Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (perionyx excavatus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ
SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU
NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)

Bình Dương - Tháng 3 năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA
CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ
SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU
NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ
(Perionyx excavatus)

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang Dân

Nam, Nữ: Nữ

tộc: Kinh
Lớp, khoa: Tài Nguyên Môi Trường
Ngành học: Khoa Học Môi Trường
Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng

Năm thứ: 3 /Số năm đào tạo: 4


UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG
NAM

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
1. Thông tin chung:
-

Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình
thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus).

-

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang

-

Lớp: D13MT02 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

-

Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng

2. Mục tiêu đề tài:
Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân.
Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy
phân từ trùn quế.
3. Tính mới và sáng tạo:
Nghiên cứu đi sâu và quan tâm vào vấn đề mới là bổ sung enzyme protease và các
yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ và thời gian nhằm tối ưu quá trình thủy phân trùn quế,
rút ngắn thời gian thủy phân, nâng cao hiệu suất thủy phân trùn để thu được dịch trùn
có hàm lượng đạm cao.
4. Kết quả nghiên cứu:
Để tối ưu quá trình thủy phân trùn quế và thu được dịch thủy phân với hàm lượng
đạm cao, cần thiết phải tiên hành quá trình tự phân trùn quế trong điều kiện bổ sung
enzyme protease. Quá trình nghiên cứu cho thấy với hoạt độ enzyme protease bổ sung
là 2,5UI, ở nhiệt độ 35oC và thời gian thủy phân 8 giờ là tối ưu cho việc bổ sung
enzyme protease để thu nhận dịch thủy phân với tổng lượng đạm hịa tan là 15,4g/lít.


5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng
và khả năng áp dụng của đề tài:
Nghiên cứu đã đưa ra các yếu tố và điều kiện về hàm lượng protease cần thêm
vào, nhiệt độ và thời gian ủ để tối ưu quá trình thu nhận dịch thủy phân trùn quế, rút
ngắn thời gian và tăng hiệu suất thủy phân của trùn quế đồng thời thu được lượng đạm
hòa tan cao trong dịch thủy phân trùn giúp góp phần mang lại giá trị cao hơn cho các
sản phẩm trùn quế đồng thời giúp phát triển nghề ni trùn.

Ngồi ra, dịch trùn có hiệu suất thủy phân cao giúp tăng hiệu quả cho cây trồng,
vật nuôi, giúp phát triển ngành trồng trọt và chăn nuôi khi sử dụng dịch trùn phun lên
cây trồng cũng như làm thức ăn cho thủy sản, gia cầm...
6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ họ
tên tác giả, nhan đề và các yếu tố về xuất bản nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá
của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài
(ký, họ và tên)


Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện
đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Ngày tháng năm
Xác nhận của lãnh đạo khoa

Người hướng dẫn

(ký, họ và tên)

(ký, họ và tên)

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN
CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Ảnh 4x6

Họ và tên: Huỳnh Thị Kim Trang
Sinh ngày: 27 tháng 9 năm 1994
Nơi sinh: Bình Dương
Lớp: D13MT02 Khóa: 2013-2017
Khoa: Tài Ngun Môi Trường

Địa chỉ liên hệ: Phường Phú Thọ, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương
Điện thoại: 0909619944 Email:
II. Q TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang
học):
* Năm thứ 1:
Ngành học: Khoa học Môi trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Kết quả xếp loại học tập: Khá
Sơ lược thành tích:
* Năm thứ 2:
Ngành học: Khoa học Môi trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Kết quả xếp loại học tập: Khá
Sơ lược thành tích:
* Năm thứ 3:
Ngành học: Khoa học Môi trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường


Kết quả xếp loại học tập: Khá
Sơ lược thành tích:
7. Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài:
Ngày tháng năm
Sinh viên chịu trách nhiệm chính

Xác nhận của lãnh đạo khoa
(ký, họ và tên)

thực hiện đề tài
(ký, họ và tên)

STT

Họ và Tên

Lớp

Mã số sinh viên

1

Huỳnh Thị Kim Trang

D13MT02

1324403010107

2

Nguyễn Trường Nam

D13MT02

1324403010152

3

Vũ Thị Linh

D13MT02

1324403010149

4

Lê Thị Ánh Trúc

D13MT02

1324403010111

5

Lê Văn Tài

D13MT02
MỤC LỤC

1324403010168

3.1.
3.2. Kiến nghị........................................................................................................... 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 22


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Hàm lượng amino acid trong bột trùn quế chưa thủy phân


PHỤ LỤC
Bảng 1. Ảnh hưởng của hàm lượng protease đến khả năng thủy phân trùn quế
Thể tích
Hoạt độ protease

L

(UI/100ml dịch trùn)
4

2.5 UI

4

5 UI

4

10 UI

Thể tích thử thật

Hàm lượng đạm

(Vt)

(g/lít)

(Vk)

0 UI

7,5 UI

thử không

4
4

9,90

9,85

9,90

9,85

9,90

9,85

9,90

9,85

9,90

9,85

7,40
7,30
7,20
7,20
7,10
7,10
7,10
7,20
7,00
7,00

6,90
7,00
7,10
7,20
7,00

7,35
7,30
7,40
7,00
7,20
7,20
7,00
7,30
6,90
7,20
6,90
7,00
7,00
7,00
6,90

14,00
14,42
14,42
15,54
15,26
15,26
15,82
14,70

16,38
15,54
16,66
16,10
15,82
15,54
16,38


Bảng 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế
Thể tích thử
Nhiệt độ
Hàm lượng đạm
Thể tích thử thật
L
khơng
(Vt)
(g/lít)
(oC)
(Vk)
7,50
7,40
13,30
9,30
9,40
7,35
7,30
14,20
30
4

7,40
7,50
13,30
7,10
7,10
15,80
9,30
9,40
35
4
7,20
7,30
14,70
7,20
7,30
14,70
7,10
7,10
15,80
40
4
9,30
9,40
7,20
7,10
15,40

45

4

50

4

55

4

9,30

9,40

9,30

9,40

9,30

9,40

7,20
7,40
7,30
7,30
7,50
7,50
7,50
7,50
7,45

7,50

7,15
7,30
7,30
7,40
7,40
7,40
7,50
7,60
7,50
7,50

15,20
14,00
14,40
14,00
13,30
13,30
13,00
12,60
13,10
13,00


Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế
Thời gian
Hàm lượng đạm
Thể tích thử thật
L

thủy phân
Thể tích thử
(Vt)
(g/lít)
(giờ)
khơng (Vk)
7,90
8,10
14,28
10,50
8,40
8,20
12,60
2
4
10,60
8,30
8,25
12,74
8,20
13,72
8,00
10,50
4
4
10,60
8,30
8,00
13,44
8,00

8,15
13,86
8,00
8,10
14,00
10,50
6
4
10,60
7,90
7,90
14,84
7,90
8,05
14,42
7,80
7,90
15,12
10,50
8
4
10,60
7,70
7,80
15,68
7,80
7,75
15,54
7,80
7,60

15,96
10,50
10
4
10,60
7,70
7,80
15,68
7,70
7,75
15,82


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1.

Tổng quan vể tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài

Vai trò của trùn quế đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ngành chăn nuôi, trồng trọt, nuôi cấy vi sinh vật, y
học...
1.1.1.

Các nghiên cứu ngoài nước

Bột trùn quế đã được nhiều nhà khoa học bổ sung vào khẩu phần của gia cầm như là
một nguồn protein chính. Kết quả cho tăng trưởng tương đương hoặc tốt hơn khi khi cho gia
cầm ăn thức ăn truyền thống giàu protein[17,19,20,21].
Harwood (1976), Mekada và cộng sự (1979) cho rằng, gà được cho ăn trùn quế đã cải
thiện mức tiêu tốn thức ăn tốt hơn đối chứng, nghĩa là gà ở lơ thí nghiệm có cùng tăng trọng

với lô đối chứng nhưng lại tiêu thụ ít thức ăn hơn[17,21].
Mekada và cộng sự (1979) dùng 5% bột trùn quế trong khẩu phần ăn của gà và khơng
có sự tăng trọng rõ rệt nhưng có xu hướng giảm tiêu hao thức ăn. Họ cũng thành công trên
những thí nghiệm với gà đẻ trong khẩu phần ăn có bổ sung trùn tươi[19].
Một số thí nghiệm ở India (Kale và cộng sự, 1982) và Philippines (Guerro, 1983) cho
rằng trùn quế Perionyx excavatus sử dụng tốt phân gia súc, tạo ra nguồn nguyên liệu protein
bổ sung vào thức ăn cho gia súc[16,18].
1.1.2.

Các nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, bổ sung trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gà
cho tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển, khả năng thu nhận và hấp thu chất dinh
dưỡng từ thức ăn, tăng tỷ lệ nuôi sống. Từ đó, giúp tăng trọng nhanh, cải thiện hệ số chuyển
hóa thức ăn.
Nguyễn Xuân Trúc (2008), bổ sung 5% trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gà
Lương Phượng; Hoàng Thị Mai và cộng sự (2014), bổ sung 3% trùn quế vào khẩu phần thức
ăn của giống gà ri lai thì trọng lượng tăng và hệ số tiêu tốn thức ăn giảm ở lơ thí nghiệm so
với lơ đối chứng[5,11].
12


Đồng thời, trùn quế đã được nghiên cứu và sản xuất thành các chế phẩm sinh học phục
vụ cho công nghiệp, nuôi cấy vi sinh vật, là loại thức ăn giàu đạm để bổ sung thêm khẩu
phần dinh dưỡng cho các loại tôm cá vừa qua giai đoạn ấu trùng hoặc khôi phục sức khỏe
vật nuôi sau bệnh...
Năm 2008, Phan Thị Bích Trâm và cộng sự đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến
hiệu suất đạm amine của quá trình tự phân giải trùn quế (Perioyx excavatus). Kết quả thí
nghiệm cho thấy, điều kiện tối ưu cho hệ protease trùn quế tự thủy phân ở nhiệt độ 55 oC và
hoạt động tốt trong môi trường nước và pH 10. Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 46,2%

tương ứng với hàm lượng protein trong dung dịch thủy phân đạt 9%, hoạt tính đặc hiệu của
enzym ban đầu là 0,097 UI/mg protein và thời gian thủy phân là 24 giờ[8].
Theo Võ Thị Hạnh và cộng sự (2009), đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các sản
phẩm chiết xuất từ trùn quế và các loại vi sinh vật hữu ích vào trong nông nghiệp như chăn
nuôi, trồng trọt. Kết quả ghi nhận rằng các chế phẩm sử dụng trong chăn nuôi có tác dụng
kích thích sự thèm ăn, tăng trọng nhanh, giảm tiêu hao thức ăn, giảm tỷ lệ chết cũng như
giảm chi phí sản xuất. Các chế phẩm dùng trong trồng trọt dưới dạng phân bón qua lá hoặc
bổ sung qua đất có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với vi sinh vật gây bệnh có trong đất,
phân giải chất hữu cơ, cố định đạm và hòa tan lân. Khi sử dụng các chế phẩm này về lâu dài
sẽ giúp đất sạch bệnh và cải thiện độ màu mỡ của đất[3].
Năm 2009, Nguyễn Thị Xuân Thanh đã sử dụng đạm thủy phân trùn quế để nuôi vi
sinh vật, kết quả cho thấy có thể thay thế đạm pepton hồn tồn bằng đạm thủy phân từ trùn
quế dùng ni cây nấm men Saccharomyces cerevisiae, sự tăng trưởng của nấm tốt hơn khi
nuôi cấy bằng đạm pepton Hà Lan. Đồng thời, giá thành khi nuôi bằng đạm trùn quế thấp
hơn lần so với đạm pepton Hà Lan[6].
Những nghiên cứu của Phạm Thị Quỳnh Trâm và cộng sự (2008), Phan Thị Bích Trâm
và cộng sự (2010) cho thấy, khi bổ sung bột đạm thủy phân vào thức ăn của ấu trùng tôm sú
cho kết quả rất khả quan, kết quả tăng trưởng chiều dài tốt hơn bột đạm trùn quế chưa thủy
phân, tỷ lệ nuôi sống cao hơn và giá thành của sản phẩm giảm[9,10].
Ngồi ra, các sản phẩm từ q trình thủy phân trùn quế còn được sử dụng trong y dược
13


học, phòng và chữa tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, chứng tắc nghẽn mạch mau...
Năm 2009, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới đã chứng minh rằng
enzyme fibrinolytic trong trùn quế có khả năng thủy phân mạnh mẽ, làm đứt các sợi fibrin
gây tắc thành mạch máu gồ ghề, xơ vữa của bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ máu.
Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2007) nghiên cứu một số serine protease có khả năng
thủy phân fibrin từ trùn quế. Từ đó, có thể ứng dụng vào trong điều trị các bệnh liên quan
đến tim mạch như tắc nghẽn mạch máu do fibrin bị đóng cục[7,14].

1.2.

Lí do lựa chọn đề tài

Nhiều nghiên cứu cho thấy hiếm có lồi động vật nào có giá trị hấp dẫn như trùn quế
(Perionyx excavatus). Trùn quế có tỉ trọng nước chiếm khoảng 80 - 85%, chất khô khoảng
15 - 20% trọng lượng cơ thể. Hàm lượng các chất tính trên trọng lượng chất khơ cao nhất là
protein (68 -70%), kế tiếp là đường (12 - 14%), lipid (7 - 8%) và tro (11 - 12%). Do có hàm
lượng protein cao, giàu vitamin, các acid amin và acid béo thiết yếu nên trùn quế được xem
là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản giúp các
loại vật nuôi tăng trưởng nhanh, kháng bệnh, tăng năng suất. Trùn quế được sử dụng trực
tiếp hoặc phối trộn để làm thức ăn cao cấp nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản. Phân trùn quế
là loại phân hữu cơ sinh học, có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại cây
trồng và là nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau sạch, dịch trùn quế còn được sử
dụng rất phổ biến trong trồng trọt như một loại phân bón lá giúp cây trồng phát triển tốt hơn.
Bên cạnh đó, trùn quế còn được làm nguyên liệu trong y dược để sản xuất ra các loại thuốc
hoặc sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm phục vụ đời sống con người. Ngồi ra, trùn
quế cịn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường [1,19]. Hơn nữa, hiện nay nông dân ở nhiều
nơi xây dựng mơ hình chăn ni sạch, khép kín từ ni bị lấy phân ni trùn quế làm thức
ăn cho tôm, kết hợp trồng vườn, vừa cung cấp thức ăn cho gia cầm, thủy sản, vừa bảo vệ
được môi trường do tận dụng lượng chất thải trong chăn ni[23].
Trùn quế thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong mơi trường có nhiều chất hữu
cơ đang phân hủy. Nhiều nghiên cứu cho thấy trùn quế phát triển rất tốt trên phân bị [22]. Do
đó, hiện nay các mơ hình ni trùn phát triển mạnh xung quanh các trại bị sữa. Điển hình có
thể kể đến các địa phương có diện tích ni trùn quế lớn như Hà Nội, Khánh Hòa, Trà Vinh,
14


TP Hồ Chí Minh...
Tuy nhiên việc sử dụng trùn quế tươi gây nhiều khó khăn trong việc bảo quản, q

trình sử dụng và thương mại hóa. Vì vậy, để tiện cho việc bảo quản, dễ dàng sử dụng và
giúp thương mại hóa trùn quế, người ta đã thủy phân trùn quế thành dịch. Dịch trùn quế có
ưu điểm là dễ dàng sử dụng khi phun lên thức ăn vật nuôi, hòa vào nước làm thức ăn cho
thủy sản hay phun lên cây trồng. Tuy nhiên, việc sản xuất dịch trùn hiện nay gặp khó khăn
do thời gian thủy phân trùn quế quá dài và trùn quế chưa được thủy phân hồn tồn, khơng
thu được hết lượng đạm có trong trùn quế. Chính vì những thực tế trên chúng tơi đề xuất đề
tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân
từ trùn quế (Perionyx excavatus)”.
1.3.

Mục tiêu đề tài

Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân.
Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân
từ trùn quế.
1.4.

Vật liệu[2,4]

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong đề tài do phịng thực hành thí nghiệm Sinh Học
thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp.
Đối tượng thử nghiệm là trùn quế đông lạnh được mua từ cơ sở Trùn Quế Củ Chi
huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh.
Mơi trường giữ giống: Glucose 50 g; Pepton 10 g; Cao thịt 3 g; Agar 20 g; Nước cất
vừa đủ 1 lít.
Mơi trường tăng sinh: Glucose 35 g; Pepton 10 g; Nước giá 10% vừa đủ 1 lít.
Mơi trường bán rắn thu nhận protease: ZnSO4 0,0014 g; KH2PO4 0,4 g; DAP 0,8 g;
NaCl 1,44 g; CaCO3 2,4 g; MgSO4 0,2 g; Bắp 200 g; Đậu nành 200g; Nước 60% (w/w).
1.5.
1.5.1.

Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp xác định hoạt độ protease[4]

Hoạt tính protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến: cho 1 ml dung
15


dịch enzyme vào 2,5 ml dung dịch Casein 1% trong đệm Phosphate pH 7,6. Ủ ở 35 oC trong
20 phút. Mẫu đối chứng được làm ngừng phản ứng bằng 5 ml dung dịch TCA 5%. Xác định
hàm lượng Tyrosine trong dịch bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm với thuốc
thử Folin. Một đơn vị hoạt tính (UI) là lượng enzyme protease tối thiểu thủy phân Casein
trong thời gian 1 phút tạo thành Iimol Tyrosine.
1.5.2.

Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận chế phẩm có hoạt tính protease[4]

Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh trên môi trường tăng sinh trong 48 giờ. Cấy
dịch tăng sinh vào môi trường bán rắn sao cho mật độ giống khoảng 1x107 CFU/g canh
trường, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thích hợp, thu nhận canh trường bán
rắn, sấy thơng gió ở nhiệt độ 45 - 50 oC. Khi canh trường khô, xay nhuyễn và bảo quản canh
trường ở dạng bột mịn.
1.5.3.

Phương pháp thủy phân trùn quế[9]

Trùn quế được bổ sung nước theo tỉ lệ 2 : 1. Sau đó, cho vào các erlen và tiến hành
thủy phân ở nhiệt độ 55 oC. Sau các khoảng thời gian xác định, chúng tôi tiến hành lọc, li
tâm, thu dịch thủy phân và sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng đạm tổng
số có trong dịch thủy phân.

1.5.4.
1.5.4.1.

Phương pháp xác định đạm tổng[9]
Ngun tắc

Chất đạm khi đem vơ cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulphate, khi cho tác
dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac[11].
(NHẠSO4 + 2NaOH

Na2SO4 + 2H2O + 2NH3

Lượng ammoniac phóng thích sẽ được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ gọi là máy
Parnas - Warger và được dẫn tới một bình tam giác có chứa một lượng thừa H 2SO4. Từ nay,
cho phép chúng ta xác định được lượng ammoniac phóng ra, có nghĩa là định lượng được
đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH3 + H2SO4
1.5.4.2.

(NH4)2SO4

Hóa chất

H2SO4 đậm đặc (d = 1,84); chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4: CuSO4 n = 9:1, xay nhuyễn;
16


Dung dịch NaOH N/100; Dung dịch H 2SO4 N/100; Dung dịch (COOH)2 N/100, Dung dịch
(COOH)2 N/100, NaOH đậm đặc: cân 40 g NaOH trong nước cất thành 100 ml. Thuốc thử
đỏ Methyl 0,5% trong cồn. Thuốc thử Phenolphtalein 1% trong cồn.

1.5.4.3.

Cách tiến hành

Vơ cơ hóa
Lấy 6 bình Kjeldahl, thực hiện 3 mẫu thử thật và 3 mẫu thử không. Hút chính xác vào
3 bình thử thật, mỗi bình 1 ml nguyên liệu lỏng (hoặc 0,1 g nguyên liệu khô nghiền nát), 3
bình thử thật, mỗi bình 1 ml nước cất. Tiếp theo, cho vào 6 bình Kjeldahl mỗi bình 5 ml
H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác. Đề vào tủ hút chất độc cho đến khi dung dịch
bằng bên trong bình Kjeldahl trong suốt (khoảng 2 - 3 giờ). Để nguội.
Lấy 6 bình Kjeldahl ra, mỗi bình được pha lỗng với nước cất thành 100 ml bình định
mức.
Chưng cất đạm
Đốt bình cầu cho đến khi sơi, rửa máy cất đạm, chúng ta tiến hành cất đạm bằng cách
sau:
Đặt bình hứng có chứa 25 ml dung dịch H 2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ, rồi đặt
vào vòi ống sinh hàn, sao cho đầu nhọn ống sinh hàn chìm trong dung dịch. Hút 10 ml đạm
vơ cơ hóa đã pha loãng trên cho vào phễu của máy cất đạm, mở khóa cho vào bình phản ứng
từ từ cho đến khi hết, tráng phễu 3 lần, mỗi lần một ít nước cất, rồi cũng cho xuống bình
phản ứng, cho 10 ml dung dịch NaOH đậm đặc và cũng cho xuống bình từ từ, tráng một ít
nước cất (mỗi lần cần chừa lại một ít để hệ thống kín). Để máy lơi cuốn trong vịng 3 phút
rồi hạ bình hứng xuống, để thêm 2 phút nữa. Rửa vòi bằng 1 tia nước cất (nước rửa cho vào
bình tam giác). Rồi lấy bình tam giác ra, định phân với dung dịch NaOH chuẩn độ đúng là
x.N/100 cho đến khi có màu vàng cam.
Thực hiện 3 mẫu thử thật, 3 mẫu thử không để lấy trị số trung bình. Phải xác định hệ
số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH N/100 bằng dung dịch (COOH)2 N/100.
1.5.4.4.

Cách tính kết quả

Tính lượng nitơ tổng số có trong 1 lít ngun liệu.
17


Gọi 0 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử khơng).
V

Gọi 1 là thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật).
V

Vậy & =
V

V

là lượng NaOH tương đương với lượng ammoniac phóng thích bởi 10ml

0 V1

dung dịch vơ cơ pha lỗng.
1 mol ammoniac tương đương với 1 mol NaOH.
Do đó, số mol ammoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vơ cơ hóa đã pha lỗng là:
( ÙV.x. ( 1 )ó/1000= àV.x. 10 5 mol
-

100

Số g đạm tổng số có trong 10 ml dịch vơ cơ đã pha lỗng là:
14 . kV.x. 10 5g
-

Số gam đạm tổng có trong 100 ml dung dịch vơ cơ hóa đã pha loãng hay trong 1 ml
nguyên liệu:
(14 . w.x. 10 4 . 1000)/1 = 1,4 . ầV.x (g/lít)
-

1.6.

Đối tượng

Dịch thủy phân trùn quế (Perionyx excavatus) và các yếu tố tác động lên quá trình thu
nhận dịch thủy phân trùn quế như hoạt độ protease, nhiệt độ, thời gian.
1.7.

Phạm vi nghiên cứu

Ảnh hưởng của việc bổ sung protease và các yếu tố nhiệt độ, thời gian lên quá trình
thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế.
1.8.
1.8.1.
1.8.1.1.

Cơ sở lý thuyết
Giới thiệu về trùn quế
Đặc điểm về trùn quế

Tên khoa học: Perionyx excavatus.
Chi: Pheretima.
Họ: Megascocidae.
18

Ngành: Coelenterate.
Trùn quế có hàm lượng dinh dưỡng rất cao, thích hợp làm thức ăn cho gia súc, gia
cầm, thủy cầm và là nguồn phân bón cao cấp cho cây trồng. Theo Nguyễn Văn Bảy (2002),
thành phần dinh dưỡng trong trùn tươi bao gồm: nước (80,18%), protein (0,32%), cát sạn
(0,59%). Trong các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm được sản xuất từ trùn quế thì hàm
lượng đạm chiếm 53,5 đến 65%, glucide chiếm 11 - 17%, hàm lượng khống và lipid khá
cao từ 7 - 32%[1].
Trùn quế có thân hơi dẹt, hai đầu nhọn, con trưởng thành có thể dài 15cm, màu đỏ mận
chín ở lưng, đai sinh dục chiếm 5 đốt từ đốt thứ XIII đến XVII và có hai ổ sinh dục đực nằm
ở gần nhau, trong vùng lõm hình trứng ở đốt thứ XVIII. Đem trùn quế ra ngồi ánh sáng thì
có thể phát dạ quang màu xanh tím (Fluorescence). Trùn quế có thể sống thích hợp trong
điều kiện nhiệt độ từ 20 - 27 oC, là lồi ăn phân, có thể dùng nó để phân giải chất hữu cơ
(Vermicompost) từ chất thải[1].
Trong tự nhiên, trùn quế có thể sử dụng nhiều chất hữu cơ làm thức ăn. Nhưng trong
điều kiện bất lợi, trùn vẫn có thể lấy dinh dưỡng trong đất. Theo Evans và Guild (1948),
nghiên cứu sự ảnh hưởng của thức ăn trên sự đẻ kén của trùn và thấy rằng trùn chỉ ăn thức
ăn có phân động vật sẽ đẻ nhiều kén hơn khi ăn thức ăn chỉ có chất hữu cơ là thực vật[15].
Thức ăn của trùn chủ yếu là các chất hữu cơ khơng có độc tố, có độ pH thích hợp, có
độ muối khống cao và đã được vi sinh vật phân giải như các loại phân gia súc, gia cầm,
chất thải của nhà máy chế biến thực phẩm, các loại phế thải của nông sản, các cành lá mục,
rau củ bỏ.... Tuy nhiên, các loại cây gia vị (rau húng, rau quế...lá các loại cây có tính dầu (lá
chanh, lá cam, lá tràm bơng vàng,.) đều có thể giết chết trùn hoặc làm trùn di cư đến nơi
khác[1].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng, trùn quế chứa hàm lượng dinh dưỡng và acid amin
rất cao (Bảng 1). Trong dân gian, cũng như trong nghiên cứu khoa học, trùn quế có nhiều
giá trị và được ứng dụng vào cuộc sống như y dược học, chăn nuôi, trồng trọt, làm thức ăn
cho tơm. Ngồi ra, nó cịn được sử dụng để làm mỹ phẩm. Điều đó chứng tỏ vai trị to lớn và
quan trọng của trùn quế hiện nay[1,3,9,14].

19


Bảng 1. Hàm lượng amino acid trong bột trùn quế chưa thủy phân
và bột trùn quế tự phân[10].
Amino acid

Bột trùn quế

Bột trùn

thiết yếu

chưa thủy

quế tự

phân (%)
3,24

phân (%)
2,49

Valine

Amino acid
không thiết
yếu

Bột trùn

Bột trùn quế

quế chưa

tự phân

thủy phân

Alanine

(%)
3,31

(%)
1,64

3,12

1,5

Leucine

5,29

3,79

Glycine

Isoleusine

3,14

3,27

Serine

Threonine

2,14

Proline

3,00

2,47

Methionine

2,81
0,98

Aspartic acid

5,82

2,43

Phenylalanine

3,5

1,00
2,34

Glutamic acid

8,39

Lysine

4,92

1,39

Tyrosine

2,23

2,68
0,95

Histidine

1,78

Cystine

0,33

0,51

Tryptophan

1.8.1.2.

1,23

2,48

2,38

0,88

Ứng dụng của trùn quế[6]

Trùn quế rất dễ ni và có tốc độ sinh sản nhanh. Hiện nay nuôi trùn quế đã trở thành
ngành chăn nuôi công nghiệp phục vụ cho trồng trọt, chăn ni, dược phẩm, mỹ phẩm...
Trùn quế có hàm lượng đạm cao nên được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá
cho gia súc, gia cầm và thủy hải sản.
Trùn quế cịn dùng để xử lí chất thải cơng nghiệp, nơng nghiệp góp phần bảo vệ mơi
trường sinh thái. Q trình xử lí chất thải đó đã tạo ra một loại phân hữu cơ vi sinh giàu đạm
thích hợp cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây cảnh và sản xuất rau sạch. Ngày nay
người ta còn sử dụng phân trùn để xử lí ao tơm, cá.
Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn vẫn được dùng trong một số bài thuốc chữa sốt
rét, suy nhược cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não,. Trùn quế còn chứa enzyme có
thủy phân đặc hiệu sợi fibrin với hoạt tính xúc tác rất cao, có triển vọng khai thác để làm
20

thuốc điều trị những căn bệnh đột quỵ, tim mạch. Một số nơi còn sử dụng trùn quế làm thực
phẩm, mỹ phẩm và thuốc tây.
1.8.2.

Giới thiệu về enzyme protease

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH)n trong
phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngồi ra, nhiều
protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin [2].
1.8.2.1.

Đặc điểm của enzyme protease[13]

Các cơng trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một lồi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về
nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,.các nhà khoa học đã
phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid.
Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao
gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm.
Trong 4 protease kể trên, các protease - xerin và protease - thiol có khả năng phân giải
liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngược lại các protease
kim loại, protease acid thường khơng có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin.
Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứa tương đối kỹ về cấu tạo phân
tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng
phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 - 27.000 dalton. Tuy
nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme Pelicillium
cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000).... Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn
hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 - 48.400).
Protease thiol và nhiều protease - acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000

- 40.000 dalton.
1.8.2.2.

Cơ chế xúc tác của enzyme protease[2,13]

Trong trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật, ngoài gốc acid amin đặc trưng cho
21


từng nhóm cịn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về trung tâm
hoạt động của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:
+ Trung tâm hoạt động của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong
một số trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại.
+ Các protease kim loại có trung tâm hoạt động lớn hơn vào khoảng 21A 0 , có thể phân
biệt thành 6 phần dưới trung tâm hoạt động, mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng
với mỗi gốc acid amin trong phân tử cơ chất.
+ Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc trung tâm hoạt động của
các tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và Endothia đã cho thấy phân tử các phân
tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20A0. Khe hở này là phần xúc
tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
+ Đối với các protease không chứa cysteine, trung tâm hoạt động của chúng có tính
mềm dẻo hơn vì cấu trúc khơng gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu
disulphide.
Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các
enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung
như sau:
E + S enzyme - S enzyme - S + P1

enzyme + P2

Trong đó:
E: Enzyme
S: Cơ chất
Enzyme - S: phức chất enzyme - cơ chất
P1, P2: sản phẩm đầu tiên và thứ hai của phản ứng
1.8.2.3.

Ứng dụng của enzyme protease[2,13]

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực
phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp...
22


Trong chế biến nước mắm
Nước mắm là hỗn hợp các acid amin. Các acid amin này được tạo thành do sự thủy
phân của protease, các protease này do các vi sinh vật tổng hợp nên. Hiện nay quy trình sản
xuất nước mắm ngắn ngày đã được hồn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật
(bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của
nước mắm.
rri____ _
_ 1 • -Ơ _ » X I • X . > » •>
Trong công nghiệp chế biến thịt
Enzyme protease như papain, bromelin, fixcin... được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt
hơn. Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt). Tiêm dung dịch enzyme vào thịt
hoặc con vật trước khi giết mổ. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm từ Streptomyces
fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch
đạm từ da, lơng vũ. Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch
truyền đạm y tế) người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm

mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1 - 2% khối lượng protein cần thuỷ phân. Ưu điểm là bảo
tồn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch
thuỷ phân.
Trong công nghiệp sữa
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm
đơng tụ sữa của chúng. Người ta chỉ sử dụng các protease của vi sinh vật có tính chất tương
tự renin hoặc chỉ thay thế 25 - 50% renin. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus,... được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản xuất
bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo
độ xốp và nở tốt hơn.
Trong sản xuất bia
Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ
bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân
protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.
23


Trong công nghiệp da
Các loại enzyme được dùng trong chế biến da động vật như: protease acid, protease
trung tính, protease kiềm của vi khuẩn, protease nấm sợi, papain từ đu đủ, bromelin từ trái
thơm. Enzyme protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của
da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Protease được dùng để làm
mềm, làm sạch và tẩy lơng da, tăng tính đàn hồi, cải thiện điều kiện làm việc, tránh ô nhiễm
môi trường.

Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa
Protease phân hủy chất bẩn dạng protein trên vải, có tác dụng loại bỏ các vết bẩn như
máu, lịng đỏ trứng, thức ăn... và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt.
Trong sản xuất tơ tằm
Q trình làm sạch sợi tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Sợi sau khi kéo

kén thường có 30% xerixin, muốn tách xerixin phải nấu trong dung dịch xà phòng nhưng
một lượng nhỏ xerixin vẫn nằm lại trên lụa và làm giảm độ đàn hồi của lụa. Để tách lượng
xerixin còn lại người ta thường dùng các chế phẩm protease.
Trong sản xuất mỹ phẩm
Hiện nay có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme protease vào mỹ phẩm. Enzyme có
trong mỹ phẩm sẽ giúp tẩy các tế bào chết và mang lại hiệu quả làm đẹp cho làn da.
Trong y học
Protease được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein
dùng trong ni cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác.
Dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc vì
protease sẽ tiêu hủy các protein đệm mà không gây ảnh hưởng đến các chất kháng độc.
Ứng dụng chữa một số bệnh về đường tiêu hoá. Hơn nữa, một số protease có khả năng
24


thủy phân fibrin, từ đó có thể ứng dụng vào trong điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch
như tắc nghẽn mạch máu do fibrin bị đóng cục, tai biến mạch máu não.
PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.1.

Hoạt độ chế phẩm protease nuôi cấy

Canh trường nuôi cấy bán rắn Bacillus subtilis sau thời gian nuôi cấy được sấy khô và
xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả hoạt độ protease
trong bảng 2.
Bảng 2: Hoạt độ trung bình của chế phẩm protease thơ
Hoạt độ protease trung bình
Ngày kiểm tra
(UI/g)
17/11/2015

29,36 ± 1,34

30/12/2015

28,50 ± 2,49

15/01/2016

28,79 ± 1,51

Trước mỗi đợt bổ sung protease vào dịch thủy phân trùn quế, chúng tôi thực hiện kiểm
tra hoạt độ của chế phẩm protease thơ nhằm đảm bảo tính đồng nhất cho toàn bộ nghiên
cứu. Kết quả cho thấy hoạt độ của chế phẩm protease vẫn ổn định trong suốt thời gian
nghiên cứu với điều kiện bảo quản trong bọc kín, ở nhiệt độ phịng. Điều này cũng hồn
tồn phù hợp với nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng (2013)[4] chế phẩm protease thô từ
Bacillus subtilis vẫn giữ được hoạt độ ổn định khi bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian
6 tháng.
2.2.

Ảnh hưởng của hoạt độ protease đến khả năng thủy phân trùn quế

Bổ sung enzyme protease vào môi trường thủy phân trùn quế với các hoạt độ khác
nhau: 2,5; 5; 7,5 và 10 UI/100ml dịch tự phân. Ủ ở nhiệt độ 40oC, sau 4 giờ, ly tâm thu dịch
và xác định hàm lượng đạm tổng có trong dịch thủy phân. Kết quả trong bảng 3 và hình 1.
Bảng 3. Ảnh hưởng của hoạt độ protease đến khả năng thủy phân trùn quế
Hàm lượng N tổng số
trung bình (g/lít)
14,28 ± 0,20

Hoạt độ protease
(UI/100ml dịch trùn)
0 UI
25