CHẨN đoán PHÂN tử và LIỆU PHÁP GEN

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
& LIỆU PHÁP GEN


MỤC LỤC
Chương 1: Một số khái niệm cơ bản trong chẩn đốn.......................................5
1.1. Chẩn đoán.......................................................................................................5
1.2. Sàng lọc...........................................................................................................6
1.3. Đơ ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u...................................................................................6
1.4. Các vấn đề cơ bản trong chẩn đoán................................................................8
1.4.1. Nhận diện mẫu.........................................................................................8
1.4.2 Lập luận xác suất.......................................................................................9
1.4.3. Ý kiến nguyên nhân.................................................................................9
Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đốn bệnh.....................................................10
2.1. Ni cấy mẫu bệnh phẩm..............................................................................10
2.2. Kỹ thuật tế bào học.......................................................................................11
2.2.1. Nhuộm in vitro.......................................................................................11
2.2.2. Nhuộm in vivo........................................................................................19
2.3. Phương pháp miễn dịch học..........................................................................20
2.3.1. Western blot...........................................................................................20
2.3.2. Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry).........................................24
2.3.3. Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA)....................................26
2.3.4. Xét nghiệm ngưng kết (Agglutination test)............................................31
2.3.5. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)....................................34


2.4. Phương pháp FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)...............................39
2.4.1. Các kiểu mẫu dò trong FISH.................................................................42
2.4.2. Hai kiểu tế bào sử dụng FISH................................................................43
2.5. Phương pháp FLOW CYTOMETRY...........................................................47
2.5.1. Khái niệm...............................................................................................47

2.5.2. Lịch sử....................................................................................................47
2.5.3. Nguyên tắc hoạt động............................................................................48
2.5.4. Phân tích kết quả....................................................................................55
2.6. Phương pháp khuếch đại nucleic acid...........................................................60
2.6.1. Chuẩn bị mẫu.........................................................................................61
2.6.2. Khuếch đại.............................................................................................64
2.6.3. Phát hiện và phân tích............................................................................72
2.6.4. Giải trình tự nucleic acid........................................................................85
2.6.5. Sử dụng chip trong phân tích.................................................................89
Chương 3: Ứng dụng các kỹ thuật chẩn đốn..................................................90
3.1. Chẩn đốn bệnh nhiễm..................................................................................90
3.1.1. Quan sát thơng qua kính hiển vi............................................................90
3.1.2. Ni cấy và xác định..............................................................................91
3.1.3. Tìm kiếm bằng chứng qua sự đáp ứng của cơ thể.................................92
3.1.4. Phương pháp miễn dịch.........................................................................93
3.1.5. Phương pháp sử dụng nucleic acid........................................................94


3.2. Chẩn đoán ung thư........................................................................................95
3.2.1. Sàng lọc và phát hiện sớm.....................................................................95
3.2.2. Chẩn đốn thơng thường........................................................................98
3.2.3. Chẩn đốn phân tử...............................................................................101
3.3. Chẩn đoán bệnh di truyền...........................................................................105
3.3.1. Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)105
3.3.2. Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal diagnosis).............................................109
Chương 4: Một số khái niệm cơ bản trong liệu pháp gen..............................118
4.1. Giới thiếu....................................................................................................118
4.2. Tế bào mục tiêu...........................................................................................120
4.2.1. Tế bào sinh dưỡng................................................................................120
4.2.2. Tế bào sinh dục....................................................................................121

Chương 5: Liệu pháp gen.................................................................................123
5.1. Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen...............................................................123
5.2. Chiến lược liệu pháp gen............................................................................127
5.2.1. Liệu pháp in vivo..................................................................................127
5.2.2. Liệu pháp ex vivo.................................................................................128
5.3. Vector có bản chất virus dùng trong liệu pháp gen.....................................130
5.3.1. Vector có bản chất virus.......................................................................131
5.3.2. Vector retrovirus (Rv).........................................................................132
5.3.3. Vector adenovirus (Ad)........................................................................147


5.3.4. Hệ thống vector virus kết hợp với Adeno............................................158
5.3.5. Hệ thống vector virus simplex herpes..................................................163
5.3.6. Những vector virus khác......................................................................168
5.4. Vector không phải virus dùng trong liệu pháp gen.....................................168
5.4.1. DNA và RNA được khuếch đại trong vi khuẩn và tế bào eukaryote...168
5.4.2. Oligonucleotide....................................................................................174
5.4.3. Ribozyme.............................................................................................198
5.4.4 Triplex DNA.........................................................................................214
5.4.5. SMaRT.................................................................................................216
Chương 6: Sự tồn tạo gen liệu pháp trong tế bào và nhóm gen mục tiêu.....218
6.1. Sự tồn tại gen liệu pháp trong tế bào..........................................................218
6.2. Nhắm gen mục tiêu.....................................................................................219
6.3. Ứng dụng.....................................................................................................220
6.3.1. Chữa bệnh di truyền.............................................................................220
6.3.2. Chữa bệnh ung thư...............................................................................243
6.3.3. Chữa bệnh nhiễm, bệnh mắc phải........................................................248
6.3.4. Liệu pháp gen ứng dụng trong cấy ghép..............................................250
6.3.5. Liệu pháp gen và việc “thiết kế con người”.........................................251

Chương 1: Một số khái niệm cơ bản trong chẩn đoán
1.1. Chẩn đoán
Trong y học, chẩn đoán (diagnosis) là quá trình xác định điều kiện y học
hay bệnh từ các dấu hiệu (sign) hay triệu chứng (symptom) và từ các kết quả
cộng gộp của nhiều q trình chẩn đốn khác, kể cả hoàn cảnh. Các kết luận của
thể được tổng hợp từ q trình này được gọi là chẩn đốn. Thuật ngữ
“diagnosis” có nguồn gốc từ chữ “dia” nghĩa là “bởi” (by) và từ chữ “gnosis” có
nghĩa là biết (knowledge).
Cách đây hơn 2000 năm, Hippocrate đã ghi nhận sự liên hệ giữa bệnh và di
truyền. Tương tự, Pythagorat đã ghi chú sự liên hệ giữa chuyển hóa và di truyền.
Tuy nhiên, chỉ gần đây cộng đồng y học mới thừa nhận vai trị quan trọng của di
truyền học và nó đã trở thành một bộ phận tất yếu của y học ngày nay.
Những năm đầu thập niên 1990. Willian Osler đã đưa ra những sáng kiến về
thực hành y học. Theo Osler, chức năng của bác sĩ là xác định bệnh và các biểu
hiện của nó, hiểu được các cơ chế của nó, làm thế nào để ngăn chặn và chữa trị.
Ý tưởng của Osler vẫn được tiếp tục đến ngày nay, vấn đề cơ bản của chiến lược
này là “bệnh mà bệnh nhân mắc là gì và cách tốt nhất chữa trị cho bênh đó là
như thế nào?”.
Người nối nghiệp William Osler là Archibald Garrod. Trong khi Osler đề ra
các nguyên lý nền tảng mà y học nên tiến hành, thì Garrod đặt những nguyên lý
này trong ngữ cảnh lớn hơn. Chẳng hạn bệnh lí gắn chặt với các tính chất đặc
trưng của từng cá nhân về hóa học được di truyền và tùy thuộc vào các cơ thể
của sự chọn lọc tiến hóa. Ý tưởng của Osler về thực hành y khoa đã thống trị
sinh lý y học ngày nay. Bệnh nhân là tập hợp các triệu chứng, được xác định và

5


phân tích thuật tốn để đưa ra một chẩn đốn, đồng thời đưa ra một chiến lược

chữa trị hiệu nghiệm nhất.
Khái niệm của Garrod về tính chất sinh lý của cá thể được khẳng định khi
bộ gen người được giải mã thành công. Những mối quan hệ tinh vi giữa di
truyền, tính chất sinh học cá thể và mơi trường trở nên rõ ràng, thông qua các
biến đổi được phát hiện trong DNA. DNA của mỗi bệnh nhân cho biết cơ chế họ
sẽ có những thay đổi, hay lâm bệnh như thế nào. Người ta hi vọng rằng từ các
hiểu biết về gen, sự ốm đau, bệnh tật có thể được phát hiện, các q trình bệnh
có thể được dự đốn, trước khi chúng có cơ hội biểu hiện. Mặc dù kiến thức
trong lĩnh vực này còn lâu nữa mới hồn thiện, nhưng cũng đã có nhiều can thiệp
y học được phát triển dựa vào vấn đề này.
1.2. Sàng lọc
Ngoài khái niệm chẩn đốn người ta cịn sử dụng khái niệm “sàng lọc” để
chỉ các quá trình tìm kiếm bệnh. Sàng lọc (screen) bệnh là một thuật ngữ khác có
thể cùng mục đích, cùng phương pháp như chẩn đốn, nhưng phase tiến hành
khác biệt. Thơng thường, chẩn đốn bệnh được đề cập khi cá thể có những biểu
hiện bệnh hay triệu chứng bộc phát, trong khi đó sàng lọc bệnh dùng để phát
hiện bệnh chưa có những biểu hiện lâm sàng.
1.3. Đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiêụ
Thuâ ̣t ngữ “có thể” và “chắc chắn” đã cơ bản phản ánh đô ̣ nhạy (sensitivity)
và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u (specificity) của các xét nghiê ̣m. Đô ̣ nhạy được định nghĩa là phần
trăm các cá thể có bê ̣nh mà xét nghiê ̣m có thể xác định đúng, trong khi đó đô ̣ đă ̣c
hiê ̣u được định nghĩa như là phần trăm cá thể không bê ̣nh, được xác định chắc
chắn. Người ta sử dụng các phương pháp đô ̣c lâ ̣p đưa ra quyết định cuối cùng về

6


người nào bê ̣nh và người nào không bê ̣nh để tính toán các giá trị này.
Mô ̣t xét nghiê ̣m lí tưởng phải có đơ ̣ nhạy 100% và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u 100%,
nhưng trên thực tế, đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thường có mối quan hê ̣ ngược. Mô ̣t

xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy cao sẽ xác định hầu hết các cá thể bị bê ̣nh, nên thường có
phần trăm cao hơn các trường hợp dương tính giả, do đó có đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thấp.
Mô ̣t nhân tố quan trọng khác có ảnh hưởng đến kết quả xét nghiê ̣m là tỉ lê ̣ bê ̣nh
trong quần thể sàng lọc. Nếu bê ̣nh hiếm, ngay khi xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy và đô ̣
dă ̣c hiê ̣u cao cũng sẽ có mô ̣t tỉ lê ̣ dương tính giả cao, bởi vì nhiều cá thể không bị
bê ̣nh cùng được xét nghiê ̣m.
Bảng 1.1. Mô ̣t số thuâ ̣t ngữ
Thuật ngữ

Định nghĩa

Độ nhạy

Tỷ lệ cá thể bệnh được xác định

(sensitivity)

đúng bởi xét nghiệm.

Độ đặc hiệu

Tỷ lệ cá thể không bệnh được

(specificity)

xác định đúng bởi xét nghiệm.

Phần trăm âm tính giả
(Percentfalse negative)

Tính tốn

100xTP/(TP+FN)

100xTN/(TN+FP)

Phần trăm cá thể có bệnh mà
khơng được phát hiện bởi xét

100xFN/(TP+FN)

nghiệm.

Phần trăm dương tính

Phần trăm cá thể khơng bệnh, mà

giả (Percent false

được kiểm tra là có bệnh bởi xét

positive)

nghiệm.

100xFP/(TN+FP)

7

Giá trị dự đốn dương

Khả năng có thể đúng của các cá

tính (Positive predictive thể được kiểm tra là dương tính
value)

thì có bệnh.

Giá trị dự đốn âm tính

Khả năng có thể đúng của các cá

(Negative predictive

thể được kiểm tra là âm tính thì

value)

khơng có bệnh

TP/(TP+FP)

TN/(TN+FN)

Chú thích: Dương tính đúng (true positive – TP), dương tính giả (false
negative – FN), âm tính giả (false positive – FP), âm tính đúng (true negative –
TN)
1.4. Các vấn đề cơ bản trong chẩn đoán
Ba vấn đề chính khơng tách biệt nhau khi thực hiện một chẩn đoán đơn là:

sự nhận diện mẫu (pattern regconition), lập luận xác suất (probility reasoning)
và suy nghĩ nguyên nhân (causal thinking).
1.4.1. Nhận diện mẫu
Sự nhận diện mẫu là việc xác định và so sánh các biểu hiện của cá thể bệnh
với các biểu hiện của cá thể bệnh với cái biểu hiện của một bệnh đã biết. Những
dấu hiệu, triệu chứng được so sánh với những mẫu bệnh đã được xếp loại và
đánh dấu trước đây.
Các phương pháp CNSH sử dụng để phát hiện sớm, nhanh và chính xác các
biểu hiện của bệnh (chẩn đốn), hoặc tìm kiếm các tác nhân gây bệnh (sàng lọc)
ở mức độ phân tử (protein, nucleic acid), hay tế bào và mơ. Vì tính hữu dụng của

8


các phương pháp này trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh, cho nên chúng nhanh
chóng giữ vai trị quan trọng trong y học
1.4.2 Lập luận xác suất
Lập luận xác suất phản ánh khả năng tương đối một bê ̣nh đặc biệt mà cá thể
có thể mắc phải, khi có các biểu hiện đã được xác định. Khả năng cá thể mắc
bệnh đó cao khi mơ ̣t số chỉ tiêu chẩn đoán đã được gặp, các xét nghiệm hiếm cho
kết quả dương tính giả. Ngồi ra,sự nhận diện mẫu chính xác góp phần gia tăng
độ chính xác của việc lập luận xác suất.
1.4.3. Ý kiến ngun nhân
Sau chẩn đốn, cần tìm kiếm các nhân tố hay các quá trình đáp ứng có thể
gây nên bệnh. Bằng sự hiểu biết và lọai bỏ các nguyên nhân, bệnh có thể được
ngăn chặn.

9

Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đốn bệnh
2.1. Ni cấy mẫu bệnh phẩm
Kỹ thuật nuôi cấy được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Với kỹ
thuật này, vi sinh vật quan tâm hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đươc ni tăng
sinh, sau đó, sự hiện diện của chúng được phát triển thông qua nhiều biện pháp
khác nhau.
Mẫu sinh phẩm được đặt trong môi trường lỏng hay đặt trên bề mặt rắn.
Dung dịch lỏng dùng trong nuôi cấy được xem như là môi trường nuôi cấy lỏng
hay “canh”. Bề mặt sử dụng để phát triển vi sinh vật là môi trường nuôi cấy
ngắn. Hầu hết môi trường nuôi cấy rắn được chuẩn bị bằng cách them cơ chất
(thường là agar).
Trong một số trường hợp nuôi cấy virus hay vi khuẩn đặc biệt, sinh phẩm
phải được đặt trong những mẫu tế bào động vật sống (nuôi cấy mô), bởi hầu hết
virus gây bệnh ở người và động vật chỉ sống trong các tế bào động vật. Để nuôi
được mầm bệnh, trước hết, người ta phải nuôi các tế bào động vật (tế bào chủ).
Sau khi những tế bào chủ sống, phát triển bám lên bề mặt (thường là thủy tinh
hay nhựa), lúc đó đặt các mẫu sinh phẩm vào ni, các virus bệnh sẽ kí sinh vào
tế bào động vật.
Ngồi việc phải cung cấp các chất dinh dưỡng thích hợp, ni cấy vi sinh
vật cịn địi hỏi mơi trường có nhiệt độ thích hợp. Đối với hầu hết các vi sinh vật
quan tâm trong vi sinh lâm sang, nhiệt độ từ 35 - 37°C là thích hợp cho sự phát
triển tối ưu.
Với nhiều vi sinh vật, sự phát triển của chúng cịn địi hỏi điều kiện khơng
khí thích hợp, chẳng hạn nhiều vi khuẩn chỉ sống trong môi trường yếm khi, một
10


số chỉ sống được trong mơi trường hiếu khí, một số khác khơng phụ thuộc nhiều
ở khơng khí.
2.2. Kỹ thuật tế bào học

Nhuộm là một kỹ thuật sinh hóa, bổ sung thuốc nhuộm chuyên biệt cho một
loại phân tử nào đó vào một cơ chất để định tính hay định lượng sự hiện diện của
cơ chất đó. Các phân tử cơ chất có thể là DNA, protein, lipid hay carbohydrate.
Kết hợp với các quy trình cố định và chuẩn bị mẫu, các nhà khoa học và bác sĩ
đã sử dụng kỹ thuật nhuộm như là cơng cụ chẩn đốn ban đầu, nhưng rất cần
thiết.
Nhuộm và thuốc nhuộm thường được sử dụng trong nghiên cứu y sinh để
làm hiện rõ các cấu trúc quan tâm trong các mô và tế bào. Phương pháp nhuộm
thường được tiến hành cùng với sự hỗ trợ của kính hiển vi. Nhuộm cịn được sử
dụng để xác định và kiểm tra mô, quần thể tế bào hay các bào quan, đánh dấu
các tế bào mục tiêu trong kỹ thuật flow cytometry, cũng như protein hay các
nucleic acid trong điện di.
Các phương pháp nhuộm xếp thành hai nhóm: nhuộm in vitro và nhuộm in
vivo.
2.2.1. Nhuộm in vitro
Nhuộm in vitro là việc làm sao cho các cấu trúc hay các tế bào hiện màu khi
chúng khơng cịn sống. Nhuộm in vitro có nghĩa là nhuộm trong phịng thí
nghiệm, khác với nhuộm in vivo trực tiếp trên cơ thể sống.
Nhuộm tương phản (counterstain) là việc nhuộm bổ sung nhằm làm tế bào
hay cấu trúc sống không hiện màu khi đã nhuộm cơ bản. Chẳng hạn, crystal
violet chỉ nhuộm các vi khuẩn Gram dương trong nhuộm Gram. Nhuộm tương
11


phản Safranin được sử dụng nhuộm tất cả các tế bào, cho phép xác định những vi
khuẩn Gram âm.
Các bước chuẩn bị phụ thuộc vào kiểu phân tích được tiến hành, một số hay
tất cả các quy trình có thể cần thiết, gồm:
(1) Làm tế bào thấm (Permeabilization) (xử lí tế bào với chất hoạt tính bề
mặt nhẹ, làm phân hủy màng tế bào để thuốc nhuộm đi vào bên trong).

(2) Cố định tế bào (Fixation) duy trình hình dạng tế bào hay mơ liên quan
bằng cách dung các hóa chất (formaldehyde, ethanol, methanol hay picric
acid…) tạo ra các liên kết hóa học giữa phân tử protein và cơ chất khác trong
mẫu, làm tăng khả năng “cứng rắn”, hay cố định trong paraffin để tăng tính chịu
cơ học và tính ổn định mô, nhằm dễ dàng cắt chúng thành nhiều lát mỏng (slice).
(3) Gắn (Mounting) đính các mẫu vào lame để quan sát và phân tích dưới
kính hiển vi. Một số trường hợp tế bào có thể phát triển trực tiếp trên lame như
máu, tinh dịch… các mẫu có thể kéo thành vệt (smear) trên lame, sau đó cố định.
Với mẫu mô lớn, những lát mỏng được cắt bằng microtome (máy cắt lắt), và
được gắn lên lame.
Cách nhuộm đơn giản nhất là ngâm mẫu (sau khi hay trước khi cố định và
gắn) vào dung dịch thuốc nhuộm, sau đó rửa và quan sát. Nhiều thuốc nhuộm đòi
hỏi sử dụng chất cẩn màu (mordant) – một hợp chất phản ứng với thuốc nhuộm
để hình thành dạng khơng hịa tan, tủa hiện màu. Thuốc nhuộm được rửa bằng
cách nào đi nữa, màu vẫn còn.
Các kết quả nhuộm thường được nhận diện, đánh giá với sự hỗ trợ của kính
hiển vi. Có phương pháp nhuộm khơng cần kính, ví dụ nhuộm protein trong điện
di…

12


Kính hiển vi quang học được sử dụng để quan sát mẫu nhuộm với các thuốc
nhuộm hiện màu (staining dye). Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng để quan
sát các mẫu nhuộm với các thuốc nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye).
Kính hiển vi điện tử sử dụng để hiện rõ các cấu trúc nội bào, trường hợp này cần
sử dụng các hợp chất đậm đặc electron của kim loại nặng. Chẳng hạn,
phosphotungstic acid là thuốc nhuộm âm tính thường được sử dụng cho các
virus, các dây thần kinh, polysaccharide và các nguyên liệu mô sinh học khác.
Một số phương pháp nhuộm thông thường:

2.2.1.1. Nhuộm Gram
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram, một nhà khoa học người Đan
Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn mới được lấy tên ông.

Nguồn: />Hình 2.1. Các bước nhuộm Gram và hình ảnh minh học

13


Nhuộm Gram là kỹ thuật phân loại Gram các vi khuẩn dựa vào các hợp chất
vách tế bào. Hóa chất sử dụng là Crystal violet, iodine như là chất cẩn màu và
fuchsin (hay Safranin), được dùng để nhuộm tương phản, nhằm xác định tất cả vi
khuẩn. Vi khuẩn Gram quan trọng trong y học, sự hiện diện hay vắng mặt chúng
sẽ làm thay đổi tính nhạy cảm với một số kháng sinh. Các vi khuẩn dương tính
sẽ có màu xanh đen hay màu tím (violet).
Vi khuẩn Gram dương vách tế bào giàu Peptidoglycan và thiếu màu thứ
cấp. Trong khi đó, Gram âm vách tế bào có sự hiện diện của Lipopolysaccharide,
chúng có màu đỏ hay hồng, bởi sự tương phản màu trong quá trình nhuộm.

Nguồn: />Hình 2.2. Sơ đồ minh học thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm

14


Nguồn: />Hình 2.3. Hình ảnh sau khi nhuộm Gram
2.2.1.2. Nhuộm HE (Haematoxylin và Eosin)
Nhuộm HE được sử dụng nhiều trong kỹ thuật mô học để kiểm tra các lát
mỏng. Haematoxylin làm nhân tế bào có màu xanh. Trong khi đó, eosin sẽ
nhuộm nguyên sinh chất và các mô liên kết, làm cho chúng có màu hồng hay đỏ.
Eosin được hấp thụ mạnh bởi các tế bào hồng cầu và làm chúng có màu đỏ sáng.

Sau khi loại bỏ các thành phần tế bào, khn nền lúc này chỉ cịn là màng
lưới protein, khơng cịn nhân và các thành phần bào quan khác. Màng sợi này
gồm các sợi li ti đan xen vào nhau, các sợi bắt màu hồng nhạt. Sự đan xen của
các sợi đã để lại các khoảng trống nhỏ trên màng, là điều kiện tốt để kích thích tế
bào bám và tăng sinh trên khuôn nền

15


Nguồn: />Hình 2.4. Kết quả nhuộm HE
2.2.1.3. Nhuộm Papanicolaou (hay nhuộm Pap)
Nhuộm Papanicolaou là một kỹ thuật nhuộm mô multichromatic phát triển
bởi George Papanikolaou, cha đẻ của ngành mô bệnh học.
Phương pháp nhuộm này thường dùng được để kiểm tra mẫu tế bào từ các
dịch tiết khác nhau. Loại mẫu sinh thiết dịch thể này thường được nhuộm với các
Pap smear và sử dụng kết hợp với haematoxylin, Orange G, hay Lifght Green SF
yellowish và thỉnh thoảng là Bismarck Brown Y.
Nhuộm Pap được sử dụng để phân biệt các tế bào trong các chế phẩm của
dịch tiết cơ thể (các mẫu vật có thể được làm Pap smears: dịch phụ khoa, đờm,
nước tiểu, dịch não tủy, dịch ổ bụng, chất dịch màng phổi, chất dịch synovial,
mẫu dịch liên quan khối u).
16


Khi thực hiện đúng cách, các mẫu vật nhuộm màu nên hiển thị màu sắc từ
toàn bộ quang phổ: đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh, và tím. Với phương pháp này,
các mẫu nhiễm sắc thể cũng có thể nhìn thấy, các tế bào tổn thương ngoại biên
được khảo sát dễ dàng, các hình ảnh vi thể được tốt hơn, và các tế bào được
nhuộm màu khá đẹp. Các kết quả được nhuộm rất rõ ràng, thậm chí với các mẫu
dày, chồng chéo tế bào vẫn có thể được khảo sát rõ.

Nguồn: />Hình 2.5. Nhuộm Pap để kiểm tra bệnh ung thư cổ tử cung ở phụ khoa
2.2.1.4. Nhuộm PAS (Periodic acid- Schiff- PAS)
Phương pháp nhuộm này thường được sử dụng để mô tả các carbohydate
(glycogen, glycoprotein, proteoglycan). Phương pháp này được dùng để phân
biệt những kiểu tế bào khác nhau của các bệnh liên quan đến dự trữ glycogen.
Bộ nhuộm PAS gồm 03 thành phần:
- Hóa chất Schiffs (500ml).
- Periodic Acid 0.5% (500ml).
17


- Hematoxylin-I (500ml). 
Ví dụ: ECM của nguyên bào sợi chủ yếu là collagen. Sau khi nhuộm, khuôn
nền bắt màu hồng nhạt của thuốc nhuộm, có thể khẳng định khn nền thu nhận
được có thành phần chủ yếu là collagen.
2.2.1.5. Nhuộm Masson Trichrome
Là phương pháp nhuộm kết hợp ba màu, được đưa ra bởi Masson, nhằm
phân biệt tế bào từ các mô liên kết xung quanh. Kết quả là các sợi cơ và keratin
có màu đỏ, xương và collagen có màu xanh da trời (blue), hay màu xanh lá cây
(green), nguyên sinh chất có màu hồng hay đỏ sang, và nhân tế bào có màu đen.
2.2.1.6. Nhuộm Romanowsky
Phương pháp nhuộm này dựa vào sự kết hợp của eosinnate (eosin được làm
giảm) và methylene blue (đôi khi với các sản phẩm oxy hóa azure A và azure B).
Các biến thể bao gồm: nhuộm Wright, nhuộm Jenner, nhuộm Leishman và
nhuộm Giemsa.
Sau khi nhuộm, nhân tế bào có màu tím tạo ra tổ hợp DNA- AB- EY. Các
phương pháp này sử dụng để nhuộm mẫu máu và dịch tủy xương, phát hiện kí
sinh vật trong máu hay trong dịch tủy như bệnh sốt rét. Sẽ thích hợp hơn khi
nhuộm HE cho mẫu tế bào máu, bởi có thể phân biệt được các loại tế bào bạch

cầu ngoại vi. Ngồi ra, phương pháp cịn giúp phát hiện kí sinh vật trong máu
hay trong dịch tủy như bệnh sốt rét.
2.2.1.7. Nhuộm bạc
Phương pháp sử dụng dung dịch bạc để nhuộm các mẫu mô. Đây là phương
pháp đặc biệt quan trọng để biểu hiện các protein (chẳng hạn collagen III) và

18


DNA. Chúng còn được sử dụng để biểu hiện cả các cơ chất bên trong và bên
ngoài tế bào. Nhuộm bạc còn được sử dụng trong điện di gradien gel.
Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để cho phép phát hiện một lượng
protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid (pg),
nhạy gấp 1.000 - 10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr.
Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là:
(1) Dùng các dung dịch diamine silver hay ammoniacal silver cho thấm
vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde.
(2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và
dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều
kiện kiềm.
2.2.1.8. Nhuộm Sudan
Là phương pháp sử dụng thuốc có ái tính với Sudan, thường là lipid.
Nhuộm Sudan nhằm xác định các mức độ mỡ phân hay phát hiện tế bào mỡ. Các
thuốc nhuộm Sudan III, Sudan IV, Oid Red O và Sudan Black B thường được sử
dụng.
2.2.2. Nhuộm in vivo
Nhuộm in vivo là quá trình nhuộm các mô sống bằng cách làm các tế bào
hay các cấu trúc mô được biểu hiện nhờ màu tương phản. Qua đó hình dạng, hay
sự định vị nội bào (hay mơ) có thể được quan sát rõ ràng
Mục đích thơng thường của phương pháp này là phát hiện các chi tiết trong

tế bào. Tuy nhiên, cũng có thể phát hiện hóa chất hay các phản ứng sinh hóa đặc
hiệu xảy ra trong các loại tế bào hoặc mô sống.

19


Thơng thường phương pháp này cịn gọi là nhuộm sống (vital stain), bởi
chúng được tiến hành trong cơ thể khi các tế bào còn sống. Tuy nhiên, cách này
thường gây độc cho cơ thể. Để đạt được các tác động mong muốn, thuốc nhuộm
phải được sử dụng ở nồng độ rất loãng với mức từ 1/5000 – 1/500000.
2.3. Phương pháp miễn dịch học
2.3.1. Western blot
Western blot (hay immunoblot) là phương pháp kết hợp kiểu dây chuyền
giữa sinh học phân tử với sinh hóa và miễn dịch di truyền, nhằm phát hiện
protein trong một mẫu mô được chiết xuất. Điện di gel được sử dụng để phân
tách các protein đã bị biến tính. Sau đó, các protein này sẽ được chuyển thẩm từ
hệ gel lên bộ màng (thường là màng nitrocellulose). Các protein trên màng tiếp
tục được lai với các kháng thể chuyên biệt.
Lai Western blot được thực hiện giữa các protein với nhau, dựa trên nguyên
tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể.
2.3.1.1. Quy trình
 Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Mẫu được thu nhận từ mô hay các tế bào nuôi được đun sôi từ 1 - 5 phút
trong dung dich đệm (chẳng hạn Laemmli) có chứa thuốc nhuộm, một hợp chất
sulfur (thường là β-mercaptoethanol) và một chất tẩy (sodium dodecyl sulfate –
SDS). Nhiệt độ làm biến tính protein, tháo hoàn toàn các cuộn gấp. SDS sẽ làm
phân tử protein tích điện âm và β-mercaptoethanol ngăn cản sự tái hình thành
các cầu nối disulfide.
 Bước 2: Chạy điện di

20


Protein trong mẫu được phân tách theo khối lượng phân tử bằng điện di trên
gel. Gel được pha chế theo cơng thức khác nhau, tùy từng phịng thí nghiệm,
khối lượng phân tử của protein quan tâm và dung dịch đệm sử dụng (gel
polyacrylamide thường được sử dụng nhất)
Trong điện di một chiều, các mẫu được nạp vào các giếng cạnh nhau trên
gel. Protein được phân tách dựa vào khối lượng tạo thành các vạch (band) trong
mỗi đường (lane) hình thành dưới giếng. Một thang hỗn hợp protein sẵn có sẽ
giúp xác định khối lượng phân tử được sử dụng, đồng thời quá trình chạy điện di
sẽ xác định khối lượng phân tử protein quan tâm.
Điện di gel hai chiều cũng có thể được sử dụng trong phân tích này. Các
protein được tách theo điểm đẳng điện (độ pH mà tại đó chúng tích điện trung
hịa) trong lần điện di đầu và theo khối lượng phân tử của chúng trong lần điện di
thứ hai.
 Bước 3: Chuyển protein từ gel lên màng
Để các protein có thể được phát hiện bởi kháng thể, chúng chuyển thẩm
tách từ gel lên màng (được làm bởi nitrocellulose hay PVDF). Các protein tích
điện di chuyển từ trong gel vào màng, nhưng vẫn duy trì tổ chức của chúng có
trong gel. Kết quả của q trình là sự hiện diện protein trên bề mặt màng. Sự gắn
các protein dựa vào sự tương tác kị nước, cũng như các tương tác điện tích giữa
màng và protein.
 Bước 4: Khóa màng
Khi màng được chọn cho khả năng gắn protein, các bước phải tiến hành sao
cho ngăn cản sự tương tác của protein không đặc hiệu gắn vào kháng thể (chỉ
dành cho protein mục tiêu). Khóa sự gắn khơng đặc hiệu được tiến hành bằng

21

cách đặt màng trong một dung dịch loãng của protein, thường là BSA (Bovine
serum albumin), hay sữa khô không chất béo, với 1% chất tẩy tween 20 hay
carbon chất dẻo.
 Bước 5: Lai với kháng thể chuyên biệt và phát hiện kết quả
Màng được lai với kháng thể chuyên biệt trước đó để phát hiện protein quan
tâm. Các kháng thể quan tâm được liên kết với một enzyme báo cáo, nhằm tạo ra
tín hiệu màu hay phát quang. Nhìn chung, có nhiều phương pháp phát hiện kết
quả gắn:

 Phương pháp phát hiện hai bước
- Sau khi khóa, dung dịch lỗng của kháng thể sơ cấp (0,5 và 5 μg/ml)
được ủ với màng trong điều kiện lắc nhẹ. Dung dịch kháng thể sơ cấp và màng
có thể được cố định và ủ từ 30phút - 12 giờ.
- Rửa màng để tách kháng thể sơ cấp thừa (không gắn vào màng)
- Cho màng tiếp xúc với kháng thể khác nhằm bắt cặp với các vị trí
chuyên biệt trên kháng thể sơ cấp và gọi là kháng thể thứ cấp.
- Các kháng thể thứ cấp được liên kết với biotin hay một enzyme báo cáo
(alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase).
 Phương pháp phát hiện một bước
- Kỹ thuật này cần một kháng thể mẫu dị có cả hai khả năng là nhận diện
các protein quan tâm và chứa yếu tố đánh dấu để phát hiện, các mẫu dị thường
sẵn có cho các thể protein đã biết (protein tag). Mẫu dò sơ cấp được ủ với màng
giống cách ủ kháng thể sơ cấp trong quá trình hai bước. Sau đó rửa và phát hiện
trực tiếp.

22


 Phát hiện bằng thước đo màu (Colorimetric detection)

- Phương pháp này phụ thuộc vào công đoạn ủ western blot cùng cơ chất
có phản ứng với một enzyme báo cáo (như peroxidase). Cơ chất gắn vào kháng
thể thứ cấp, làm dung dịch thuốc nhuộm chuyển thành dạng hòa tan để cho một
màu khác và do đó chúng dễ dàng nhuộm màu màng nitrocellulose. Mức độ thu
nhận protein sẽ được đánh giá thông qua việc đo nồng độ (densitimetry), hay đo
quang phổ (spectrophotometry).

 Sự phát quang bằng phản ứng hóa học (Chemiluminescence)
- Phụ thuộc vào sự ủ của western blot với cơ chất sẽ phát quang khi tiếp
xúc với chất báo cáo trên kháng thể thứ cấp.
- Sau đó ánh sáng được phát hiện bằng chụp ảnh. Gần đây, các máy chụp
hình CCD có thể ghi nhận các hình ảnh của western blot.

 Phát hiện phát huỳnh quang
- Những mẫu dò đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng
- Sự phát ra của luồng ánh sáng kích thích có thể được ghi nhận bằng một
photosensor (CCD camera). Đây là phương pháp nhạy cảm nhất trong phân tích
blot.

 Phát hiện phóng xạ
- Đánh dấu phóng xạ khơng địi hỏi cơ chất
- Để ghi nhận ảnh, người ta đặt một tấm phim X-ray trực tiếp lên western
blot khi nó được tiếp xúc với yếu tố đánh đấu, và tạo ra các vùng tối tương ứng
với các band protein quan tâm.
- Phát hiện bằng phóng xạ ít phổ biến, bởi rất tốn kém và có nhiều rủi ro.

23


Nguồn: />2.3.1.2. Ứng dụng

 Xác định sự hoạt động của gen thơng qua sự có mặt protein trong mơ.
Độ lớn của protein.
 Mức độ hoạt động của gen.
 Phân tích cây trồng chuyển gen.
 Phân tích bệnh do vi khuẩn, virus gây ra.
 Ứng dụng trong y tế.
2.3.2. Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry)
2.3.2.1. Khái niệm
Hóa mơ miễn dịch là q trình các protein định vị trong tế bào của lát mô
gắn với kháng thể tương ứng của chúng theo nguyên tắc kháng nguyên – kháng
thể.
2.3.2.2. Cơ chế
Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Để quan sát được chúng, các

24