Quy trình định tính samonella

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA


Salmonella xâm nhập vào
cơ thể????

•
•
•
•
•
•

Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.
Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa bảo quản không tốt)
Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao.
Khi tiếp xúc phân người và súc vật có nhiễm salmonella.
Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”
triệu chứng đau bụng, tiêu chảy


TRIỆU






Tiêu chảy, đau bụng, buồn ói và ói, sốt, đau đầu,…
Thường xảy ra khoảng 12-36h sau khi ăn.
Các triệu chứng có thể kéo dài từ 2 ngày đến 1 tuần.

CHỨNG

Khơng ăn / uống sữa hoặc những sản phẩm từ sữa chưa thanh trùng
Rửa sạch hoa quả, rau củ trước khi ăn
0
0
Giữ thực phẩm ở nhiệt độ 4.4 C hoặc -18 C
Chỉ ăn thức ăn đã nấu chín
Rửa sạch các dụng cụ sau khi thái các thực phẩm sống


Đặc điểm chung của vi sinh vật
Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình từ 0.53µm

Di chuyển bằng tiên mao trừ S.gallimarum và S.pullorum, không tạo bào
tử

Phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 35-37oC, pH từ 4-9 và thích hợp nhất
ở pH=7.2


Tính chất hóa sinh

Lên men glucose và mannitol sinh acid

nhưng không lên men saccharose và
lactose.
Không sinh indol, không phân giải ure,
khơng có khả năng tách nhóm amine từ
tryptophane



 Hầu hết các chúng đều sinh H2S.


Mơi trường và hóa chất

Mục đích

Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW)

Tăng sinh sơ bộ

Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RVS)
Tăng sinh chọn lọc
Selenit xystin/ Tetrathionat (TT)

Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
Phân lập
Hektoen Entric Agar (HE)

Tryptone soy agar (TSA)

Phục hồi

 

Phương pháp
thực hiện


*Quy trình định tính


BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH
Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm.
Là sử dụng mơi trường tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế.

Ủ ở 37 độ C trong 1824h

25g mẫu

25g mẫu
Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher

+
225ml BPW

60 giây


BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH

Tên môi trường

Thành phần

Pepton 10g
Dung dịch Buffered Peptone Water

NaCl 5g

(BPW)

Na2HPO4 3,5g
KH2PO4 1,5g

Ngồi ra cịn có thể sử dụng một số môi trường:
-Môi trường dịch thể Tryptic soy broth(TSB)


Tên môi trường

Thành phần
Trypticase peptone 17g.

Phytone peptone 3g.

Trypticase Soy Broth (TSB)

NaCl 5g.

K2HPO4 2,5g.

Glucose 2,5g.
Nước cất đến 1 lít.


BƯỚC 2: TĂNG SINH
CHỌN LỌC

•

Chuyển 0,1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở
 o
41,5 C 10C trong 243h
 
Chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ ở
37oC 10C trong 243h
 


Tên môi trường

RVS

Thành phần
Pepton từ đậu tương:

4,5 g/l

Natri clorua:

7,2 g/l

Kali dihydro phosphat :

1,44 g/l

Magie clorua khan (MgCI2):

13,4 g/l

Oxalat xanh malachit:

0,036 g/l.

Canh RVS ức chế vi khuẩn khác nhờ MgCI2 bằng cách tác động lên tế bào vi khuẩn và nhờ màu
xanh Malachite ức chế các vi khuẩn Gr(+)


Tên môi trường

Novobioxin
tetrathionat mullerkauffmann (MKTTn)

Thành phần

Hàm lượng

Cao thịt

4,3 g

Pepton từ casein

8,6 g

Natri clorua (NaCI)

2,6 g

Canxi cacbonat (CaCO3)

38,7 g

Natri thiosulfat ngậm 5 phân tử nước

47,8 g

(Na2S2O3.5H2O)
Mật bò

Brilliant green

Nước

4,78 g

9,6 mg

1 000 ml

BƯỚC 2: TĂNG SINH
CHỌN LỌC

Mỗi loại mơi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella.
Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau để tăng khả năng phát hiện tất cả các dịng Salmonella cần dùng ít nhất hai
loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu.

Selenite Cysteine Broth

Một số môi trường tăng sinh

0
Ủ ở 37 c trong 22-24h

chọn lọc khác cũng được dùng

Tetrathionat


BƯỚC 3: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc
trưng cho Salmonella như XLD, HE…

Mục đích:
Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu

Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng
khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dạng Salmonella phải dùng tôi thiểu 2 môi trường chọn lọc

phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu.


Mơi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt,
có hay khơng có tâm đen. Một số dịng Salmonella có
thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết
khuẩn lạc


Thành phần môi trường XLD
Bột cao nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Xyloza

3,75 g

Lactoza

7,5 g

Sucroza

Tâm đen

7,5 g

L-Lyzin hydroclorua

5,0 g

Natri thiosulfat

6,8 g

Sắt (III) amoni xitrat

0,8 g

Phenol đỏ
Natri deoxycholat

0,08 g
1,0 g

Thạch

9g

Nước

1 000 ml


Mơi trường HE

•

Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm
đen, đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc.

Tâm đen


Môi trường BS
(Bismuth Sulfite Agar)

Polypeptone (hay peptone)

10g

Cao thịt

5g

Dextrose

5g

Na2HP04 (anhydrous)

4g

FeS04 (anhydrous)

0,3g

Bismuth sulfite

8g

Brilliant green

0,025g

Agar

20g

Nước cất

1lít

Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh
thoảng có xuất hiện ánh kim tím.


Bước 4: Phục hồi

•

•

Nếu trên một đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó
cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 3710C trong 24

 

Môi trường

Thành phần

Trypeptone

Tryptic Soya Agar (TSA)

Peptone đậu nành

Agar

15g/l

5g/l

15g/l


Bước 5 :Khẳng định

Nhằm xác nhận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho Samonella
xuất hiện trên môi trường phân lập.

Bước này dựa trên việc sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và
thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella.

Thử nghiệm sinh H2S trên mơi trường TSI (+)

•

Cấy ria trên bề mặt nghiêngỐng
của
thạch và cấy đâm sâu xuống
1: môi trường TSI khơng có VSV. Ống 2: xuất hiện
đáy.

màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men
glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên
men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch
nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên
men glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có
q trình khử lưu huỳnh và sinh H2S.


Được thực hiện trên môi trường urea lỏng , chứa chỉ thị đỏ
phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH
6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn
lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc
0
nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37 C trong 48 giờ.
Salmonella không phân giải urea thành NH3 nên không làm
thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn
giữ nguyên màu vàng cam.

Thử nghiệm urea (-)

Môi trường được sử dụng là môi trường lỏng Clark-Lubs (mơi
trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que cấy vịng cấy vào các ống mơi
trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ
18-24 giờ trên môi trường KIA. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử
trực tiếp vào ống môi trường. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm
nhất 4 giờ.

Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có
hiện tượng khơng đổi màu trên bề mặt môi trường.

Thử nghiệm VP(-)