Tài liệu Xây dựng phương pháp định lượng Vildaglitin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ

tai lieu, document1 of 66.

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thị Nga

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VILDAGLIPTIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2021

luan van, khoa luan 1 of 66.


tai lieu, document2 of 66.

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thị Nga

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VILDAGLIPTIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hố phân tích
Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Dương Tuấn Hưng
Hướng dẫn 2: TS. Tạ Mạnh Hùng
Hà Nội – 2021

luan van, khoa luan 2 of 66.


tai lieu, document3 of 66.

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu,

kết quả trong luận văn là trung thực. Những kết luận của luận văn chưa công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2021
Tác giả

Trần Thị Nga

luan van, khoa luan 3 of 66.


tai lieu, document4 of 66.

ii

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Dương Tuấn Hưng
và TS. Tạ Mạnh Hùng đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện và hồn thành luận văn này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Học Viện Khoa Học
và Công Nghệ đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường.
Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu tại Viện.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới tồn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá
Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã chia sẻ và
giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
giúp đỡ và động viên để tơi có đủ nghị lực, quyết tâm hồn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2021
Học viên

Trần Thị Nga

luan van, khoa luan 4 of 66.


tai lieu, document5 of 66.

iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Từ viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng việt

AN

Analyte

Chất phân tích

AUC

Area Under the Curve

Diện tích dưới đường cong

CC

Calibration Curve

Đường chuẩn

CV

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

Cmax

Maximum Concentration

Nồng độ đỉnh

CTPT

Molecular Formula

Công thức phân tử

DĐH

Pharmacokinetics

Dược động học

EMA

European Medicines Agency

Cơ quan quản lý thuốc Châu
Âu

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa kiểu phun điện

GLP

Good Laboratory Practices

HD
HPLC

Thực hành tốt phịng thí
nghiệm
Hạn dùng

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC

High Quality Control

Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

HQCS

High Quality Control
Stability

Mẫu kiểm tra độ ổn định ở
nồng độ cao

HT

Plasma

Huyết tương

luan van, khoa luan 5 of 66.


tai lieu, document6 of 66.

iv

HTT

Blank Plasma

Huyết tương trắng

KLPT

Molecular Weight

Khối lượng phân tử

IS

Internal Standard

Chất chuẩn nội

LC-MS

LC-MS/MS

Liquid Chromatography –
Mass spectrometry
Liquid Chromatography –
Tandem Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng hai lần khối phổ

LLE

Liquid – Liquid Extraction

Chiết lỏng – lỏng

LLOQ

Lower Limit of
Quantification

Giới hạn định lượng dưới

LQC

Low Quality Control

Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

Low Quality Control

Mẫu kiểm tra độ ổn định ở

Stability

nồng độ thấp

LQCS
MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

m/z

Mass to charge ratio

Khối lượng/điện tích

MF

Matrix Factor

Hệ số nền mẫu

Middle Quality Control

Mẫu kiểm tra ở nồng độ

Samples

trung bình

MQC

MRM
NTN

luan van, khoa luan 6 of 66.

Multiple Reaction
Monitoring

Đo chọn lọc đa ion
Người tình nguyện


tai lieu, document7 of 66.

v

Nucleoside Reverse

Thuốc ức chế enzyme sao

Transcriptase Inhibitor

chép ngược nucleosid

PPT

Protein Precipitation
Technique

Kỹ thuật kết tủa protein hay
Kết tủa protein

PTHQ

Regression Equation

Phương trình hồi quy

QC

Quality Control

Mẫu kiểm tra

QCP

Quality Control Plan

Kế hoạch quản lý chất lượng

NRTI

SĐK

Số đăng kí

SKD

Bioavailability

Sinh khả dụng

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Natri dodecyl sulfat

SKĐ

Sắc ký đồ

SPE

Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

SST

System Suitablity Test

Độ thích hợp của hệ thống

TBME
TĐSH

Tert butyl methyl ether
Bioequivalence

Tương đương sinh học
Thời gian đạt nồng độ thuốc
tối đa trong máu

Tmax
tR

Retention Time

Thời gian lưu

TB

Mean

Trung bình

ULOQ

luan van, khoa luan 7 of 66.

Upper Limit of
Quantification

Giới hạn định lượng trên


tai lieu, document8 of 66.

vi

The United States – The
US-FDA

Food and Drug
Administration

Cơ quan Quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ

VKNTTW

National Institute of Drug
Quality Control

Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Trung Ương

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

WSS

Working Standard Solutions

Dung dịch chuẩn làm việc

luan van, khoa luan 8 of 66.


tai lieu, document9 of 66.

vii

Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương người ....... 6
Bảng 2.1. Các chất chuẩn được sử dụng ....................................................... 19
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương ............................. 25
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương ............................... 25
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương .................................... 26
Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hoá............................................................... 35
Bảng 3.2. Điều kiện sắc ký ........................................................................... 41
Bảng 3.3. Điều kiện khối phổ định lượng VDG và IS ................................... 42
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống ................................... 44
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng tR của VDG và IS .. 47
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2......... 48
Bảng 3.7. Tín hiệu đo pic của mẫu LLOQ và mẫu Zero tại tR của VDG ....... 50
Bảng 3.8. Độ đúng, độ chính xác của mẫu LLOQ ........................................ 50
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu .................................... 52
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo ................................................. 53
Bảng 3.11. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày......................... 54
Bảng 3.12. Độ lặp lại khi tiêm lại ................................................................. 55
Bảng 3.13. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng.......................................... 57
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ thu hồi của IS ............................................. 58
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ thu hồi của VDG......................................... 59
Bảng 3.16. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc VDG theo thời gian .... 61
Bảng 3.17. Kết quả độ ổn định dung dịch nội chuẩn gốc theo thời gian........ 62
Bảng 3.18. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc trong thời gian ngắn ... 62

luan van, khoa luan 9 of 66.

tai lieu, document10 of 66.

viii

Bảng 3.19. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn nội gốc trong thời gian ngắn
..................................................................................................................... 63
Bảng 3.20. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 6 chu kỳ đông – rã............ 64
Bảng 3.21. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian ngắn ... 66
Bảng 3.22. Độ ổn định của mẫu huyết tương khơng kiềm hố trong thời gian
ngắn bảo quản trong thùng đá (~ 4°C) .......................................................... 68
Bảng 3.23. Độ ổn định của huyết tương trong thời gian dài (77 ngày) .......... 70
Bảng 3.24. Kết quả độ ổn định của mẫu bảo quản trong autosampler ........... 71
Bảng 3.25. Kết quả nồng độ VDG trong huyết tương 01 NTN ..................... 74

luan van, khoa luan 10 of 66.


tai lieu, document11 of 66.

ix

Danh mục các hình
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Vildagliptin ................................................. 3
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ............................... 9
Hình 1.3. Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba............. 11
Hình 3.1. Phổ khối của dung dịch chuẩn VDG với chế độ ESI (+) ............... 32
Hình 3.2. Cơ chế phân mảnh của Vildagliptin .............................................. 32
Hình 3.3. Giản đồ tối ưu điện thế bộ phận thu mẫu ...................................... 33
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn VDG, carbamazepin,

metoprolol, diltiazem ................................................................................... 34
Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni axetat 2mM (8:2) ................................................................... 36
Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni axetat 2mM (9:1) ................................................................... 36
Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni bicacbonat 1mM (95:5) .......................................................... 37
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni bicacbonat 1mM (90:10) ........................................................ 37
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni bicacbonat 2mM (85:15) ........................................................ 38
Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG khi sử dụng hệ pha động
MeCN:amoni bicacbonat 2mM (80:20) ........................................................ 38
Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa VDG và IS với điều kiện tối ưu . 39
Hình 3.12. Quy trình xử lý mẫu .................................................................... 40
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa VDG và IS tại chế độ ESI (+) . 43
Hình 3.14. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn VDG ở
nồng độ 288 ng/mL ...................................................................................... 44
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (Blank)............................. 45

luan van, khoa luan 11 of 66.


tai lieu, document12 of 66.

x

Hình 3.16. Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng có pha IS (Zero) ............... 46
Hình 3.17. Sắc ký đồ của mẫu HTT có pha IS và chuẩn VDG nồng độ 3 ng/mL
(LLOQ) ........................................................................................................ 46

Hình 3.18. Đồ thị phần dư của các đường chuẩn thực nghiệm theo mơ hình
weighting 1/x2 .............................................................................................. 48
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc .............. 75
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 1,33 giờ ... 76
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 12 giờ ...... 76
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc 24 giờ ...... 77
Hình 3.23. Đường cong nồng độ VDG trong mẫu huyết tương của NTN theo
thời gian ....................................................................................................... 77

luan van, khoa luan 12 of 66.


tai lieu, document13 of 66.

xi

MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ............................................................ iii
Danh mục các bảng ...................................................................................... vii
Danh mục các hình ........................................................................................ ix
MỤC LỤC .................................................................................................... xi
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ VILDAGLIPIN ....................................................... 3
1.1.1. Cơng thức cấu tạo và tính chất hoá lý ............................................... 3
1.1.2. Dược động học ................................................................................. 3
1.1.3. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin ...................................... 5
1.2. SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ................................................................ 8
1.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ ........................ 8
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ............................................................ 9

1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu ..................................................................... 9
1.2.2.2. Nguồn ion hoá ....................................................................... 10
1.2.2.3. Bộ phận phân tích khối .......................................................... 10
1.2.2.4. Bộ phận phát hiện (detector) .................................................. 12
1.2.2.5. Bộ xử lý dữ liệu ..................................................................... 12
1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 12
1.3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu ......................................................................... 12
1.3.1.1. Kỹ thuật kết kết tủa protein (PPT) ......................................... 13
1.3.1.2. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (LLE) ........................................... 13
1.3.1.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ................................................. 14

luan van, khoa luan 13 of 66.


tai lieu, document14 of 66.

xii

1.3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích thuốc trong dịch
sinh học .................................................................................................... 15
1.3.2.1. Độ chọn lọc ........................................................................... 15
1.3.2.2. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ......................................... 15
1.3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................... 16
1.3.2.4. Ảnh hưởng của nền mẫu ........................................................ 16
1.3.2.5. Độ nhiễm chéo....................................................................... 17
1.3.2.6. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày .................... 17
1.3.2.7. Độ thu hồi .............................................................................. 17
1.3.2.8. Độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học ........................ 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 19

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................... 19
2.2.1. Hoá chất, chất chuẩn ....................................................................... 19
2.2.2. Mẫu huyết tương trắng ................................................................... 20
2.2.3. Dung mơi, hố chất......................................................................... 20
2.2.4. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................. 20
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 21
2.3.1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích trên
hệ thống LC-MS/MS ................................................................................ 21
2.3.1.1. Xây dựng điều kiện khối phổ xác định VDG và chuẩn nội .... 21
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................... 22
2.3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương ............................. 22
2.3.1.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích ............. 23
2.3.1.5. Phương pháp tính kết quả ...................................................... 26

luan van, khoa luan 14 of 66.


tai lieu, document15 of 66.

xiii

2.3.2. Xác định nồng độ VDG trong mẫu huyết tương người tình nguyện 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 31
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ................... 31
3.1.1. Điều kiện khối phổ và lựa chọn chuẩn nội để định lượng Vildagliptin
31
3.1.1.1. Điều kiện khối phổ định lượng Vildagliptin ........................... 31
3.1.1.2. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội .................................................. 34
3.1.1.3. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ ......................................... 35
3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................... 35

3.1.3. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương.................................. 40
3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng VDG trong huyết tương .......... 41
3.1.4.1. Quy trình xử lý mẫu huyết tương ........................................... 41
3.1.4.2. Điều kiện khối phổ ................................................................ 41
3.1.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ..................................... 43
3.1.5.1. Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS .................................... 43
3.1.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp ............................................... 45
3.1.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ....................................... 48
3.1.5.4. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) .......................... 49
3.1.5.5. Ảnh hưởng của nền mẫu ........................................................ 51
3.1.5.6. Độ nhiễm chéo....................................................................... 52
3.1.5.7. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày .................... 53
3.1.5.8. Độ lặp lại khi tiêm lại ............................................................ 54
3.1.5.9. Độ đúng, độ chính xác khác khi pha lỗng mẫu 2 lần ............ 56
3.1.5.10. Xác định độ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội ........... 57
3.1.5.11. Nghiên cứu độ ổn định......................................................... 60

luan van, khoa luan 15 of 66.


tai lieu, document16 of 66.

xiv

3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VDG TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
TÌNH NGUYỆN ........................................................................................ 73
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 79
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................ 79
4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 81

PHỤ LỤC .................................................................................................... 85

luan van, khoa luan 16 of 66.


tai lieu, document17 of 66.

1

MỞ ĐẦU
Vildagliptin, một chất thuộc nhóm thuốc tăng cường chức năng tiểu đảo
tụy, là chất ức chế dipeptidyl-peptidase-4(DPP-4) mạnh và chọn lọc nên cải
thiện được sự kiểm soát đường huyết [1-3]. Sự ức chế DPP-4 của vildagliptin
làm tăng nồng độ các hormone incretin GLP-1 (glucagon-like peptide 1) và
GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) nội sinh lúc đói và sau bữa
ăn. Thuốc được chỉ định như một thuốc hỗ trợ cho chế độ ăn và luyện tập để
cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (T2DM),
đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường khác [4].
Hiện nay, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu
sản xuất các chế phẩm chứa vildagliptin. Tuy nhiên, việc kiểm sốt chất lượng
của các thuốc này thơng qua đánh giá tương đương sinh học chưa được thực
hiện đầy đủ. Để xác định được chính xác nồng VDG trong máu, đánh giá chất
lượng của thuốc cũng như hiệu quả điều trị trong lâm sàng của thuốc, cần thiết
phải thực hiện các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và đánh giá tương đương
sinh học (TĐSH). Kết quả đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
giúp các bác sĩ có thêm cơ sở để lựa chọn thuốc thay thế hiệu quả hay hiệu
chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân. Một trong những nội dung
quan trọng của nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH là xây dựng quy trình chiết
tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng nồng độ thuốc trong dịch sinh học.
Q trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn

do nồng độ thuốc trong mẫu thấp, nền mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây
ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Hơn nữa khi vào cơ thể dưới sự tác động
của rất nhiều loại enzym thì thuốc có thể bị chuyển hóa thành nhiều chất khác
nhau nhưng có cấu trúc và tính chất tương tự như hoạt chất cần phân tích. Vì
vậy, cần phải xây dựng được một phương pháp thích hợp có đủ độ nhạy và độ
tin cậy theo quy định về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích
trong dịch sinh học.
Do có độ nhạy và độ chọn lọc cao nên kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ ngày
càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh học [5].

luan van, khoa luan 17 of 66.


tai lieu, document18 of 66.

2

Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp
định lượng Vildagliptin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ”
với mục đích xây dựng được một phương pháp phân tích phù hợp, để định
lượng vildagliptin trong huyết tương người. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần
nâng cao chất lượng thuốc trên thị trường cũng như đáp ứng yêu cầu điều trị
trong lâm sàng.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là:
1. Xây dựng và xác nhận giá trị sử dụng pháp định lượng vildagliptin
trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ.
2. Ứng dụng định lượng vildagliptin trong huyết tương người tình
nguyện bằng phương pháp vừa xác nhận giá trị sử dụng phục vụ đánh giá tương
đương sinh học.

luan van, khoa luan 18 of 66.


tai lieu, document19 of 66.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ VILDAGLIPIN
1.1.1. Cơng thức cấu tạo và tính chất hố lý
Cơng thức phân tử, cơng thức cấu tạo và tính chất hố lý cơ bản của
Vildagliptin được trình bày dưới đây [6]:
Tên khoa học:
(2S)-1-[2-[(3-hydroxy-1-adamantyl)amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonitrile.
Công thức phân tử: C17H25N3O2
Khối lượng phân tử: 303,4 g/mol
pKa = 9,03
LogP = 1,12
Tính tan trong nước: 1,75mg/mL

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Vildagliptin
1.1.2. Dược động học
Một số tính chất dược động học cơ bản của vildagliptin được đề cập trên
nhiều tài liệu chuyên khảo [7], được trình bày tóm tắt như sau:
- Hấp thu: Sau khi uống lúc đói, vildagliptin được hấp thu nhanh với
nồng độ đỉnh trong huyết tương được quan sát thấy sau 1,75 giờ. Dùng cùng
với thức ăn làm giảm nồng độ Cmax (19%) và có sự chậm lại về thời gian đạt
đến nồng độ đỉnh trong huyết tương đến 2,5 giờ. Tuy nhiên mức độ thay đổi
khơng có ý nghĩa lâm sàng.

luan van, khoa luan 19 of 66.


tai lieu, document20 of 66.

4

- Phân bố: Vildagliptin gắn kết kém với protein huyết tương (9,3%) và
phân bố bằng nhau giữa huyết tương và hồng cầu.
- Chuyển hóa: Khoảng 69% liều uống của vildagliptin bị chuyển hóa.
Chất chuyển hóa chính LAY151 khơng có hoạt tính dược lý và là sản phẩm
thủy phân của nhóm chức cyano chiếm 57% liều dùng, tiếp theo là sản phẩm
thủy phân nhóm chức amid (4% liều dùng). Vildagliptin khơng bị chuyển hóa
bởi các enzym CYP P450. Các nghiên cứu in vitro cho thấy vildagliptin không
ức chế hoặc gây cảm ứng các enzyme CYP P450.
- Thải trừ: Sau khi uống vildagliptin, khoảng 85% liều dùng được bài tiết
vào nước tiểu và 15% được tìm thấy ở phân. Vildagliptin dạng không đổi bài
tiết qua thận chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi
uống khoảng 3 giờ và không phụ thuộc vào liều dùng.
- Sự tuyến tính: Sinh khả dụng tuyệt đối đường uống của thuốc là 85%.
Cmax và diện tích dưới đường cong (AUC) của vildagliptin gần như tăng tỉ lệ
với liều dùng trong phạm vi liều điều trị.
- Chỉ định: Thuốc được chỉ định như một thuốc hỗ trợ cho chế độ ăn và
luyện tập để cải thiện sự kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường
type 2 (T2DM), đơn trị liệu hoặc phối hợp với thuốc điều trị đái tháo đường
khác.
- Chống chỉ định: Chống chỉ định dùng bệnh nhân đã biết bị quá mẫn
cảm với vildagliptin hoặc với bất cứ tá dược nào của thuốc.
- Tác dụng không mong muốn: Đa số các phản ứng bất lợi trong những
thử nghiệm này là nhẹ và thống qua, khơng cần phải ngừng điều trị. Khơng có

sự liên quan giữa những phản ứng bất lợi này với tuổi, chủng tộc, thời gian
dùng thuốc hoặc liều lượng hàng ngày.
+ Các trường hợp hiếm gặp về rối loạn chức năng gan (kể cả viêm gan)
đã được báo cáo. Trong những trường hợp này, bệnh nhân thường khơng có
triệu chứng hay di chứng lâm sàng; các xét nghiệm chức năng gan trở về bình
thường sau khi ngừng điều trị.

luan van, khoa luan 20 of 66.


tai lieu, document21 of 66.

5

+ Các tác dụng phụ sau có thể gặp phải khi dùng thuốc dưới dạng đơn trị
liệu như sau:
+ Thường gặp (tần suất >1/100): chóng mặt.
+ Ít gặp (tần suất >=1/1000 và <1/100): đau đầu, táo bón, phù nề (bàn
tay, bàn chân hay mắt cá chân), đau khớp, hạ đường huyết.
+ Rất hiếm gặp (tần suất <1/10.000): nhiễm trùng đường hô hấp trên.
- Tương tác thuốc: Vildagliptin có khả năng tương tác thuốc yếu. Vì
vildagliptin khơng phải là một cơ chất của enzyme CYP 450, không ức chế và
cũng không gây cảm ứng các enzyme CYP 450 nên khơng có khả năng tương
tác với các thuốc dùng đồng thời là cơ chất, chất ức chế hoặc chất gây cảm ứng
các enzyme này.
Hơn nữa, vildagliptin không ảnh hưởng đến độ thanh thải chuyển hóa
của các thuốc dùng đồng thời được chuyển hóa bởi CYP 1A2, CYP 2C8, CYP
2C9, CYP 2C19, CYP 2D6, CYP 2E1 và CYP 3A4/5. Các nghiên cứu về tương
tác thuốc-thuốc đã được tiến hành với các thuốc thường được kê đơn đồng thời
cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 hoặc những thuốc có cửa sổ điều trị hẹp.

Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy khơng có tương tác nào có ý nghĩa
lâm sàng với các thuốc điều trị đái tháo đường dạng uống khác (glibenclamid,
pioglitazone, metformin), amlodipin, digoxin, ramipril, simvastatin, valsartan
hoặc warfarin sau khi dùng đồng thời với vildagliptin. Thuốc có thể tăng nguy
cơ phù mạch ở bệnh nhân dùng kết hợp với chất ức chế ACE [6].
1.1.3. Một số phương pháp định lượng Vildagliptin
Trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được sử
dụng phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não
tủy...do thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn. Các mẫu máu sau
khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đơng Na2–EDTA,
ly tâm tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ quy định cho đến khi
được phân tích.

luan van, khoa luan 21 of 66.


tai lieu, document22 of 66.

6

Với các thuốc chứa VDG, khoảng 85% liều dùng được bài tiết vào nước
tiểu và 15% được tìm thấy ở phân. Vildagliptin dạng khơng đổi bài tiết qua thận
chiếm 23% liều dùng sau khi uống. Thời gian bán thải sau khi uống khoảng 3
giờ và không phụ thuộc vào liều dùng. Do đó, nồng độ VDG trong nước tiểu
thường thấp hơn nhiều so với nồng độ VDG trong huyết tương. Chính vì vậy
đa số các nghiên cứu định lượng VDG trong dịch sinh học được tiến hành trên
mẫu huyết tương.
Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố phương pháp định lượng VDG
trong huyết tương người bằng HPLC hoặc LC/MS được thể hiện trong Bảng
1.1.

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương người
TT

Xử lý
mẫu

Điều kiện sắc ký

LLOQ

Tài liệu
tham khảo

1 mcg

[8]

10 mcg

[9]

1 ng

[10]

- Cột C18, 250mm x 4,6; 5µm
1

LLE

- Pha động: MeOH: MeCN: Đêm
phosphat pH 3,5 (5: 30: 65 v/v)
- Detector: UV, 212 mm
- Thời gian phân tích: 7,0 phút
- Cột C18, 150mm x 4,6; 5µm

2

PPT

- Pha động: Amoni bicacbonat
50mM pH 7,8: MeCN
- Detector: UV, 210 mm
- Thời gian phân tích: 11,2 phút
- Cột C8, 150 x 2mm; 3µm

3

LLE

- Pha động: MeCN: Amoni format
pH: 3,0 (90:10)
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích mẫu: 7,5
phút

luan van, khoa luan 22 of 66.


tai lieu, document23 of 66.

7

- Cột C18, 50mm x 4,6; 5µm

4

PPT

- Pha động: MeCN: NaH2PO4
10Mm (3:7) và SDS (10mm) ở pH
4,5

0,1 mcg

[11]

5 ng

[12]

5 ng

[4]

2 ng

[13]

- Detector: UV, 208 mm

- Thời gian phân tích mẫu: 5 phút
- Cột C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 μm)

5

PPT

- Pha động: Axit acetic 0,5%/
MeOH: Amoni axetat 0,02M
(10:90).
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích mẫu: 7,1
phút
- Cột Atlantis HILIC Silica (150
mm × 2,1 mm, 3 μm)

6

PPT

- Pha động: H2O: MeCN (80: 20)
- Detector: MS/MS
- Thời gian phân tích mẫu: 3,5
phút
- Cột C18 (150 mm x 2,1mm; 5μm)

7

SPE

- Cột Pha động: 40% A (Amoni
axetat 10mM-MeOH [95:5] và
60% B (MeCN: MeOH [10/90])
- Thời gian phân tích: 25 phút

Các kết quả nghiên cứu định lượng VDG trong huyết tương được tổng
hợp trong Bảng 1.1, cho thấy những ưu, nhược điểm còn tồn tại như sau:
Phương pháp [8] và [10] sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng (LLE),
[8] có LLOQ cao (1mcg/mL và thời gian phân tích dài (7,0 phút), [10] thời gian
phân tích mẫu dài (7,5 phút).

luan van, khoa luan 23 of 66.


tai lieu, document24 of 66.

8

Phương pháp [4], [9], [11], [12] sử dụng phương pháp kết tủa protein
nhưng [9], [11] có LLOQ cao (10 mcg/mL và 0,1 mcg/mL); [12] có thời gian
phân tích dài (7,1 phút). Phương pháp [4] cột phân tích giá thành cao khơng
phù hợp.
Phương pháp [13] sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu là SPE nên tốn kém chi
phí thí nghiệm, chưa thực sự phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt Nam.
1.2. SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
1.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa
khả năng phân tách các chất của hệ thống sắc ký lỏng và khả năng phân tích
khối của detector khối phổ. Chất phân tích ở pha lỏng sau khi ra khỏi cột sắc
ký được chuyển thành pha khí để ion hố. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống

có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích [5].
Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao có vai
trị phân tách (một phần hoặc hồn tồn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành
phần tạp chất có trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng
với hoạt chất đi vào nguồn ion. Do vậy, hiệu suất ion hóa được cải thiện góp
phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích [14].
Tùy thuộc vào cấu tạo của chất phân tích và kỹ thuật ion hóa được sử
dụng mà chất phân tích có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích
điện hoặc bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân tử để hình thành các ion hoặc
các tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn. Hỡn hợp các ion, tiểu phân
mang điện hình thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân
tích khối. Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác
nhau sẽ chuyển động với tốc độ và quỹ đạo khác nhau. Do vậy, sau khi đi qua
bộ phận phân tích khối, các ion trong hỡn hợp sẽ được phân tách riêng thành
từng loại. Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại ion được lựa chọn thành từng vạch
phổ tương ứng trên phổ đồ [15].

luan van, khoa luan 24 of 66.


tai lieu, document25 of 66.

9

Năng lượng phân mảnh ion là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của
các hợp chất. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân tử và
là cơ sở để nhận dạng, định danh, định tính và định lượng chất phân tích [15].
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ
Sơ đồ cấu tạo của HPLC – MS như trong Hình 1.2.

Áp suất giảm (10-5 – 10-6)
Bộ phận
nạp mẫu

Nguồn
ion hóa

Bộ phân
tích khối

Detector

Ghi/ xử
lý số liệu

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký lỏng khối phổ
Trong số các kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu
năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa
kiểu phun điện (ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao, giới hạn phát
hiện có thể đến 10-14 g nên thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch
sinh học [16-18].
1.2.2.1. Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết
bị khối phổ. Tùy thuộc vào trạng thái vật lý của mẫu phân tích mà có thể nạp
mẫu trực tiếp hoặc nạp mẫu gián tiếp thông qua các thiết bị phân tích kết hợp
ghép nối như GC, HPLC hoặc CE. Căn cứ vào thiết bị phân tích ghép nối, mà

luan van, khoa luan 25 of 66.