi bệnh nhân
đƣợc điều trị hóa chất và đủ điều kiện ghép.
Từ khi đƣợc phát hiện vào năm 1980, tế bào gốc tạo máu phân lập từ
máu dây rốn đƣợc coi là nguồn tiềm năng cho ghép tế bào gốc tạo máu trong
điều trị. Máu dây rốn đƣợc thu thập ngay sau khi sản phụ sinh con, sau đó trải
qua q trình xử lý, lƣu trữ đông lạnh để kéo dài đời sống. Chứng minh thành
cơng rằng máu dây rốn có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu và miễn dịch
của bệnh nhân cùng với việc xác nhận rằng máu dây rốn có thể bảo quản lạnh
để sử dụng sau này dẫn đến việc thành lập các ngân hàng máu dây rốn trên
2
khắp thế giới đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu đang ngày càng gia
tăng. Những bệnh nhân có chỉ định ghép tế bào gốc máu có thể tìm những
đơn vị máu dây rốn phù hợp thơng qua những dữ liệu lƣu trữ trong ngân hàng
máu dây rốn.
Tuy nhiên, một trong những hạn chế của nguồn tế bào gốc tạo máu từ
máu dây rốn so với máu ngoại vi đƣợc huy động và từ tủy xƣơng là số lƣợng
tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị thấp, do vậy máu dây rốn phù hợp để
ghép cho trẻ em hơn là ngƣời lớn. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu từ
máu dây rốn đòi hỏi thời gian và chi phí tốn kém, do đó ngƣời ta thƣờng cố
gắng chỉ xử lý những đơn vị máu dây rốn cho số lƣợng tế bào có nhân và tế
bào CD34+ tối ƣu – hai chỉ số đƣợc coi là quyết định thành công của các ca
ghép tế bào gốc tạo máu. Do vậy, việc xác định chiến lƣợc hợp lý từ khâu
sàng lọc, thu thập mẫu cho đến xử lý mẫu và cuối cùng là ghép không chỉ
tránh lãng phí chi phí, tiết kiệm khơng gian lƣu trữ có giá trị cho các đơn vị
chất lƣợng tốt mà còn tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn ngƣời bệnh. Trong đó
bƣớc đầu khảo sát các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến chất lƣợng tế bào
gốc tạo máu từ máu dây rốn có vai trị quan trọng chiến lƣợc cải thiện chất
lƣợng ngân hàng máu dây rốn. Đồng thời từ kết quả phân tích các yếu tố, đƣa
ra những khuyến cáo, tƣ vấn cho bệnh nhân cũng nhƣ giúp tìm ra những
ngun nhân sai sót, cải thiện quy trình kỹ thuật, nâng cao hiệu quả.
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm tế
bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm: các yếu tố sản khoa, yếu tố thuộc
về sản phụ, các yếu tố trẻ sơ sinh, các yếu tố trong thu thập và xử lý mẫu.
Trong rất nhiều yếu tố có khả năng ảnh hƣởng, các yếu tố sản phụ bao gồm:
tuổi ngƣời mẹ, nhóm máu, phƣơng pháp sinh, số lần mang thai, số lƣợng thai;
các yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: tuổi thai, cân nặng, giới tính; yếu tố trong xử
lý mẫu gồm: thời gian bảo quản mẫu, thể tích máu là những yếu tố đƣợc quan
tâm nhiều nhất vì đặc điểm dễ tiếp cận, dễ thu thập thơng tin và có nhiều
nghiên cứu cho kết quả khơng thống nhất. Do đó, trong phạm vi của nghiên
cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng đến các chỉ số chất
lƣợng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn của một số yếu tố kể trên.
3
Trên thế giới, có nhiều chƣơng trình tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh
hƣởng đến chất lƣợng máu dây rốn, tuy nhiên các yếu tố này có thể thay đổi ở
các quốc gia và chủng tộc khác nhau khiến cho các tiêu chuẩn mà thế giới đƣa
ra có thể không phù hợp với Việt Nam. Ngân hàng tế bào gốc thuộc Bệnh
viện đa khoa Tâm Anh đƣợc xây dựng theo mơ hình ngân hàng máu dây rốn
tƣ nhân, đƣợc thành lập vào năm 2019. Với mục đích lƣu trữ nguồn tế bào
gốc tạo máu từ máu dây rốn chất lƣợng dùng trong điều trị chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài nghiên cứu này với các mục tiêu sau :
1- Đánh giá chất lƣợng các đơn vị máu dây rốn thu thập tại Bệnh
viện đa khoa Tâm Anh từ 2019-2021
2- Khảo sát sự ảnh hƣởng của một số yếu tố liên quan đến chất
lƣợng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn
4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TẾ BÀO GỐC
1.1.1. Khái niệm
Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa thành các dịng tế bào
chun biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm xác định một tế bào gốc là khả năng tự
làm mới (Self-renewal) và khả năng biệt hóa (Differentiation) thành tế bào
trƣởng thành chuyên biệt về chức năng. Khả năng tự làm mới là khả năng tế
bào gốc có thể phân chia khơng giới hạn để tạo thành tế bào con giống hệt tế
bào mẹ mang tính gốc. Đặc điểm này giống với tế bào ung thƣ, tuy nhiên
khác với tế bào ung thƣ phân chia không kiểm soát, tế bào gốc đƣợc cơ thể
điều khiển một cách chính xác và chặt chẽ [4].
1.1.2. Phân loại
Phân loại theo giai đoạn phát triển
Theo giai đoạn phát triển của cơ thể, tế bào gốc chia thành: tế bào gốc
phôi, tế bào gốc trƣởng thành. Tuy nhiên các thuật ngữ này hiện nay trở nên
không đầy đủ để mô tả các loại tế bào gốc. Năm 2006, nghiên cứu của giáo sƣ
Takahashi cho biết có thể tái lập trình tế bào trƣởng thành về trạng thái giống
tế bào gốc phôi, gọi là tế bào gốc đa năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem
Cell - iPSC) [5]. Ngƣợc lại, tế bào gốc trƣởng thành cũng đã đƣợc tìm thấy
trong thai nhi, nhau thai, máu dây rốn và trẻ sơ sinh [6, 7].
Phân loại theo tiềm năng biệt hóa
Dựa theo khả năng biệt hóa thành các dịng tế bào chun biệt trong cơ
thể, tế bào gốc đƣợc chia thành:
- Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells): là tế bào gốc có khả
năng phân chia và biệt hóa thành tồn bộ các dịng tế bào trong cơ
thể, có thể hình thành nên cấu trúc phơi và ngồi phơi. Ví dụ nhƣ
hợp tử - tế bào hình thành sau khi trứng đƣợc thụ tinh. Hợp tử sau
đó có thể phát triển thành thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm
và nhau thai.
5
- Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent stem cells): là tế bào gốc có thể
biệt hóa thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm ngoại trừ cấu trúc
ngoài phơi nhƣ nhau thai. Ví dụ nhƣ tế bào gốc phôi, iPSC.
- Tế bào gốc đa năng (Multipotent stem cells): là tế bào gốc có khả
năng biệt hóa thành các loại tế bào chuyên biệt trong một dòng tế
bào cụ thể. Ví dụ nhƣ tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hóa ra
các tế bào thuộc dịng máu; tế bào gốc thần kinh; tế bào gốc trung
mô.
- Tế bào gốc đơn năng (Unipotent stem cells): là tế bào gốc có phổ
biệt hóa hẹp nhất và đặc trƣng bởi tính chất phân chia lặp đi lặp lại.
Tế bào gốc đơn năng chỉ có thể biệt hóa thành một loại tế bào duy
nhất, ví dụ nhƣ tế bào da (Dermatocytes) [8], tế bào tiền thân đại
thực bào [9].
1.2. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU
1.2.1. Khái niệm
Tế bào gốc tạo máu (Haematopoietic Stem Cells – HSCs) là tế bào gốc
đa năng đặc biệt có khả năng tự đổi mới và biệt hóa tạo thành toàn bộ hệ
thống tạo máu trong cơ thể. Tế bào gốc tạo máu có thể bổ sung thay thế tất cả
các loại tế bào máu. Mỗi tế bào gốc tạo máu đƣợc lập trình để sản xuất các
thành phần của máu với các chức năng khác nhau từ hồng cầu vận chuyển
oxy, tiểu cầu liên quan đến các yếu tố đông máu, đến các tế bào của hệ thống
miễn dịch bẩm sinh hoạt động chống lại sự tấn công của vi khuẩn [10]. Đồng
thời, một số lƣợng nhỏ tế bào gốc tạo máu có vai trị tự tăng sinh vẫn giữ tính
gốc nhằm duy trì số lƣợng tế bào gốc trong cơ thể, luôn sẵn sàng khi cơ thể có
nhu cầu.
Giống nhƣ các tế bào gốc trƣởng thành trong cơ thể, hầu hết tế bào gốc
tạo máu đều tồn tại ở trạng thái không hoạt động. Khi cơ thể xảy ra tổn
thƣơng, các tế bào gốc tạo máu sẽ thoát khỏi sự im lặng và bắt đầu đi vào chu
kỳ tế bào, phân chia, biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa chức năng. Chúng
cũng có thể di chuyển từ tủy xƣơng ra máu ngoại vi, từ tủy xƣơng này sang
6
tủy xƣơng khác,…Điều này cho phép các tế bào gốc tạo máu có thể đƣợc thu
hoạch trực tiếp từ máu ngoại vi. Bất kỳ rối loạn nào xảy ra trong q trình
chuyển đổi này có thể dẫn đến cạn kiệt tế bào gốc máu, gây thiếu máu và các
bệnh lý về máu, miễn dịch khác.
1.2.2. Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu
HSC bắt đầu đƣợc xác định trong phôi bằng sự xuất hiện đầu tiên đƣợc
nhận thấy ở vùng AGM (Aorto-Gonado-Mesonephros) [11], là vùng thuộc
trung bì phơi phát triển trong suốt q trình phát triển phôi, gần với hệ thống
niệu sinh dục, tạo ra tuyến sinh dục, võ não của tuyến thƣợng thận và hậu
thận [12]. Sau đó, HSC chuyển sang gan của thai nhi, tại đây, HSC đƣợc
nhân lên rồi di chuyển đến lá lách và sau đó đến tủy xƣơng, nơi tế bào gốc tạo
máu sẽ cƣ trú trong suốt đời sống sau này [13, 14].
Bên cạnh đó, năm 2005, hai nhóm nghiên cứu độc lập đã xác định nhau
thai là một vị trí ngoại phơi có sự phát triển và nhân lên của tế bào gốc tạo
máu [15, 16]. Các nghiên cứu này cho thấy sự xuất hiện của các tế bào gốc
tạo máu với hoạt động tái tạo trong nhau thai xảy ra song song với quá trình ở
vùng AGM. Nhƣng liệu nhau thai có khả năng tạo ra HSC de novo hay chỉ hỗ
trợ nhân lên vẫn còn tranh cãi và cần nghiên cứu thêm [17].
1.2.3. Q trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu
Để xác định mối quan hệ giữa HSC và các thế hệ con cháu của chúng,
hệ thống phân cấp tạo máu đƣợc xây dựng để mô tả q trình biệt hóa từ HSC
sang các loại tế bào máu khác nhau. Sự biệt hóa của HSC xảy ra thơng qua
một q trình nhiều bƣớc từ đa dịng (multilineage), đến các tế bào chỉ có khả
năng biệt hóa hạn chế cho một số dòng (oligo-lineage), rồi đến các tế bào đơn
dòng (single lineage) và cuối cùng là tế bào máu trƣởng thành [18].
Trƣớc đây, HSC tinh sạch đƣợc coi là quần thể tế bào đồng nhất vì các
tế bào này chia sẻ các dấu hiệu bề mặt tế bào giống nhau. Về mặt chức năng,
mỗi tế bào trong quần thể đồng nhất này cũng đƣợc coi là có khả năng biệt
hóa giống hệt nhau [19]. Tuy nhiên hiện nay, nhiều cơng cụ phân tích –omics
ở độ phân giải đơn bào đã cho thấy những hiểu biết mới về tế bào gốc tạo
7
máu, từ đó tiết lộ về sự khơng đồng nhất trong quần thể HSC [20, 21]. Tính
khơng đồng nhất của HSC đƣợc phản ánh trong thực tế rằng mỗi HSC riêng
biệt khác nhau về đặc điểm phân tử, số phận tế bào và kết quả chức năng.
Việc phát hiện ra tính khơng đồng nhất của HSC đã định hình lại sự hiểu biết
của các nhà khoa học về quá trình biệt hóa phức tạp của loại tế bào gốc đặc
biệt này.
Các nghiên cứu trƣớc đây về q trình biệt hóa của HSC (Hình 1.1A)
đã phát hiện ra rằng HSC có thể đƣợc phân loại thành 2 dƣới quần thể: HSC
dài hạn (Long-term HSC – LT-HSC) và HSC ngắn hạn (Short-term HSC –
ST-HSC). LT-HSC là quần thể tế bào hiếm của tủy xƣơng, sở hữu khả năng
phục hồi vĩnh viễn ở những ngƣời nhận bị chiếu xạ. Ở trạng thái ổn định, LTHSC không hoạt động. Tuy nhiên, một khi tiếp xúc với kích thích, các tế bào
này sẽ kích hoạt trở lại và đi vào chu kỳ tế bào. ST-HSC thì có khả năng phục
hồi ngắn hạn, khoảng 8-12 tuần sau ghép. ST-HSC biệt hóa thành tế bào tiền
thân đa năng (Multipotent progenitors – MPP), so với HSC, ST-HSC có tần
suất tiến triển chu kỳ tế bào cao hơn, hoạt động biệt hóa mạnh mẽ hơn, nhƣng
khơng có khả năng tự đổi mới [22]. Tiếp sau MPP là các tế bào tiền thân
lympho phổ biến (Common lymphoid progenitors – CLP) có khả năng biệt
hóa thành các tế bào bao gồm: tế bào giết tự nhiên (Natural killer – NK) là
những tế bào gây độc tế bào cần thiết cho hệ miễn dịch bẩm sinh; tế bào B
trƣởng thành trong tủy xƣơng kích hoạt hình thành tế bào plasma tiết ra kháng
thể; và tế bào T trƣởng thành trong tuyến ức thành tế bào T gây độc tế bào
CD8+ hoặc tế bào T trợ giúp CD4+ với khả năng biệt hóa sâu hơn khi kích
hoạt. Cùng với tế bào tiền thân lympho phổ biến cịn có tế bào tiền thân dịng
tủy phổ biến (Common myeloid progenitors – CMP) có thể biệt hóa thành các
tế bào tiền thân megakaryocyte/hồng cầu (Megakaryocyte/erythrocyte
progenitors – MEP) – biệt hóa sản xuất tiểu cầu, hồng cầu; và tế bào tiền thân
bạch cầu hạt/đại thực bào (Granulocyte/macrophage progenitors – GMP) –
biệt hóa cho bạch cầu hạt và đại thực bào. Bạch cầu hạt bao gồm: bạch cầu
trung tính (neutrophil) là loại bạch cầu chiếm tỷ lệ lớn nhất (50-60%); bạch
cầu ái toan (eosinophil)) có đặc tính gây độc tế bào đặc biệt chống lại ký sinh
8
trùng (1-3% bạch cầu); bạch cầu ái kiềm (basophil) có vai trò trong phản ứng
viêm và là loại bạch cầu ít phổ biến nhất (<2%); và các tế bào mast hoạt động
theo cách tƣơng tự nhƣ bạch cầu ái kiềm đóng vai trị quan trọng trong sự
phát triển của dị ứng.
Mặc dù sơ đồ phân cấp HSC cổ điển có thể mơ tả đƣợc phần lớn q
trình biệt hóa từng bƣớc của HSC, nhƣng sự phức tạp trong biệt hóa các dòng
tế bào cùng với việc xác định các loại quần thể tế bào tạo máu mới vẫn chƣa
đƣợc làm rõ. Vì vậy, sơ đồ biệt hóa HSC đƣợc sửa đổi một số điểm nhằm
cung cấp đầy đủ và chính xác thơng tin hơn (Hình 1.1B). Theo đó, ngồi LTHSC và ST-HSC, cịn có HSC trung hạn (Intermediate-term HSCs – IT-HSC)
đƣợc xác định bởi khả năng tự đổi mới nằm giới hạn giữa ST-HSC và LTHSC. Trong sơ đồ mới, IT-HSC nằm giữa LT-HSC và ST-HSC, hoạt động
nhƣ một quần thể tế bào tạm thời. Ngoài ra, quần thể MPP đƣợc chia thành 4
nhóm MPP1, MPP2, MPP3 và MPP4. Trong số các quần thể con này, kiểu
hình miễn dịch, trạng thái chu kỳ tế bào và khả năng biệt hóa của chúng đều
khác nhau. Trong hệ thống biệt hóa HSC đã sửa đổi, MPP1 giống với STHSC, trong khi MPP2-4 là các quần thể phụ tƣơng đƣơng, hoạt động cùng
nhau để duy trì việc sản xuất máu ở trạng thái ổn định [23]. Ngoài ra, một
dƣới quần thể của HSC có biểu hiện gene tạo máu cao đƣợc định nghĩa là tế
bào tiền thân lymphoid-primed đa năng (Lymphoid-primed multipotent
progenitors – LMPP). Về mặt chức năng, quần thể này ƣu tiên tạo ra các dịng
bạch huyết. Về mặt kiểu hình miễn dịch, LMPP có các dấu hiệu bề mặt tƣơng
tự với MPP4.
9
Hình 1.1. Sơ đồ q trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) [19]
Nhƣ vậy, từ việc cho rằng sự biệt hóa HSC trải qua một số bƣớc trung
gian rời rạc để tạo ra các tế bào máu trƣởng thành, các quần thể tế bào trung
gian đƣợc xác định bằng các dấu hiệu bề mặt đƣợc phân biệt bằng các ranh
giới thứ bậc rõ ràng, giờ đây, các nghiên cứu mở rộng sử dụng các xét nghiệm
chức năng và phân tích omics đã cho thấy q trình biệt hóa từ một HSC đến
các tế bào máu trƣởng thành chun hóa chức năng là một q trình liên tục,
khơng có ranh giới rõ ràng giữa các quần thể tế bào nằm ở các cấp độ khác
nhau [24] (Hình 1.2).
Hình 1.2. Q trình biệt hóa HSC. (A) mơ hình biệt hóa rời rạc, (B) mơ hình
biệt hóa liên tục [19]
10
1.2.4. Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu
Tế bào gốc tạo máu hiện nay có thể đƣợc phân lập từ các nguồn sau:
Tủy xương
Ở ngƣời trƣởng thành, quá trình tạo máu xảy ra trong tủy xƣơng, đây là
một mô mềm xốp, nhiều mạch máu nằm bên trong xƣơng. Có hai loại tủy
xƣơng: tủy đỏ (Medulla ossium rubra) – nơi các tế bào tạo máu cƣ trú, và tủy
vàng (Medulla ossium flava) – bao gồm chủ yếu là các tế bào mỡ. Lúc mới
sinh, tất cả tủy xƣơng đều có tủy đỏ, tỷ lệ tủy vàng tăng dần theo tuổi tác và tỷ
lệ giữa hai loại này khoảng 50:50 ở ngƣời trƣởng thành. Tuy nhiên, ở những
thời điểm mất máu nặng, tủy vàng có thể chuyển ngƣợc trở lại tủy đỏ nhằm
tăng sản xuất tế bào máu thông qua quá trình tạo máu. Nguồn phân lập cổ
điển cho tế bào gốc tạo máu là tủy xƣơng. Trong hơn 40 năm, các bác sĩ thực
hiện ghép tế bào gốc tạo máu cho bệnh nhân bằng cách chọc hút tủy xƣơng
trong mào chậu của khung chậu bằng syringe chuyên dụng. Tế bào trong tủy
xƣơng gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc mô đệm, tế bào tiền thân tạo máu,
bạch cầu và hồng cầu trƣởng thành [25]. CD34 đƣợc biểu biện trong 1-4% các
tế bào có nhân phân lập từ nguồn này [26].
Máu ngoại vi
Khi đáp ứng lại một số tín hiệu cụ thể, tế bào gốc tạo máu có thể di
chuyển từ tủy xƣơng ra máu ngoại vi (huy động) và trở lại tủy xƣơng
(homing). CD34 đƣợc biểu hiện trong khoảng 0.06% tế bào có nhân đƣợc tìm
thấy trong máu ngoại vi [26]. Huy động tế bào gốc tạo máu từ tủy xƣơng ra
máu ngoại vi đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng cytokine yếu tố kích
thích tế bào hạt (Granulocyte colony stimulating factor – G-CSF) trong ba
hoặc bốn ngày. Điều này làm tăng tỷ lệ CD34+ lên > 1%, các tế bào này sau
đó có thể đƣợc thu hoạch bằng phƣơng pháp Leukapheresis. Máu ngoại vi trở
thành nguồn tế bào gốc tạo máu bắt đầu từ những năm 2000 [27].
Máu dây rốn
Thành phần tế bào trong máu dây rốn bao gồm: Tế bào gốc/tiền thân
tạo máu, tế bào tiền thân nội mô, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, tế bào
11
gốc/tiền thân trung mô [28]. Kể từ khi ca ghép tế bào gốc tạo máu từ máu dây
rốn đầu tiên thành công ở một bệnh nhi mắc bệnh thiếu máu Fanconi, việc thu
thập và sử dụng nguồn tế bào này đã phát triển nhanh chóng [29]. Máu dây
rốn sẽ đƣợc thu thập ngay sau khi đứa trẻ đƣợc sinh ra, sau đó xử lý nhằm
phân lập quần thể tế bào gốc tạo máu. Tế bào thu đƣợc sau xử lý có thể đƣợc
sử dụng ngay cho việc ghép hoặc lƣu trữ ở -196oC trong nitơ lỏng trong nhiều
năm.
1.3. TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN
1.2.1. Cấu tạo dây rốn
Dây rốn nối liền giữa mẹ và thai nhi qua bánh nhau, có vai trị quan
trọng trong việc ni dƣỡng thai nhi trong suốt thai kỳ. Dây rốn có cấu tạo
bao gồm hai động mạch và một tĩnh mạch, đƣợc bao xung quanh bởi mô liên
kết gọi là Wharton’s jelly, bao bên ngồi là màng dây rốn (Hình 1.3). Máu
dây rốn phần lớn chứa trong tĩnh mạch. Trong quá trình sinh nở, dây rốn đƣợc
cắt rời khỏi trẻ sơ sinh, tĩnh mạch dây rốn có thể quan sát dễ dàng, do vậy
việc thu thập máu dây rốn thông qua tĩnh mạch đƣợc thực hiện khá đơn giản.
Hình 1.3. Cấu tạo dây rốn ở ngƣời [30]
12
Để đảm bảo lấy đƣợc lƣợng máu tốt nhất, thời điểm thu thập máu dây
rốn thƣờng là giai đoạn sau khi đẻ thai và trƣớc khi xổ nhau (trẻ đã ra ngồi
nhƣng bánh nhau cịn nằm trong tử cung ngƣời mẹ). Trong một số tình huống
sản khoa đặc biệt khơng thể thu thập ở giai đoạn trên, có thể thu thập máu dây
rốn sau khi xổ nhau. Bánh nhau và dây rốn khi đó sẽ đƣợc xử lý ở khu vực
riêng biệt để lấy đƣợc hết lƣợng máu còn lại trong các mạch máu. Tuy nhiên,
khi thu thập sau xổ nhau thì thể tích và số lƣợng tế bào máu thƣờng thấp hơn
thu thập trƣớc xổ nhau. Vì vậy đa số các trƣờng hợp nên thu thập trƣớc xổ
nhau để đƣợc hiệu quả tốt nhất.
1.2.2. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn
Đặc điểm biệt hóa
Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có đặc điểm biệt hóa giống với tế
bào tạo máu nguồn gốc từ tủy xƣơng. Một tế bào gốc tạo máu trong suốt vòng
đời phân chia bất đối xứng thành hai tế bào con: một tế bào gốc tạo máu và
một tế bào tiền thân tạo máu (Hematopoietic progenitor cell - HPC). HPC là
tế bào tiền thân sớm nhất, không giống HSC, chúng khơng có khả năng tự làm
mới, khả năng biệt hóa bị giới hạn ở một hoặc một vài dịng. Từ HPC sẽ biệt
hóa tạo thành tế bào tiền thân dịng tủy, rồi hình thành bạch cầu hạt, hồng cầu,
đại thực bào và megakaryocytes; hoặc tế bào tiền thân dòng lympho rồi hình
thành tế bào B, tế bào T, tế bào NK.
Đặc điểm miễn dịch
Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation – CD) là một loạt các phân tử
protein đƣợc sử dụng làm dấu hiệu (marker) xác định các quần thể tế bào cụ
thể. Các phân tử CD thƣờng có chức năng và có thể là thụ thể hoặc phối tử
hoặc tham gia vào q trình kết dính và di chuyển tế bào [26]. Khơng có phân
tử chỉ thị duy nhất để xác định tất cả các HSC. Điều này rất khó khăn vì các
phân tử chỉ thị có thể đƣợc tăng cƣờng biểu hiện hoặc mất đi khi tế bào biệt
hóa. Phân tử CD34 là marker đầu tiên đƣợc xác định trên HSC và hiện là
marker đƣợc sử dụng phổ biến nhất. CD34 đƣợc cho là đóng vai trị nhƣ một
phân tử kết dính thơng qua việc gắn các HSC và chất nền ngoại bào tủy
13
xƣơng hoặc với các tế bào mô đệm. Quần thể CD34+ bao gồm phần lớn các tế
bào có khả năng tái tạo hệ thống tạo máu, tất cả các tế bào tạo máu dài hạn và
nhiều đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit - CFU). Quần thể
CD34+ này chứa hỗn hợp HSC và HPC có thể phân biệt bằng các mức độ biểu
hiện khác nhau của các marker khác. Kiểu hình miễn dịch của tế bào gốc/tiền
thân tạo máu có thể đƣợc xác định bằng cách sử dụng:
- Phân tích tế bào học về sự hiện diện của proteoglycan CD34/CD38
- Phân tích chỉ thị của dịng trƣởng thành (HLA-DR)
- Phân tích thụ thể tyrosine kinase c-kit
Tuy nhiên, có bằng chứng về các tế bào CD34- (không biểu hiện CD34)
ngun thủy nhƣng có đặc tính HSC có thể tạo ra tế bào CD34+ in vitro và in
vivo [31, 32]. Các tế bào CD34- này có thể đƣợc đặc trƣng thông qua sự biểu
hiện của CD133 và không biểu hiện CD38 và các marker đặc trƣng cho dòng.
Biểu hiện của CD133 trên HSC chồng lên sự biểu hiện của CD34. CD133
biểu hiện trên phần lớn các tế bào CD34+ bao gồm các các tế bào HSC CD34-.
HSC và HPC không biểu hiện các marker liên quan đến các tế bào máu đã
biệt hóa. Những marker này có thể bao gồm: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8,
CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a.
1.2.3. So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xƣơng và máu ngoại vi
Các tế bào gốc máu dây rốn khác với tế bào gốc máu từ máu ngoại vi
và tủy xƣơng về cả thành phần, số lƣợng và đặc tính [33-35]. Các tế bào trong
máu dây rốn (có kiểu hình CD34+/CD38-) đƣợc phát hiện ở pha G0 tăng sinh
tốt hơn khi đáp ứng với cytokine và ít phụ thuộc vào các tế bào đệm hơn so
với các tế bào tƣơng ứng trong máu ngoại vi và tủy xƣơng [36, 37].
Tỷ lệ tế bào biểu hiện CD34+ trong tổng số tế bào có nhân ở máu dây
rốn khoảng 0.02-1.43% thấp hơn tủy xƣơng (0.5-5%) và cao hơn so với máu
ngoại vi (<0.01%) (Bảng 1.1).
