Báo cáo bài tập lớn dược liệu bình vôi (stephania)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN HỮU CƠ

BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN

DƯỢC LIỆU: BÌNH VƠI (Stephania)
GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh
Lớp: HC17HD
Nhóm 3


NỘI DUNG
I.

SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VƠI...............................................................................6
1. Phân loại khoa học.....................................................................................................6
2. Đặc điểm thực vật......................................................................................................7
2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers............................................................................7
2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang..........................................................7
2.3. Stephania pierrei Diels..........................................................................................8
2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong.........................................................8
2.5. Stephania cambodiana Gagnep.............................................................................8
2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu................................................................................8
2.7. Stephania excentrica H. S. Lo...............................................................................9
2.8. Stephania cepharantha Hay..................................................................................9
2.9. Stephania sinica Diels...........................................................................................9
2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang.......................................................9
3. Phân bố, trồng hái và chế biến..................................................................................9

II.

THÀNH PHẦN HĨA HỌC...................................................................................10

1. Rotundin................................................................................................................... 10
1.1. Cơng thức phân tử: C21H25NO4............................................................................10
1.2. Cơng thức cấu tạo:...............................................................................................10
1.3. Tính chất vật lý....................................................................................................11
1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học.................................................11
2. Roemerin..................................................................................................................12
2


2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2............................................................................12
2.2. Công thức cấu tạo................................................................................................12
2.3. Tác dụng.............................................................................................................. 12
3. Cepharanthin...........................................................................................................12
3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6...........................................................................12
3.2. Công thức cấu tạo:...............................................................................................13
3.3. Tác dụng.............................................................................................................. 13
III.

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VƠI..................13

1. Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid........................................13
1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân
cực. 13
1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid
hoặc cồn (ethanol, methanol )....................................................................................15
1.3.

Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết........................................16

2. Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vơi.................................................18
IV.

CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VƠI................................21

1. Chiết bằng dung mơi hữu cơ trong mơi trường kiềm........................................21
2. Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp.....................................22

V.

2.1.

Chiết xuất Routundin thơ.................................................................................22

2.2.

Quy trình tinh chế routundin thơ......................................................................23

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH:............................................................................23
1. Định tính bằng thuốc thử.....................................................................................23
2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng.............................................................................24

3


VI.

ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN................................................................................24

1. Định lượng bằng phương pháp cân:....................................................................24
1.1.

Nguyên tắc chung.............................................................................................24

1.2.

Các bước tiến hành:..........................................................................................25

2. Định lượng alkaloid bằng phương pháp acid- base............................................26
2.1.

Nguyên tắc chung.............................................................................................26

2.2.

Các bước tiến hành...........................................................................................27

3. Phương pháp đo quang:.......................................................................................29
4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.................................................30
VII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
ROEMERINE..................................................................................................................31
1. Nguyên liệu............................................................................................................31
2. Kiểm tra độ nhạy..................................................................................................31
3. Kết quả..................................................................................................................31
VIII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN...33
IX.

Ứng dụng...............................................................................................................34

X.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:.....................................................................................35

4


MỤC LỤC HÌNH
Hình 1. Cây bình vơi...........................................................................................................6
Hình 2. Củ bình vơi khơ......................................................................................................9
Hình 3. Cơng thức cấu tạo của Rotundin..........................................................................11
Hình 4. Cơng thức cấu tạo của Roemerin.........................................................................12
Hình 5. Cơng thức cấu tạo của Cepharanthin....................................................................13
Hình 6. Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung mơi hữu cơ khơng phân cực......15
Hình 7. Sơ đồ quy trình chiết L- Tetrahydropalmatin từ củ bình vơi................................21
Hình 8. MIC của roemerine và kháng sinh trong mơi trường ni cấy Mueller-Hinton. . .32
Hình 9. Sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ của roemerine đến sự sinh trưởng của bốn
chủng S. aureus.................................................................................................................32
Hình 10. Trục quay Rotarod..............................................................................................33
Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám của chuột trên trục quay Rotarod....................33
Hình 12. Viên Rotundin 30mg..........................................................................................34

5


I.

SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VƠI

1. Phân loại khoa học

Hình 1. Cây bình vơi
Giới (regnum):

Plantae

(khơng phân hạng):

Angiospermae

(khơng phân hạng)

Eudicots

Bộ (ordo):

Ranunculales

Họ (familia):

Menispermaceae

Chi (genus):

Stephania Lour.

Chi Stephania có khoảng trên 45 lồi. Một số lồi cơng bố ở Việt Nam:
 Stephania glabra (Roxb.) Miers

 Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang
 Stephania pierrei Diels
6


 Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong
 Stephania cambodiana Gagnep
 Stephania dielsiana Y. C. Wu
 Stephania excentrica H. S. Lo
 Stephania cepharantha Hay
 Stephania sinica Diels
 Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang
 Stephania brachuandra Diels
 Stephania kwangsiensis H. S. Lo
2. Đặc điểm thực vật
2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers
Thân leo phát triển từ củ hình trịn, củ thường nằm ở khe đá, vỏ củ có các nốt sần, đơi khi
có những rãnh nhỏ ngang dọc. Nhựa từ thân và lá không mang màu. Lá đơn, mọc so le,
mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá. Tồn thân và lá khơng có lơng. Cuống
lá dài 6 – 25 cm, gốc hơi phình lên và cong. Phiến lá hình tim, ngọn lá thn nhọn, mặt
dưới xanh lợt. Lá có 9 – 11 gân xếp tỏa trịn do cuống lá dính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc
lá.
Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài 3 – 12 cm, mỗi cuống cụm hoa gồm nhiều
tán, mỗi tán lại có nhiều tán cấp II, mỗi cuống tán cấp II mang 4 tán cấp III, kết thúc gồm
3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn. Hoa đực gồm 6 đài rời xếp thành 3 vòng (3 + 3),
kích thước gần như bằng nhau. Đài hình trứng hẹp, chiều dài 1,55 mm. Ba cánh hoa hình
trứng màu xanh khi còn trong nụ và chuyển màu vàng khi hoa nở, gốc cánh hoa đơi khi có
thể tuyến. Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ với 6 bao phấn màu vàng xếp thành vòng tròn, trên
1 trụ do chỉ nhị hàn liền tạo thành cột ngắn 0,5 – 1 mm. Khi hoa nở, các bao phấn mở nắp
ngang ra xung quanh. Hạt phấn nhỏ màu vàng.

Cụm hoa dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa xếp xít vào nhau
thành dạng đầu. Mỗi đầu gồm 20 – 70 bông hoa. Cuống cụm hoa dài 2 – 5 cm. Hoa cái
bất đối xứng. Mỗi hoa có một lá đài hình elip dài 1 mm. Hai cánh hoa gần như trịn,
đường kính 1 – 1,2 mm, 1 đài và 2 cánh hoa xếp lệch về một phía của hoa. Bầu hình
trứng, núm nhụy chia 4 – 5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như khơng có vịi nhụy.
7


Quả hạch hình trứng ngược dài 5 – 6 mm, rộng 4 – 5 mm. Vỏ quả ngoài nhẵn, lúc non
màu xanh, chuyển sang màu vàng rồi đỏ sẫm khi chín. Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu,
vỏ hạch cứng chia nhiều vạng (17 – 20 vạch). Giá nỗn có lỗ thủng ở giữa.
Mùa hoa: tháng 2 – 4.
Mùa quả: tháng 5 – 6.
2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang
Thân leo dài 2 – 3 m, củ tròn, bề mặt vỏ củ có nhiều nốt sần. Tồn cây khơng có lơng, lá
có cuống, phiến lá dạng tam giác, chop lá nhọn, gốc lá thay đổi từ từ đến gần bằng ít khi
hơi lõm nơng và rộng. Gân chính 9 – 10 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ dạng mạng
rõ.
Cụm hoa đực xim tán kép mọc ở nách lá, cuống cụm hoa dạng sợi nhỏ dài 1 – 3,5 cm.
Đỉnh cuống cụm hoa có 6 – 7 cuống tán giả (xim tán) dài 0,6 – 0,8 cm. Gốc mỗi cuống
tán giả có một lá bắc hình mác nhỏ dạng vạch. Mỗi tán lá giả có 5 – 6 xim nhỏ. Mỗi xim
nhỏ có 5 – 6 hoa. Hoa đực nhỏ, cuống ngắn 0,5 mm, có 6 lá đài xếp 2 vịng, 3 lá đài vịng
tronh hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng khoảng 0,5 mm, 3 cánh hoa hình quạt gần trịn,
cong lõm đều, cao khoảng 0,8 – 1 mm, rộng 1 – 1,5 mm, phía trong gốc cánh hoa có 2
tuyến. Nhị đính thành cột ngắn, bao phấn dính liền thành đĩa, nứt ngang.
Cụm hoa cái gần dạng đầu có cuống dạng sợi nhỏ dài 1 – 1,5 cm. Đỉnh cuống cụm hoa có
6 – 7 xim nhỏ. Ở gốc mỗi xim nhỏ có một phiến lá bắc dạng gai nhỏ, mềm. Mỗi xim nhỏ
có 6 hoa. Hoa cái nhỏ, gần như khơng cuống, có một lá đài hình trứng ngược cao 1 – 1,2
mm, rộng 0,5 – 0,7 mm. Hai cánh hoa gần tròn, cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm.
Bầu hình trứng, đường kính 4 – 5 mm, núm nhụy có 5 thùy dạng gai nhỏ mềm ngả ra phía

ngồi.
Chùm quả nhỏ, ít quả. Quả hạch hình trứng ngược, khi chín màu hồng. Vỏ quả trong hình
trứng ngược, dài 5,5 – 6,5 mm, rộng 5,5 mm. Trên lưng có hai hàng vân ngang dạng trụ.
Hai đầu trụ tù tròn, tạo thành 4 hàng vân hạt trên lưng vỏ quả trong. Giá nỗn có lỗ.
Mùa hoa: tháng 3 – 5.
Mùa quả: tháng 6 – 7.
2.3. Stephania pierrei Diels
Ngọn có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các lồi khác. Hoa
đực khơng có cánh hoa.

8


2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong
Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt.
2.5. Stephania cambodiana Gagnep
Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.
2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu
Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng.
2.7. Stephania excentrica H. S. Lo
Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm. Giá nỗn có lỗ lệch một bên.
2.8. Stephania cepharantha Hay
Giá nỗn khơng có lỗ.
2.9. Stephania sinica Diels
Giá nỗn khơng có lỗ
2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang.
Lá có phiến tam giác, cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá.
3. Phân bố, trồng hái và chế biến
Các lồi bình vơi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Thường
gặp ở các vùng núi đá vơi: Tun Quang, Hịa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên,

Phú Thọ, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu… Một số loài thương
chỉ gặp ở vùng núi đất và biển như Stephania pierrei Diels, Stephania brachuandra Diels,
Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong. Riêng loài Stephania pierrei Diels tập trung
chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận.
Hiện nay ta đang thu hái củ bình vơi chủ yếu từ nguồn mọc hoang. Khi thu về đem cạo
sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiết lấy 1tetrahydropalmatin.
Có thể trồng bằng hạt. Thu hái quả chín, sấy lấy hạt đem gieo. Ngồi ươm cây giống bằng
hạt có thể lấy các đoạn thân cây hoặc cắt phần đầu của củ đem trồng.
9


Hình 2. Củ bình vơi khơ
II.

THÀNH PHẦN HĨA HỌC

Trong củ bình vơi có alkaloid. Các lồi cây bình vơi ta đang khai thác có alkaloid chính là
l – tetrahydropalmatin. Hàm lượng alkaloid toàn phần cũng như l – tetrahydropalmatin
(rotundin) thay đổi tùy theo loài và vùng thu hái.
Theo Bùi Thị Hằng, hàm lượng l – tetrahydropalmatin đạt 3,55% ở loài Stephania
brachuandra Diels (thu hái ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài Stephania kwangsiensis H.
S. Lo (thu hái ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong
(thu hái ở Thanh Hóa), 0,62% ở lồi Stephania cambodiana Gagnep (thu hái ở Lâm
Đồng), 0,29% ở loài Stephania cepharantha Hay (thu hái ở Hà Sơn Bình), 0,21% ở lồi
Stephania pierrei Diels (thu hái ở Tây Nguyên).
Theo Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, loài Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái ở
Ninh Bình có 2,96% alkaloid tồn phần và 0,59% l – tetrahydropalmatin; loài Stephania
kuinanensis H. S. Lo et M. Yang thu hái ở Lạng Sơn có 4,41% alkaloid tồn phần và
3,06% l – tetrahydropalmatin.
Năm 1941, Bùi Đình Sang chiết từ củ bình vơi một hỗn hợp alkaloid, trong đó chủ yếu là

l – tetrahydropalmatin gọi à rotundin. Năm 1964, Ngô Văn Thu chiết được một alkaloid
khác từ củ bình vơi gọi tên là alkaloid A. Đến năm 1971, Nuhn và Ngô Văn Thu xác định
alkaloid A là roemerin. Năm 1992, Ngơ Thị Tâm đã chiết được cepharanthin từ lồi
Stephania pierrei mọc ở Nghĩa Bình. Nam 1997 – 1999, Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh
Kỳ đã phân lập được l – tetrahydropalmatin, roemerin, palmatin từ lồi Stephania glabra
mọc ở Ninh Bình và l – tetrahydropalmatin, stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis
mọc ở Lạng sơn; cycleanin từ lồi bình vơi thu hái ở Quảng Ninh. Năm 1999, Nguyễn Thị
Hoài An đã phân lập được 3 alkaloid từ củ bình vơi mọc ở Mộc Châu (Sơn La) là 9,10 –
hydroxy,
2,3
–
dimethoxy
tetrahydro
–
protoberberine,
stepholidin,
tetrahydrocolumbamin.
10


Ngồi alkaloid, trong củ bình vơi cịn có tinh bột, đường và acid hữu cơ.
1. Rotundin
1.1. Công thức phân tử: C21H25NO4.
1.2. Cơng thức cấu tạo:

Hình 3. Cơng thức cấu tạo của Rotundin
Danh
pháp
IUPAC:
(13aS)-2,3,9,10-tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5Hisoquinolino[2,1-b] isoquinoline.

1.3. Tính chất vật lý
Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi không vị.
Không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, chloroform...
Kết tinh trong cồn có điểm chảy: 141 - 144°C.
1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Năm 1941, DS. Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đã
phát hiện ra hỗ hợp alkaloid của củ bình vơi, đặt tên là rotundin – có tác dụng an thần gây
ngủ, hạ huyết áp, điều hịa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn,
đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật;
1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc…)
Theo Ngô Đại Quang (1999) tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta
từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến
11


chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen,
đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có
những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh
lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ
hóa chất.
Phan Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh Dưỡng và Học
viện Quân y đã thử nghiệm routindin liều cao trên chuột (150 mg/kg thể trọng) tương
đương với 7,5 g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung
Quốc – 1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD 50 đường uống.
Điều đó chứng tỏ độ an tồn là cao của chế phẩm. Rotundin ít độc. Khi tiêm vào mạch
máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1 – 2 ngày. Ở
Trung Quốc, ngoài dạng viên 30 mg và 60 mg, rotundin còn ở dạng tiêm là rotundin
sulfat, mỗi ống 2 ml (60 mg) làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều thị loét dạ
dày hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh, hen thắt phế
quảng.

2. Roemerin
2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2.
2.2. Cơng thức cấu tạo

Hình 4. Cơng thức cấu tạo của Roemerin

2.3. Tác dụng

12


Theo Fakhrutdino Sf (1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế. Đối với tim ếch cơ
lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếch
ngừng đập ở thời kỳ tâm trương. Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của
acetylcholine. Đối với hệ thần kinh trung ương, với liều thấp, roemerin có tác dụng an
thần, gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong. Roemerin cịn có tác dụng
giãn mạch, hạ huyết áp. Liều LD50 trên chuột là 0,125 g/kg tương đương với liều độc của
cocain hydroclorid.
3. Cepharanthin
3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6.
3.2. Cơng thức cấu tạo:

Hình 5. Cơng thức cấu tạo của Cepharanthin
3.3. Tác dụng
Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada và
Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng giãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuần
hồn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh
giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc
chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như khơng có thay đổi
khi dùng cepharanthin. Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện.

III.
1.

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VƠI
Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid

Theo bộ môn Công nghiệp Dược (2001), Dựa vào các tính chất chung của alkaloid người
ta đưa ra 2 phương pháp chung để chiết tách alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật, bao
gồm:
13


- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực.
- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn
(ethanol, methanol ).
1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không
phân cực
 Ưu điểm:
Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loại
các tạp đi kèm theo. Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung mơi có khả
năng chiết chọn lọc đối với các alkaloid ở dạng base.
 Nhược điểm:
Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền. Khi sử dụng các dung mơi này để chiết
địi hỏi các thiết bị phức tạp .
Phương pháp này bao gồm các giai đoạn sau:


Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu

Để tăng khả năng chiết ta phải chia nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt

tiếp xúc giữ hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta chia
nhỏ dược liệu quá thì dung mơi sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và ta rất khó thu
được dịch chiết, do đó tùy thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau vừa
để đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dể dàng trong rút dịch chiết.
Kiềm hóa và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm (thường dùng Ca(OH) 2,
NH4OH, Na2CO3…) để chuyển alkaloid trong nguyên liệu sang dạng base.


Giai đoạn 2: Chiết

Sử dụng các dung môi chiết là các dung môi hữu cơ không phân cực (các dung mơi khơng
hịa lẫn với nước).


Giai đoạn 3: Tinh chế

Tinh chế thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid và chuyển dạng base
bằng kiềm và phân chia chúng giữa hai pha dung môi hữu cơ không phân cực và nước để
loại các tạp chất không phải alkaloid.
14


Hình 6. Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực
 Ứng dụng:
Hiện nay hầu hết các alkaloid được sản xuất trong nước cũng như trên thế giới sữ dụng
phương pháp này. Mặt khác phương pháp này khi sử dụng chiết các dược liệu có nhiều
chất nhầy có độ trương nở cao, tránh được sự trương nở quá mức của dược liệu và sự hịa
tan chất nhầy vào dung mơi gây khó khăn cho rút dịch chiết và tinh chế.
1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid
hoặc cồn (ethanol, methanol )

 Ưu điểm:
Dung môi rẻ tiền, dể kiếm.
Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít.
 Nhược điểm:
Dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế do đó mất mát nhiều trong khâu tinh chế
làm cho hiệu suất chiết thấp.
Đối với các vật liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết gặp khó
khăn trong khâu rút chiết.
15


Phương pháp tiến hành bao gồm các giai đoạn sau:
 Chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu thực vật được xay thô, sau đó được làm ẩm cho trương nở bằng nước.
 Tiến hành chiết
Sử dụng dung môi là nước chiết alkaloid dưới dạng muối tự nhiên hoặc muối với acid vô
cơ, hoặc dung môi là cồn ethylic hoặc methylic để chiết alkaloid cả dưới dạng muối và
base.


Tinh chế:

Trong trường hợp chiết bằng nước, alkaloid base được giải phóng từ dịch chiết bằng cách
thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dung mơi hữu cơ khơng hịa tan trong nước. Tiếp
tục tinh chế bằng cách bốc hơi dung môi và kết tinh lại trong dung môi hữu cơ hoặc
chuyển sang dạng kết tinh lại.
Trong trường hợp chiết bằng cồn, dịch chiết cồn được cô đặc , thêm acid và loại các tạp
chất bằng cách chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alkaloid
sang dạng base rồi chiết alkaloid bằng một dung môi hữu cơ. Bốc hơi dung môi hữu cơ
rồi kết tinh alkaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại.

Đối với các alkaloid khó tách có thể sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ hoặc phương
pháp trao đổi ion.
1.3.

Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết
 Thăng hoa

Thăng hoa có thể thực hiện trực tiếp trên dược liệu như tách caffein từ chè hoặc có thể sử
dụng để tách và tinh chế các hợp chất có trong dịch chiết thơ. Các thiết bị hiện đại cho
phép sử dụng áp suất giảm và kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình thăng hoa.
 Cất
Cất phân đoạn thường được sử dụng để tách các hợp phần trong một hỗn hợp các chất dễ
bay hơi. Trong hóa thực vật nó được sử dụng rộng rãi trong phân lập các hợp phần của
tinh dầu. Tuy nhiên khó có thể sử dụng phương pháp này để tách các hợp phần phụ trong
hỗn hợp tinh dầu dưới dạng tinh khiết. Để phân lập tinh dầu và acid hydrocyanic và một
số alcaloid thể lỏng như spartein, nicotin từ thực vật thường sử dụng phương pháp cắt lôi
cuốn hơi nước.
16


 Giải phóng phân đoạn
Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn hợp. Có thể
lấy ví dụ một hỗn hợp muối alcaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa đủ từng
phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng base tự do. Tăng
dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần. Mỗi lần thêm
kiềm vào ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn base.
Có thể dùng phương pháp này để tách các acid hữu cơ có thể hồ tan trong dung mơi
khơng trộn lẫn nước. Nếu ta có một hỗn hợp muối các acid hữu cơ ta có thể giải phóng
phân đoạn các acid đó bằng cách thêm dần các acid vô cơ.
 Kết tinh phân đoạn

Đây là một phương pháp phân lập đã được sử dụng nhiều trước đây và hiện nay vẫn có
giá trị trong việc tách các hỗn hợp khó tách. Phương pháp này sử dụng độ tan khác nhau
của một hợp phần của một hỗn hợp cần tách trong một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi
nhất định. Người ta thường sử dụng các dẫn xuất của các hợp phần cần tách để thay đổi
độ tan của nó (ví dụ muối pirat của các alkaloid, asazon của đường).
 Sắc ký hấp phụ
Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ thuật sắc ký
là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất. Để tẩy màu và làm trong dung dịch
ta sử dụng than hoạt, các tạp chất màu sẽ bị hấp phụ bởi than hoạt và sau khi lọc ta sẽ thu
được một dung dịch không màu.
Tất cả các chất rắn khi được phân chia nhỏ đều có khả năng hấp phụ ít nhiều các chất
khác trên bề mặt của nó và ngược lại tất cả các chất đều có thể bị hấp phụ từ dung dịch ở
các mức độ khác nhau. Hiện tượng hấp phụ chọn lọc là nguyên lý cơ bản của sắc ký. Q
trình cơ bản của sắc ký có thể được mơ tả dựa trên thí nghiệm của Tswett như sau:
Dịch chiết ether dầu hoả (40-60°C) của lá cây tươi được cho qua một cột thuỷ tinh thẳng
đứng trong có chứa bột Calci carbonat. Các sắc tố trong cột bị hấp phụ vào chất nhồi cột
và sẽ tách trong quá trình chảy qua cột. Các sắc tố hấp phụ mạnh hơn như xanthophyl và
clorophyl sẽ tập trung thành các băng màu đặc trưng rõ rệt gần đỉnh cột trong khi các sắc
tố có độ hấp phụ kém hơn như các caroten tập trung ở các băng thấp hơn phía dưới.
Thường việc tách hoàn toàn các thành phần thành các băng rõ rệt không xảy ra ở giai
đoạn hấp phụ đầu tiên mà trong giai đoạn này các băng còn tập trung gần nhau ở phần
đỉnh cột. Tiếp tục triển khai cột bằng dung môi tinh khiết, các chất bị hấp phụ sẽ di
chuyển dần xuống phía dưới và các băng được tách ra xa nhau hơn. Trong nhiều trường
hợp quá trình được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng dung mơi triển khai khác mà các
chất ít bị hấp phụ từ nó hơn. Ví dụ nếu ether dầu hỏa có chứa một ít alcol được cho thẳng
17


qua cột trong thí nghiệm được mơ tả ở trên thì các băng sẽ tách ra xa nhau hơn và sẽ chạy
qua cột nhanh hơn so với khi chỉ dùng ether - dầu hỏa để triển khai. Khi ta cho dung môi

tiếp tục chạy qua cột, băng thấp hơn trong cột sẽ chạy tới đáy và biến mất, sắc tố sẽ thu
được ở dịch chảy ra ở đáy cột. Quá trình này gọi là quá trình giải hấp phụ (elution ), dung
dịch đó được gọi là dung dịch giải hấp phụ (eluate ). Các chất dễ dàng hấp phụ từ các
dung môi không phân cực như ether dầu hỏa, benzen thường dễ dàng giải hấp phụ bằng
các dung môi phân cực như alcol, nước, piridin... Một vài các hợp chất bị hấp phụ ở pH
nhất định sẽ được giải hấp phụ ở một pH khác.
Các chất khác nhau thường được dùng làm chất hấp phụ là: nhôm oxyd, silicagel,
magnesi oxyd, kaolin, calci carbonat, than hoạt và các loại đường.
Sucrose ở dạng bột được Tswett sử dụng để tách các chlorophyl A và B.
Khi ta tiến hành sắc ký các chất không màu, các băng của các chất bị hấp phụ khơng thể
trơng thấy được. Trong một số trường hợp có thể sử dụng đèn tử ngoại để xác định các
vùng phát quang dưới ánh sáng tử ngoại hoặc có thể chia sắc phổ ra nhiều phần nhỏ riêng
biệt và giải hấp phụ hoặc chiết rừng phần nhỏ đó riêng rẽ. Đơi khi người ta thu dịch giải
hấp phụ của tồn bộ cột thành các phần riêng biệt rồi tiến hành phân tích riêng các phần
riêng biệt đó.
Dụng cụ để tiến hành sắc ký hấp phụ rất đơn giản chỉ gồm một cột bảng thủy tinh trong
nhồi chất hấp phụ. Sắc ký hấp phụ thương được sử dụng trong phân lập và tinh chế các
Vitamin, hormon, một số các alcaloid, các glycosid tim, antraquinon...
2.

Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vơi

Theo Ngơ Đại Quang (1999) quy trình chiết tách được tiến hành như sau:
 Chiết tách sản phẩm thô:
Trước hết củ bình vơi được rửa sạch cạo vỏ ngồi rồi xát nhỏ thành miếng với kích thước
thích hợp rồi ngâm ở bể chứa dung dịch chiết xuất gồm nước và các chất đệm vơ cơ ở pH
thích hợp. Các hoạt chất alcaloit sẽ hoà tan và được chiết ra khỏi bã. Quá trình chiết được
thực hiện 2-3 lần rồi bã được ép kiệt. Dịch chiết để lắng, lọc và trung hồ ở ph thích hợp
để thu kết tủa. Kết tủa được lọc, phơi và sấy.
Sản phẩm thô sau khi sấy có hàm lượng rotundin vào khoảng 27- 32%.

 Quá trình tinh chế:

18


Sản phẩm thô sẽ được tinh chế thành dạng dược dụng có hàm lượng rotundin > 98,2%
(theo Dược điển Trung Quốc). Quá trình tinh chế được tiến hành theo 3 giai đoạn như
sau:
 Giai đoạn 1: Sản phẩm thô được nghiền nhỏ, hoà tan trong dung dịch đệm và kết
tinh ở môi trường pH = 5. Trong giai đoạn này phần lớn những sản phẩm phụ và tạp chất
như muối vô cơ, xenluloza, tinh bột được loại bỏ. Tuy nhiên bán sản phẩm (dạng bột) vẫn
có màu sẫm, nhiệt độ nóng chảy chưa ổn định và hàm lượng rotundin chỉ đạt khoảng
80%.
 Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này bán sản phẩm được hồ tan trong một hỗn hợp
dung mơi. Những dung mơi đó hồ tan chủ yếu các alcaloit mà khơng hồ tan được các
muối vơ cơ cũng như các hợp chất hữu cơ mạch dài như xenluloza, tinh bột, đường khử.
Để sản phẩm không bị phân huỷ và biến màu nên ở giai đoạn này chỉ gia nhiệt nhẹ. Dung
dịch được lọc nóng và kết tinh chậm ở nhiệt độ thấp trong thời gian 10-12 giờ. Tinh thể
được lọc và rửa nhiều lần bằng hỗn hợp dung môi nói trên (đã làm lạnh) đến khi nhận
được bán thành phẩm có hàm lượng rotundin tới 90%.
 Giai đoạn 3: Tinh chế và tẩy màu. Bán thành phẩm có hàm lượng rotundin 90%
được hoà tan từ từ trong một hỗn hợp dung môi và được điều chỉnh ở nồng độ thích hợp
nhất. Nếu nồng độ q cao thì q trình kết tinh diễn ra quá nhanh làm thành phẩm không
sạch; nếu nồng độ thấp quá thì lượng hao hụt sẽ lớn, hiệu suất kết tinh thấp. Sau đó chất
tẩy và chất ức chế oxy hoá được cho thêm, đồng thời khuấy đều trong vịng 30-45 phút.
Sau đó để n đế kết tinh. Sản phẩm được tạo ra dưới dạng muối sunfat hoặc nitrat hay
clorua tuỳ theo mục đích điều chế. Tiếp đó là q trình lọc hút chân khơng và kết tinh lại
ở nhiệt độ thấp. Thành phẩm thu được là những tinh thể hình kim, màu trắng ngà. Quá
trình tinh chế lại đã nâng hàm lượng rotundin từ 90% lên 98,2%, hiệu suất tinh chế đạt
88,2%. Đây là giai đoạn rất quan trọng, cần xác định tỷ lệ dung mơi hồ tan thật thích hợp

thì mới thu được thành phẩm có chất lượng tết và hiệu suất tinh chế cao.
Theo Trần Trọng Biên, Nguyễn Quốc Huy, Nguyễn Văn Hân trong tạp chí dược học số
488 tháng 12/2016 trang 26-30
Củ của các lồi có tên chung là bình vơi (Stephania spp.) từ lâu đã được sử dụng làm
nguyên liệu để chiết xuất L-tetrahydropalmatin (C21H25O4N) hay rotundin - một alcaloid
có tác dụng an thần, gây ngủ, giảm đau. Tuy nhiên hàm lượng rotundin trong các lồi bình
vơi rất khác nhau. Trong đó, lồi Stephania brachyandra Diels thu hái ở Sapa được xác
định có hàm lượng rotundin trong củ cao (có thể đạt 3,69 %), thích hợp để chiết xuất
rotundin. Các phương pháp thơng thường để chiết xuất rotundin từ củ bình vôi gồm: chiết
rotundin dạng base bằng dung môi hữu cơ như dầu hỏa, cloroform, ethanol, n-hexan,
dicloromethan…; chiết rotundin dạng muối bằng nước, nước acid… Nhìn chung các
phương pháp trên đều cho sản phẩm rotundin có hàm lượng cao (> 95 %). Tuy nhiên,
nhiều quy trình tiến hành phức tạp, sản phẩm kém ổn định, hiệu suất quy trình thấp hoặc
19


khơng được cơng bố cụ thể. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là cải tiến phương pháp
chiết xuất, tinh chế rotundin từ củ bình vơi cho hiệu suất cao và ổn định.
Phương pháp nghiên cứu:
- Định lượng: Phương pháp HPLC.
- Chiết xuất: Phương pháp ngâm lạnh.
- Tinh chế: sử dụng ethanol 96%, hỗn hợp aceton – nước hoặc ethyl acetat.
- Đánh giá chất lượng sản phẩm: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hàm lượng rotundin, độ
tinh khiết HPLC.
 Kết quả:
Đã khảo sát, so sánh 3 phương pháp tinh chế rotundin từ tủa rotundin thô gồm phương
pháp tẩy màu và kết tinh trong ethanol 96 %, phương pháp kết tủa trong hỗn hợp aceton –
nước và phương pháp sử dụng ethyl acetat, trong đó phương pháp sử dụng ethyl acetat
cho hiệu suất tốt nhất. Trên cơ sở các kết quả đã cơng bố trước đó, nghiên cứu đã cải tiến
giai đoạn tinh chế rotundin sử dụng dung môi ethyl acetat. Kết quả từ 5 kg nguyên liệu

tươi (hàm lượng rotundin 1,02 %) thu được 48,13 g rotundin tinh khiết (hàm lượng 99,42
%). Hiệu suất tồn q trình đạt 93,8 % tính theo hàm lượng rotundin có trong ngun
liệu. Đây là tiền đề cho những nghiên cứu ở quy mô lớn hơn.
Theo PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị, sách Kĩ thuật sản xuất dược phẩm tập I, trang 232-233:
 Chiết xuất L- tetrapalmatin dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ
-

Alcaloid tồn phần: Củ bình vơi phơi khơ tán nhỏ, kiềm hóa với amoniac
10%. Chiết với cloroform. Gạn lấy dịch chiết rồi cô đặc và thêm vào dịch đã
cô H2SO4 10% sẽ có muối sulfat của alcaloid. Lại kiềm hóa sulfat alcaloid
bằng amoniac pH=8 rồi chiết alcaloid base bằng cloroform. Cô chân khơng ta
được alcaloid tồn phần.

-

Tách L - tetrahydropalmatin: Alcaloid ở trên hòa tan vào H2SO4 1%.

-

Thêm Na2CO3 đến pH=6. L tetrahydropalmatin sẽ tủa xuống, lọc lấy tủa.
Nước cái thêm Na2CO3 đến pH=8 sẽ thu được tủa một số các alcaloid khác.

 Chiết xuất L-tetrahydropalmatin từ củ bình vơi dưới dạng muối bằng nước

20


Củ bình vơi tươi được bào thành lát mỏng chiết bang dung dịch acid sulfuric
0,3%. Dịch chiết rút ra để lắng trong. Gạn phần trong. Phần dịch đục được lọc
qua vải. Dịch thu được sau khi gạn, lọc đưoc tủa alcaloid base bằng dung dịch

Ca(OH),. Lọc lấy tủa alcaloid toàn phần. Tủa này được sấy cho khơ. Tủa alcaloid
tồn phần khó thu được bằng phương pháp này có chứa từ 10% đến 30% Ltetrahydropalmatin.
Tủa này được tinh chế bằng cách hồ tan nóng trong cổn cao đơ 90°-96°, tẩy
màu bằng than hoạt. Để kết tinh 24 giờ tại nhiệt độ phịng. Lọc hoặc vẩy lấy tinh
thể. Sấy ở nhiệt đơ 60°C-70°C thu được L-tetrahydropalmatin tinh khiết.

Hình 7. Sơ đồ quy trình chiết L- Tetrahydropalmatin từ củ bình vơi

21


IV.

CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VƠI

1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm
Do alkaloid trong cây bình vơi thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu
cơ, không tan trong nước. Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thu được alkaloid
dạng muối. Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước. Các muối này dễ bị các
chất kiềm vô cơ (NH4OH, NaOH) thậm chí là các muối khác (Na 2CO3, đơi khi cả
NaHCO3) đẩy ra khỏi muối để cho lại alkaloid base ban đầu.
Nền tảng tách chiết alkaloid nói chung nêu trên cho thấy việc sử dụng phương pháp
chiết xuất bằng acid-kiềm kết hợp với việc sử dụng song song việc chuyển qua lại
giữa các dạng phân cực, không phân cực sẽ giúp thu được alkaloid tinh khiết hơn khi
mỗi bước chuyển đổi giữa phân cực a- không phân cực sẽ loại bớt tạp chất bị lẫn trong
alkaloid. Cũng từ nhận xét trên, ta có phương pháp chiết alkaloid trong cây bình vôi
bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm như sau:
Bột dược liệu (2-5 g)

- Kiềm hóa bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ấm)

- Chiết bằng 20 – 30 ml CHCl3 ở nhiệt độ phịng
(hoặc có thể chiết bằng Sohxlet)

Dịch chiết CHCl3

H2SO4 2% (5 ml x 2 lần)
Dịch chiết nước acid

NH4OH đậm đặc  pH 10

Định tính bằng thuốc thử chung
Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Chiết bằng CHCl3 (10 ml x 2 – 3 lần)

Dịch chiết CHCl3

Định tính bằng phương pháp sắc kí

Bốc hơi tới cắn khơ
Cắn alkaloid base

Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu

Ghi chú: Dùng CHCl3 hoặc Dicloromethan (DCM) hoặc ethyl acetate
* Giải thích các bước:
22


Bước 1: alkaloid ở trong dược liệu thường tồn tại dưới 2 dạng: base hoặc muối. Vì thế,

kiềm hố giúp đưa toàn bộ hoạt chất về dưới dạng base. Sau đó dùng dung mơi CHCl 3 để
chiết tồn bộ ra khỏi dược liệu
Bước 2: dùng acid để đưa alkaloid về dạng muối, tan trong phần nước, tách bỏ phần béo
và dầu không cần thiết.
Bước 3: dùng NH4OH đậm đặc đưa alkaloid về base, tan trong dung môi không phân cực
nên loại được muối khoáng ở pha nước.
2.

Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp

2.1.

Chiết xuất Routundin thô

Chiết rotundin thô từ củ tươi: Xát nhỏ củ bình vơi đã gọt bỏ vỏ ngồi hoặc giã nhỏ, gói
vào vải gạc rồi đem ép lấy nước, thêm nước vào bã cho xâm xấp rồi lại ép. Làm như vậy
3 - 4 lần cho tới khi ép hết vị đắng hoặc không cho tủa với thuốc thử Mayer thì thơi. Tập
trung các nước ép lại (nếu cịn bã thì lọc qua bơng trong). Dùng nước vơi trong để kiềm
hố đến pH 9-10, rotundin thơ sẽ tủa xuống; gạn bỏ nước trong ở trên. Lọc lấy tủa, rửa lại
tủa bằng nước máy. Lấy tủa đem hong gió rồi sấy nhẹ đến thật khơ.
2.2.

Quy trình tinh chế routundin thô

Routundin thô này cần được tinh chế lại. Quy trình tinh chế routundin
- Chiết rotundin thơ bằng cồn 90° trong bình Zaixenko hay Soxhlet trong khoảng 2
giờ (cho đến hết phản ứng alkaloid). Acid hoá dịch chiết bằng HC1 đặc tới pH = 4,
để nguội hoặc cho vào tủ lạnh, rotundin hydroclorid tủa xuống, kết tinh lại 1 - 2
lần. Lọc lấy tinh thể, rửa bằng 1 - 2 ml ether. Sấy nhẹ cho khô.
- Trong công nghiệp: ngưịi ta có thể chiết rotundin thơ nhiều lần với dầu hoả nóng

bằng cách ngâm túi vải chứa bột rotundin thơ vào dầu hoả nóng đựng trong bình có
2 vỏ. Dầu hoả được đun nóng bằng hơi nước nóng chạy trong 2 lần vỏ của bình.
Tiếp đó tháo dầu hoả nóng vào một bình khác rồi cho dung dịch acid loãng vào để
tạo muối alkaloid, sau cho kết tinh lại được rotundin tinh khiết (Hiện nay người ta
thường chiết rotundin bằng cồn 90°).
V.

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH:
1. Định tính bằng thuốc thử

- Đối với thuốc thử chung: A. Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích
200 ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac 6 N (TT), để yên 30 phút. Cho
23


vào bình nón 50 ml cloroform (TT), lắc 5 – 10 phút, rồi để yên 1 giờ, lọc. Lấy 30
ml dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 5 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT), lắc 2 –
3 phút, gạn lấy phần dịch chiết acid cho vào 4 ống nghiệm:
 Ống 1: Thêm 2 giọt thuốc thử Mayer (TT), xuất hiện tủa vàng nhạt.
 Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT), xuất hiện tủa đỏ cam.
 Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT), xuất hiện tủa nâu.
 Ống 4: Thêm 2 giọt dung dịch acid picric(TT), xuất hiện tủa vàng.
- Đối với thuốc thử đặc hiệu ta sử dụng: K2Cr2O7, K3Fe(CN)6 NaCl bão hoà.
 Các loại thuốc thử:
- Thuốc thử Mayer: hỗn hợp clorua thủy ngân (1,36g) và KI (5,00g) trong 100ml
H2O
- Thuốc thử Dragendorff: hỗn hợp Bi(NO3)3, tartaric acid và KI
- Thuốc thử Bouchardat: I-/ KI
2.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sử dụng sắc ký bản mỏng TLC có các thơng số như sau:
- Bản mỏng: Silica gel G (sắc ký hấp phụ).
- Dung môi khai triển: Toluen- aceton- ethanol- amoniac (45: 45: 7: 3); CHCl3 –
MeOH (9:1); CH3OH- NH4OH (100:1,5).
- Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu chiết như phần định tính ở trên, rồi cơ cách
thủy dịch chiết đến khơ, cắn cịn lại để nguội, hòa tan trong 1 ml ethanol 90%
(TT).
- Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 1 mg L-tetrahydro-palmatin trong 1 ml ethanol 90%
(TT).
- Thuốc thử Dragendorff
- Cách tiến hành:

24


 Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 ml mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc
ký, lấy bản mỏng ra, để khơ ở nhiệt độ phịng.
 Phun thuốc thử Dragendorff (TT).
 Trên sắc ký đồ của dung dịch thử xuất hiện nhiều vết, trong đó có vết có màu
sắc và giá trị Rf giống vết của L-tetrahydropalmatin trên sắc ký đồ của dung
dịch đối chiếu.
VI.

ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN

Định hướng: Trước tiên ta thực hiện tách chiết alkaloid từ Bình vơi. Sau đó tiến hành định
lượng alkaloid theo phương pháp cân hoặc định lượng alkaloid theo phương pháp acidbase sau đó thực hiện HPLC phân tách Rotundin bằng ethyl acetate
1. Định lượng bằng phương pháp cân:
1.1.

Nguyên tắc chung

Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết
nghĩa là đã loại được hoàn toàn những tạp chất kèm theo. Do đó phương pháp này tương
đốỉ lâu và người ta chỉ sử dụng khi không sử dụng được những phương pháp định lượng
khác.
Phạm vi sử dụng của nó là những alkaloid có tính base rất yếu, vì những alkaloid này
không chuẩn độ được bằng phương pháp acid - base, do hằng số điện ly quá bé sẽ khơng
có bước nhảy trên đường cong chuẩn độ nên khơng quan sát được sự chuyển màu rõ rệt
của chỉ thị. Ví dụ như colchicin trong hạt tỏi độc, alkaloid có nhân purin như cafein trong
lá chè, hạt cà phê... Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp định
lượng những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hoá học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có
phân tử lượng rất khác nhau.
Khi định lượng, người ta phải chiết được alkaloid tinh khiết bằng một dung mơi thích
hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cắn tới khối lượng không đổi rồi đem cân.
Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rấ t thấp thì định lượng bằng phương pháp cân
trực tiếp khó chính xác, do đó có thể tạo ra các dẫn chất có khối lượng phân tử lớn bằng
cách cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa như acid silicovonframic, acid
phosphovonframic, acid picrolonic... Một hệ số được xác định bằng phương pháp thực
nghiệm đối với mỗi alcaloiđ nguyên chất cho phép tính ra hàm lượng alkaloid base trong
dược liệu. Ví dụ: Bertrand đã định lượng cafein, nicotin... bằng cách tạo tủa với acid
silicovonframic. Tủa tạo ra tương ứng với công thức 12WO 3.SiO2.2H2O.X.M.alc; rửa sạch
tủa, sấy khô rồi cân; sau đem nung tủa thành tro chỉ còn lại hỗn hợp WO 3.SiO2 rồi đem
25