Xác định đột biến gen HBB gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

•KT

4» HỄ?


LỜI CÁM ƠN

Với tằl ca tâm lõng trân trọng, em xin bây to lòng biểl ơn sàu sắc tới
GS.TS 'l ạ Thành Vản. Giám đốc Trung tâm Nghiên cúu Gen- Protein
Trường Đại học Y Hà Nội; PGS.TS.BS Trần vân Khánh. Phó Giám dốc

Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Dại học Y Hồ Nội. Trương Bộ
món B^nh học phân tử. Trường Dai llọc Y llà Nội dà tạo diều kiện cho cm

được thực hiện khóa luận tại trung làm dồng thời cùng lả người hướng dần.

tận tính chi bao và giúp dừ em. luôn dưa ra nhùmg lời khuyên hửu ích cùng
như những lời góp ý lâm huyết dê em hồn thành lổt bải khóa ln nãy. Em

xin bày to lòng biot ơn sâu sác tời TS. Phạm Lê Anh Tuấn, TS. Nguyên
Hoàng Việt, nhùng người thầy tộn tinh chia se kỳ thuật và kinh nghiệm hừu

ích trong quá trinh thực hiện thí nghiệm, cúng các anh chị tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein Trưởng Đại học Y Hà NỘI vả ThS. Lê Thị

Phương. Trường Dại học Y Hà NỘI dã tận lính giúp dờ cm dê em hoan chinh
khóa luận.
Em xin chân thành cam ơn Ban Giám Hiệu. Phòng Quân lý Dào tạo Dại

Học. Khoa Kỳ thuật Y học Trường Dại Học Y Hà Nội dà tạo diều kiện cho

em làm khóa luân tốt nghiệp.
Lài cuối cũng em xin gưi lởi cam cm tới gia dính, bạn bé. luôn quan
tâm. dộng viên và giúp dỡ em trong quá trinh học tạp vả nghiên cứu.

Hả NỘI. 14 tháng 5 nơm 2021

Sinh viên

Vương Thị Hái Yen

•W.-

<€

4» HỄ?


CỘNG IIÒA XẢ HỘI CHÚ NGHIa mẹt nam
Dộc lập Tự (lo - Hạnh phúc

CAM ĐOAN

Kinh gửi: Phòng Quân lý (lào tạo Dại hục

Triràmg Dại hục Y Hà

Nội Hội (lồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Tói xin cam đoan đây lã cơng trinh nghiên cứu cua tơi với sự giúp đị

cua thầy cô tại Bộ môn Bệnh học phàn tu và các anh chị tại Trung tàm nghiên
cứu Gcn - Protein Trưởng Đại học Y llà Nội. Tất ca các sỗ liêu nghiên cứu

trong khóa luận náy lá trung thực vả chưa từng dược công bố ớ bát cứ công
trinh nào khác.

Hà NỘI. 14 tháng 5 nảm 2021
Người viết khóa luận

Vng Thị Hãi Yen

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


MỤC LỤC

ĐẶT VÁN ĐỀ___________

1

CH L ƯNG lỉTỔNG QUAN

1.1 Bệnh p- Thalassemia....

••••<

1.1.1 Dinh nghía • •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••'

1.1.2 Dịch tẻ học bệnh p -Thalassemia...................................
1.1.3Dặc diêm lâm sàng và phân loại bệnh P- Thalassemia.

••••••••••a

1.1.4Cơ chế bệnh sinh bệnh P-Thalassemia..........................

1.1.5ĐÍCU trị bệnh P-Thalassemia..........................................

1.2. Sơ lược VC hemoglobin (HB)...............................................
1.2.1 .Vị trí. cấu trúc gen p globin ( HBB)..............................

1.2.2Tương quan giữa dột biên gen HBB va bệnh |ỉ Tlialassemia............ 10
1.3. Các phương pháp phát hiện dột biến gen 1IBB gây bệnh pthaỉassemia

trcn người lánh mang gcn bênh.......................................................................... 11
13.1.Các phương pháp chân đoán sàng lọc............................................... 11
1.3.2.Chân đoản xác dịnh bệnh bảng câc kỳ thuật sinh học phàn từ........11

CIIUONG 2: DÓI TUỢNG VÀ PHUONG PHẤP NGHIÊN cửu.... .... 15

2.1

Đồi tượng nghiên cứu

2.1.1.Tiêu chuàn chọn mẫu

15

2.1.2.Tiêu chuân loại trừ..............

15

2.2 Thời gian vá địa diêm nghiên cửu

15

2.3 Phương pháp nghiên cưu............

15

23.1 Thiết kê nghiên cữu.

15

23.2 Cừ mẫu

15

23.3Sơ đỗ nghicn cứu..................

16

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?

2.4. Dụng cụ. trang thief bị vả hóa chẩt nghiên cứu........................................ 16

2.4.1.Dụng cụ. trang thiết bị vâ hóa chất nghiên cứu Dụng cụ.................. 16
17

2.4.2Quy trinh nghiên cứu....

2.5. Xu lý sổ liệu
2.6.

Đạo đức trong nghiên cứu.........................................................................23

CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN cíflu__ ________________________ 24

3.1. Ket qua trung bính cua một sỗ chi số xét nghiệm cận lâm sang............24

3.2. Kẽt qua hoàn thiện quy trinh phát hiện đột biến trẽn gen HBB bâng
phương pháp giai trinh lự Sanger.....

24

32.1.Kết qua tâch chiết DNA... • ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••

32.2.Kct qua điện di DNA tổng sổ............................................................. 26
3.2.4, Kết qua giái trinh tự 3 exon tren gen HBB..................................... 28

( IIl ClNG 4. BAN l.lẠN
4.1

32

Đánh giá kết qua lách chiết và kiêm tra chắt lượngDNA...................... 32

4.2. Danh giá độ nhạy và độ đặc hiộu cua kỳ thuật PCR với các cộp mơi.... 33
4.3. Dành giá ý nghía cua phương pháp giai trinh tự gen Sangcr so vời phương

pháp Multiplex ARMS- PCR............................................................................. 34
4.4. Đác diêm va chi số cán lâm sàng cua cảc đột biến gen phai hiệndược...35

4.4.1. Dột biền c.79G>A.............................................................................. 35
4.4.2. ĐỘI biến C.52A>T

4.4.3. Đột biển c.l26-129delTCTT

37

4.4.4. Đột biến-28A>G............................................................................... 37
KÉT LUẬN

38

TÀI LIỆU THAM KHÁO

PHỤ LỤC

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC BÁNG

Bang 1.1. Phân loại đột hiến p Thalassemia........................................................ 4
Bang 1.2. cấu trúc globin và thời kỳ xuất hiện llb ư người bính thường......... 8
Bang 1.3. Ti lộ các loạt Hb ờ các giai đoạn phát triển........................................ 8
Bang 2.1. Bang thanh phần phan ứng cua một phán ứng PCR........................ 20

Bang 2.2. Thành phân phan ửng uua PCR giai trinh tự gcn............................ 22
Bang 3.1 Kết qua trung binh cua một so chi số xét nghiệm cận lâm sang..... 24
Bang 3.2. Kct qua đo mật độ quang các màu DNA được tách chiết............... 25
Bang 33. Cãc dột biến trên gen IIBB cùa 15 máu nghiên cứu....................... 28

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DAM! MỤC IIÌNII

Hình 1.1. Cơ che bệnh sinh của fTThalassemia.................................................6

I lỉnh 1.2. Vị trí cũa gen « và |ỉ globin trên NST 16 vả II..................................9
Hình I .3.Cau trúc và quá trình tơng hợp chuải 1$ globin....................................9
llính 1.4.Ngun lý cùa kỳ thuật Multiplex ARMS- PCR............................... 12

Hình I.5.CŨU trúc ddNTP và dNTP.................................................................... 13

Hình 1.6. Phương pháp giai trinh tự gen Sanger báng máy tự động............... 14
Hình 3.1. Minh hợa kết qua đo mặt độ quang học trên máy Nanodrop 2000c
cua mau DNA sau khi tach chict

.... ..«.5

I lỉnh 3.2.1 lính ảnh kct quả điện di DNA tông số với thang marker............... 26
lỉinh 3.3. Kct quả điện di san phẩm PCR exon I và 2 (cộp mồi HBB AB)...27

Hình 3.4. Két quả điện di san phim PCR exon 3 ( cập mồi HBB CD).......... 27
Hình 3.5. Bicu do tì lộ xuất hiện dột biến trong 15 màu nghiên cứu............... 29
Hình 3.6. Kct quà giái trinh tự mẫu THAI 1..................................................... 29

Hình 3.7. Kct quã giai trinh lự màu THAI.10...................................................30
Hỉnh 3.8. Kết qua giai trinh tự mẫu đột biến THALI2.................................... 30
llinh 3.9. Kết qua giai trinh lự mẫu THALI3................................................... 31

1 linh 4.1. Mô ta dột biến tạo vị trí cắt nối.......................................................... 36

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


9

DANH MỤC CHỮ’ VIẾT TÃT

PCR

Polvmerase Chain Reaction

Multiplex ARMS PCR

Multiplex Amplification Mutation System

Ml

Microliters

om

Manometers

ml

Mililiters

ng

Nanograms

mg

Miligranis

pg

Picograms

n.

Femto liters

MCH

Mean Corpuscular Hemoglobin

MCA'

Mean Corpuscular Volume

apỏóyrpg

Chuồi alpha Chuồi beta Chuồi della Chuồi

H

zeta

"C bp

Chuôi gamma Chuỗi epsilon Micrograms
Phàn trâm

Dộ c
Basepair
Hb

Hemoglobin

DXA

Deoxyribonucleic add

RXA

Ribonucleic acid

luRXA

Messenger Rbonucleic add

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


1

DẠT
• VÁN ĐÈ

Bệnh Thalassemia thuộc nhóm bệnh rối loan tồng hợp huyết sẩc tố. là

một trong nhùng bệnh di truyền lặn theo quy luậi Mendel phô biến nhất trên

thế giới [I] Bộnh gây ra bởi dột biến gen quy định lóng hợp chuỗi globin dẫn
dến giâm hoặc mất hồn lồn sụ tòng hợp chuỗi náy. tạo nên hất (hường về
huyết sấc lố vá thanh phần các loại huyết sắc tổ. dàn tời hiện tượng vị hồng

cầu và gây ra tính trạng thiêu mau ờ bệnh nhàn [2 J. Bệnh |ỉ- Thalassemia gảy
ra bơi dộl biến gen p globin nam trên nhiễm sác thè (NST) 11. Đột biển trên

gen HBB phan lớn la đột biến điểm [3 j. Cho đen nay đà có hơn 900 đột biến

phát hiện trên gcn p-globin dược cơng bỗ trẽn tồn thề giới, trong đó có
khoảng hơn 200 dột biền đà dược xãc dịnh lã gây bệnh 0- Thalassemia. Theo

Liên Doãn Thalassemia Ọuốc Tố. số người mang gcn bệnh trên thể giới rất
lởn, ước tính khoang 7% (4). Ớ Việt Nam. bệnh p- Thalassemia là nguyên

nhân hãng đầu gây thiều máu. tan máu nộng ờ tre em [5]. Thè bệnh làm sáng
nặng nhất cua bệnh ị5-Thalassemia với kiểu gen bệnh đồng hợp tử, có biếu
hiện bệnh thiêu máu tan máu nặng nê với nhiêu biến chứng trên nhiêu cơ

quan cua cơ thê. Những người bệnh nay cân diều trị truyền mau vã thai sắt

suốt đới và cliàt lượng cuộc sống thấp do các bién chưng cua bệnh. Ngoai ra.
bệnh co thê kết hợp với một bat thường câu trúc hemoglobin VỚI các hình thai
lâm sàng da dạng, phô biến nhát là 0- Thalassemia kết hợp với bênh

hemoglobin E (llbE) [6]. Việc những người mang gcn bênh kểt hôn và sinh

con chinh là nguồn phát tân gen bệnh chu yếu trong cộng dồng. Hiện nay
chưa có phương phảp diều tri bệnh P-Thalassemia triội de, một số hưởng
nghiên cứu mới như liộu phàp gen vả ghép tề bào gốc dà cố nhùng bước dầu
(hành công, tuy nhiên cổc phương pháp nay khá tổn kém vả khỏng phai lúc

nao cùng thực hiện được. Chinh vì vậy. phảt hiện

•W.'


2

nhửng người lãnh mang gcn bệnh đê tư vần liền hịn nhãn, chán đốn
tniỏc sinh nhẩm hạn che những thai nhi bị bệnh là mội biện pháp hữu hiệu

nhằm giam ty lỹ mắc bệnh trong cộng đồng.
Bệnh 0-Thalasscmia được chân đốn dựa vảo phân lích pha hệ. các đặc

diem lâm sàng vả các xót nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di

truyền phân tứ xác định các đột biến tròn gcn P-globin là diều kiện thiết VCU

kháng định the bệnh, thực hiện chẩn đoản trước sinh và lư vấn tiền hôn nhân
VC bộnh. Trong những nâm gần dây, một trong sổ các kỳ ihưật sinh học phân

tư như Multiplex ARMS- PCR đâ góp phẩn tích cực trong việc chân đốn cảc

kiểu dột biền gen giúp cho cịng tác tư vẩn. quan lý nguồn người mang gen vả

phòng bệnh ngày càng tót hơn. Tuy nhiên, phương pháp giai trinh tự Sanger

không chi dược sử dụng dê phát lnộn hầu het các đột biền gcn phơ biến gây
bệnh

halassemia mà cịn được COI la tiêu chuãn vàng trong việc phát hiện

nhiều dột biên nun trẽn gcn HBB. dà và dang trờ thanh công cụ trong chân
đoản thường quy (7). Xuãl phát từ thực IC trôn, chúng tôi thực hiện dẻ lài ”

A*ức định (tụt biên gen HỈỈB gây bênh fl- Thalassemia bằng kỳ thuật giái trinh

tựgen Sanger "với mục ticu:

Phát hiện dột biển trên gen p globin ỡ người mang gen gây hộnh |ỉ

Thalassemia bang phương pháp giãi trinh lự gen Sanger.

•W.' .-Tí Ca:

<€

4* HỄ?


3

ChinmR 1:TÓNG QUAN

1.1

Bộnh 0 Thalassemia

1.1.J

Dinh nghia

Thalassemia là loại bệnh di truyền lận trên nhiêm sắc thê thưởng, độc

trưng bới sự suy giảm hoặc thiếu hụt tồng hợp chuỗi a hoặc |ỉ-globin trong
phân tư Hemoglobin. Bệnh |{-Thalassemia xảy ra do dột biên diêm trên các
locus tạo chuỗi (I lâm giam hoặc mắt chức nâng cua gen mã hóa cho việc tơng

hợp |ỉ globin, dản đến giam hoặc không tông hợp dược chuỗi (ỉ- globin [8 ].
ĩ. 1.2

Dịc h tễ hục bệnh Ịỉ - Th aỉassemỉa
Theo Liên đoản Thalassemia quốc tế (2005). thê giới có từ 80-90 triệu

người mang gcn bệnh, và cứ mồi nãm có tới 60.000 trường hợp mới sinh

mang gen bệnh. Tồn Châu Á có trẽn 60 triệu người mang gcn [{Thalassemia Riêng khu vực Dõng Nam Á trong đó cỏ Việt Nam. ước tính so
người mang gen p-Thalasscmia chiêm tói 50% người mang gen tồn cầu,

khoang 40 triệu người [9| Theo thống kè cua Bộ Y tể nãm 2019. ó nước ta

ưóc tính có khống 12 triệu người đang mang gen bệnh (chiêm khoang 12%
dãn sổ Việt Nam), mỏi nãm có trẽn 8000 tré sinh ra bị bệnh, trong đõ có lum

2000 tre mắc bệnh ỡ inưc độ nặng cân đưực diều tri ca đời và hon 20.000
bệnh nhan dang cằn được diêu tri theo loa* gcn nào bi anh h líưng ma phân
biột thành bệnh u- Thalassemia vả fl- nialasseinia[5] [10].

1.13

Dục (tiêm làm sàng vù phún ỉơựi bịnh ịi- Thalassemia

Cán cứ vào đác dicm lâm sàng, cận lâm sảng và sỗ lượng alcn bị dột
biển, kiêu hình bệnh ({-Thalassemia dược chia thành 3 thể: thê nâng, thé trung

gian vã thê nhẹ.
Bệnh ({- Thalassemia xáy ra do dột biến gcn (ỉ-globin dản dẻn xuất hiện nhùng
kiều gen sau:

•W.-

.?TíCa: <€

4* HỄ?


4

• p° -Thalassemia lá các đột biẻn lảm mầl chức nâng gcn |ỉ-globin nên

khơng tơng họp được chuồi p-globin, ví dụ nlnr: đột biển lam tạo thành bộ ba

két thúc sớm.
• p+ -Thalassemia là các đột biến lãm giam chức nàng gen p-globin nên

giám tống hợp chuồi p-globin ư nhiêu mức độ khác nhau. VI dụ như dột biến ỡ
vùng khơi động [I I] [12].

Bâng I. ỉ. Phân toại iíộf biền Ịf Thalassemia

Kiêu hình Kiều gcn

Lãm sáng

Triệu chửng làm sàng

khơng rộ rang
Nhẹ

pộ/p hoặc p+/p

Hổng càu nho nhược sac
Biểu Inện lâm sàng muộn

Ị°/ p +, 3 +/ p +

Thiều máu nhẹ, trung bỉnh

p°/p+, p+/p. p +/ p p°/ p°. p +/ p

Không phụ thuộc truyền

+. p°/p + pỡ/p°.p+/0+.p&/p+p máu

Trung gian

Độ nặng lâm sang thay

+/ |ỉ hoặc p +/ p

đôi lư nhe đến Iiãng
Biêu hiện lâm sang sớm
Nậng

ỉ°/ p°.p+/p+.p°/0+

Thiêu máu nặng

Phụ thuộc truyền máu
Ngồi ra. cơn có cãc thê p-Thalassemia khác, một trong số dó lã the

phổi hợp P-Thalassemia và Hemoglobin E (HbE). Bệnh hemoglobin E (HbE)
xay ra do đột biến cấu trúc gen mả hỏa sự san xuất chuồi p globin ơ vị tri'

codon 26. thay thì* nucleotide G thành nucleotide A. làm cho acid glutamic bl
thay thể bới lysm. hậu qua lá khiềm khuyết gen chuối p globin cá VC số lượng
vã chất lượng [ 13].

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


5

1.1.4 Cư chế hfiih sinh hfnh /Ỉ-Thalassettỉia

Cơ chế thiểu máu trong |l-Thalassemia gốm 3 ngun nhân chính: sinh
hịng cầu khơng hiệu lục. tan mau va klìơng tịng hợp được đu huyết sác tồ.

Tôn thương gen p-globin làm giâm hoặc mất tồng hợp chuồi p-globin. bên

cạnh đỏ. sự làng hoạt động trơ lại cũa gen y-globin vả làng hoạt dộng gen ồ-

globin (ớ tre sau khi ra đời). Các chuồi náy khi kết hợp với chuôi (ỉ-globin tạo
HbF

HbA'

Khá nâng vận chuycn oxy cua cảc I Ib bất thưởng rất

kẽm dần đến thiếu oxy tại tô chức [3Ị [S| [13Ị. Bẽn cạnh đó, giâm tổng hợp
chuồi «-globin sỗ làm thừa chuỗi p-globin vã ngược lại. Các chuỗi globin

thừa lổng đọng trên màng hồng cầu làm lòn thưumg và gày vờ hồng cầu.Viộc

giam (ơng hợp chuồi [i-globin khiến cho chuồi u-globin tự nó khơng thê tạo

thành một phân tư huyết sắc tố hỗn chinh, do đó nó bị kết tua tụo thánh thê
VÙI trong các tể bao tiên thân dõng hống cầu trong giai đoạn lòng hợp huyết

sắc tổ. Những thè vùi lơn lãm phá huy nguyên hổng cầu. gây ra sinh hống càu
không hiệu lực trong lất ca các the p-Thalassemia (14]. Trong p-Thalassemia

the nạng, phan lớn các tể bào dâu dòng hồng câu bị phá huy ngay khi còn ơ

trong tuy xương. Chuồi globin tự do kết hợp với protein màng hồng cầu lảm
thay dối cấu trúc và chửc nàng mảng hồng cầu làm hồng cẳu de bị dại thưc

bão bất giử ờ hẻ liên vịng, gây lính trạng tan máu [15].

•W.' .-Tí Ca:

<€

4» HỄ?


6

Hình Ị. I. Cư the bịnh sinh cha Ịỉ-Thaỉassemia
Triệu chửng chính cúa bệnh P-Thalassemia là hội chứng thiều máu và

tan máu mọn tính, do vậy ncu khơng dược truyền máu sớm và định kỹ. bệnh
nhân sè bị biền chửng biến dạng xương do tính trụng tăng sinh tạo máu quá
mức. Bôn cạnh đỏ, do cơ thè tâng hẩp thu sát và việc đưa một lượng lớn s
vào cư thề qua truyền máu đã gày nên tính trạng quá tai sốt ơ bệnh nhàn [ỉThalassemia [16].
Cơ che bệnh sinh bệnh [Ỉ-Thalasscmia dàn den thay đối một sỗ chi số

xét nghiệm công thúc máu cận làm sàng, ngoai nóng độ huyèt sẳc tố llb con
co sự thay dõi vé lượng huyết sác tố trung binh hồng càu (MCII) va thè lích
trung bỉnh hóng cáu (MCV). MCV lá thè tích cua một hóng cầu được lính

trung bính, giúp xác định kích thước hổng cầu bính thường hay bất thường (to

hay nhơ), giâ trị MCV cua người trương thánh khoe mạnh từ 80-100 ỂL. MCH

•W.-

<€

4* HỄ?


7

la lượng huyết sac tố tmng bính chứa đựng trong một hồng cẩu, giá tri MCH
cua người trường thành khoe mạnh lu 28-32 pg. Dựa vào đặc điểm huyết học.
các chi so thè lích trung bỉnh hống càu (MCV). huyêt sắc tồ trung bính hồng

cầu (MCH). sức ben thâm thấu hồng cầu. và tàng HbA; được sư dụng đẽ sang
lọc 0-Thalassemia [17].
1.1.5

Diều trị bịnh ịi- Tha Iasi einia
lliẻn nay chưa có phương pháp điều trị triệt đè bệnh [ỉ-Thalassemia.

Tùy thuộc vảo the bệnh vả mức độ bệnh, bác si’ sê có nhìmg hưởng diều tri

triệu chửng chính như tiến hành truyền máu cho các thè bệnh Thalassemia

phụ thuộc truyền máu. Ngồi ra. có thê tiến hành điều tq thai sắt và cẳt lách

cho bênh nhàn Phương pháp ghép tê báo gốc tạo máu dong loài cùng dà dược

áp dụng đoi với Thalassemia mức độ nậng. Phương pháp (ìen trị liệu vẫn
dang được tiếp tục nghiên cữu [18J.
1.2.

Sư lưực về Hemoglobin (Hb)

Hemoglobin (Hb) hay cơn gọi là huyết sấc tó là một protein phức

hợp. dam nhiêm nhiều chức nâng sinh học quan tr«?ng như vận chuyên oxy
tứ phối đến tồ chức và mang cacbon dioxit tứ tò chửc về phổi dế thai ra

ngoải. Hemoglobin được cấu tạo gồm hai phẩn là hem vả globin. Một phân
tư hemoglobin gồm 4 dưới dơn vị. mỏi dưới đơn vị lả một chuồi globin kết

hợp với một nhàn hem. Mỏi phân ũr hem cỏ chứa một phân lư Fe:*. Globin

là thành phẩn protein cua phân lư hemoglobin, bao gồm 4 bậc câu trúc,

quyết dinh dặc tính và loại hemoglobin. Có các globm thuộc I1Ọ u là (I, ồ,
mỏi globin nay gốm có 141 acid amin; các globin thuộc họ khơng (1 la |ỉ. Ỵ,

ó. u mỗi globin này gồm có 146 acid amin. Ngoai ra còn co phan lư 2.3-

DPG được tạo ra trong quá ưinh thối hịa glucose, lãm giam ái lực cua Hb
với Ọj (3) [17] [19). Trong quà trinh phát triẽn cả thê. các loại llb thuộc hộ «
vã khơng u cơ mật ơ người bính thường túy theo timg giai doạn.

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


8
,
tẬ
X f • * fit
Bang 1.2. Cân trúc globin vi thin kỳ xuat Ilifii lib ở người hình thưởng

Loại Hemoglobin

Cẩu trúc chuỗi Thời kỳ xuãt hiện
globin

Hb Gower I

Phôi thai 2-3 tuân, tồn tại 1-2 tháng dâu

• •

cua thai

Hb Gower II

Uh• *

Phôi thai 2-3 tuân, lỏn tại 1-2 tháng dâu

cua thai

Hb Portland

Phối thai 2-3 luân

&2Y2

HbF

• •

Thai nhi 5 luân, la Hb chu yêu Ư thai nhi

HbAl

“202

Thai nhi 6 tuân, là Hb chu yểu ờ người

binh thường
HbA2

Thai nhi lủc gàn sinh. Hb ờ người binh

0h&
* *

thường
Như vậy. sau khi sinh. CƯ thè người bính thường chi cịn 3 loại

hemoglobin là HbAI. HbA2 va HbF. Dưới đây lu ti lệ các loại Hb (%) Ư một
Số giai đoạn cua cá thê người binh thường

Bang 1.3. Ti lị các loại Hb ớ các giai đoạn phút trièn

Giai doạn

HbAi(%)

HbAi(%)

HbF(%)

So sinh

20-40

0,03-0.6

60-SO

6 tháng tuôi

93-97

2,0-3,0

1.0-5.0

Từ 1 luôi tro lẽn

97

2,0-3.0

0.4-2,0

Cảc globin hụ (I và không u dược quy định bưi câc hụ gen tương ửng
VÓI tên gọi. Họ gen globin u nâm liên cánh ngấn nhiễm sắc thê (NST) 16 gồm

3 gcn chức nâng ổ. «2 và U; ( theo thử lự chiều lừ 5' den 3’ dọc theo chiêu

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


9

NST); hự gen globin khơng a, một trong sổ đó bao gồm gen p-globin. năm

trên nhiễm sắc thê (NST) 11.

e
mill

Gy

Aỵ

5

p

Z///Z

NSTỉl

NST16

Hình 1.2. 17 trícúu gen a và Ịi Ịịlnbin trên .\ST 16 và 11

Hb (hemoglobin) la thánh phân hoạt động chúc năng cua hông câu. khi

huyết sấc tố ( llb) không đạt nống đơ cần thict trong máu thí bị coi là thiếu
máu. Nồng độ lỉb ớ nam là I30-160g'l. ơ nữ là I25-I45g'l [3] [8] [171. Tàng

HbA; trong nhừng trường hợp mang gen dột biền gây bệnh p-Thalassemia lả
do tàng mạnh ổ-globin sán sinh lừ gen ổ bên canh gen p bị đột biền p.

Thalassemia, và từ gcn ổ cúa nhiêm sắc thê đoi diện cịn bình thưởng. Tâng

HbA? cịn do sự phối hợp cua mạch globin s với mạch globin a. thay thế cho

mạch globin [I thiêu.

1.2.1.

Vị trí, cán trúc gen Ịi RỈnbin (HBB1

Gen HBB là gen mã hóa cho chuỗi 0 globin nằm trên nhánh ngắn cua
NST sò 11.0 vị trí I Ipl5.5. mói NST chứa một gen p globin. Gcn dài 1600

cập base, mà hóa cho 146 acid amm. gồm 3 cxon và 2 intron xen kè (20).

Hình 1.3. cắn trúc vù lỊttu trình tthiịỊ hợp chuơi Ịỉ Ịỉlobin Ịij

•KT


10

1.2.2

Tương quan giữa dột biển gen IIRR và bệnh Ịỉ Thalassemia

Hiện nay đà phát hiện trên 200 đột biến |t-Thalassemia, phân bố các
loại đột biển khác nhau tùy từng khu vực. quốc gia vả dàn tộc. Trong đõ có
khoang 150 lã đột biền diêm, còn lại là mất đoạn ngắn va một sô loại hiềm

gap khác. Phẩn lớn các đột biền đà dược mị ta. nhưng trong đó có chi khoang
20 dột biến hay gặp. chiếm 80% câc dột biến trên gcn p Thalassemia trẽn the

giới [21]. Dưới đây lả một số dột biển có thê gặp trên gcn |}-globin:
- Dột biền diêm tại vùng khơi dộng (promoter): dột biến thay the

nucleotitde tại vị tríTATA hoặc CACCC dẫn đen giâm lổng hợp chuỗi [T

globin so với bính thưởng.
- Nlng đột biên vị nghi'a (nonsense mutations): sự thay thê nìột

nucleotit trong exon cố thê dàn đến sự tạo thành một trong ba mâ kết thúc
(UAA. ƯAG hoặc UGA) lam cho việc dịch mà kết thúc sớm him so với bình

thường và tạo san phẩm p-globin không vừng ben. b| phá huy ngay trong le
báo.

- Những đột biển diêm xay ra ờ các vi trí láp ráp mARN: Tuỳ thuộc v

phần cua diem nổi cỏn nguyên vẹn hoặc bị biên dõi hoán toàn mà dàn đên
Thalassemia hay

-

0 Thalassemia

- Những dột biền dịch khung xáy ra ở các exon: dột hiển thêm váo hoặc

mất đi một hoặc vài nucleotit. hoặc một đoạn có diìn đến thay đổi khung đọc

mà di truyền làm thay dơi san phâm |Uglobin.
- Ngồi ra. nhùng đột biên tại vị trí tiêp giáp intron* exon với co chê và
mức độ khác nhau cũng tao ra kiêu hình cua bệnh p- Thalassemia. Quá trinh

cắt nhùng đoan intron và nối nhùng đoạn cxon cua gcn |l- globin dơi hoi các
vi trí cho nơi GT tai dau 5' và vi trí nhàn dầu nồi AG tai dâu 3’ cua intron.

Những dột biển lai các diêm nỗi cỏ thê sè giam hoặc loai bo hồn tồn quả

trinh hình thảnh mRNA thơng thường [13] [22].

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


11

('ác phirtmg pháp phát hiện (lột biến gen IIBB gây bệnh ịỉ

1.3.

Thalassemia trẽn người lành mang gen bệnh

1.3.1.

Các phưung pháp chán đoản sàng lọc

Có thê sàng lọc những người lanh có nguy cơ cao mang dột biển gen
HBB bang các chân dốn sau:

- Tiền sư: gia đính cỡ người bi bệnh Thalassemia.
- Triệu chứng làm sảng: vàng da, mệt moi,...
- Xét nghiệm cận lâm sàpg:

4- Tổng phàn tích tề bảo máu ngoại vi: thiéu máu (Hb giâm) hồng cẩu nhô

(MCV < xo ÍL). hồng cẩu nhược sắc (MCH < 27pg) [5] [17].

4- Điện di huyết sắc lố: táng ly lộ huyết sắc tố băt thường: HbF > 2%, HồAị >
4°ó. Trường họp nghi ngớ cỏ đột biển gãy bệnh HbE có I Ibiỉ > 25% [3Ị.
Chân lỉttủn xúc (lịnh bệnh bung các kỹ thuật sình học phàn tư

J.3.2.

CỈLQ xét nghiệm di truyền học phàn tư như Multiplex ARMS PCR. giai

trinh tự gen, ... là những chân đoán xác định nhằm phản tích cảc dột biến gcn
trên cãc gen p globin.
1.3.2.1.

Kỳ thuật Multiplex ARMS

PCR ( Multiplex Amplification

Mutation System!
Multiplex ARMS- PCR được dùng đê sàng lọc sự hiộn diện của nhiều
alen dột biền, dược sứ dụng hiệu qua (rong quá trinh phát hiện dột biến diêm.

Nhùng mồi sư dụng cho phán ứng Multiplex .ARMS

PCR bao gồm mồi

bính thưởng và mồi dột biến. Moi bính thường dặc hiệu cho trinh tự DNA
bính thường, không khucch đụi được trinh tự DNA đột biến và ngược lại

(hình 1.4). Neu mâu có kiêu gcn đơng hợp lư thí chi xt hiện vạch diện di Ư

giếng có moi đõt biền, nêu mẫu có kiêu gen di hợp tư thí ca hai giêng đều
xuất hiện sach diên dj chứng 10 có ca san phàm ờ mồi thường va mồi dột

•W.-

&.IỊK <€

4* HỄ?


12

biên. Trong phan ứng Multiplex ARMS

PCR cịn có cặp mồi nội chn

nhâm khuếch đại vùng gen đích khơng có đột biền đe tranh trường hựp âm

tính gia do các nguyên nhãn như: qua It hoặc qua nhiều khuôn DNA. chat
lượng DNA khơng tịi, khơng có một trong các thanh phần cua phan ứng PCR

hoặc có mặt chất ức chể phân ứng PCR. Kỳ thuật này được sứ dụng đè phát

hiện các đột biến đà bicl. Các nghiên cứu cùa Nguyền Khẩc Hân Hoan (2011)

và Trằn Vân Khánh (2014) dà làm rõ kỳ thuật Multiplex ARMS - PCR phú
hợp dè phát hiện các dột bicn diem, cho phcp phát hiện the bát thường vả kiểu
gen dột biển. Tuy nhiên, các doạn mồi có thê bị thối hóa và tụo ra những sn

phm khụng c hiu [ 18] [23].
Mh4*ôbôrỏ

D"**'*"

vM|

t

------- ã

*

iu

*n

Hnh l.4.Nguyờn lý cua kỷ thuật Multiplex ARMS- PCR

1.3.2.ĩ.

Kỳ thuật giãi trình tự gen Sanger

Giai trinh tự gcn là phương pháp xác đinh vi trí cua 4 loậi nucleotide A
(Adenine), c (Cytosine), G (Guanine), T (Thymine) trong phân tư DNA. Nám
1977, Frederick Sanger củng cộng sự dà phát minh ra phương pháp giai trinh
tự gen bang enzyme với nguyên lý: sừ dung didcoxynuclcotidc tddXTP) là

một phân tư nhân tạo, có cẩu trúc tương lư nhtr phàn tủ deoxynuclcotidc

(dNTP) tuy nhiên ỡ carbon số 3 cùa đường deoxyribose khơng phái lả nhóm

hydroxyl (-OH) má la (-11). đê dừng việc tịng hợp mạch bơ sung do khơng
hình thành dược liên kết photphodieste 124Ị.

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


13

OểdooMynuclcolKltt (
(p> <£>

?"**’

OCH,

OH

A

Deoxynuclootide (<1NTP)

Hình I. f.cấn trủc ddNTP và d.VTP
( Nguồn https:// bto.libretexts.org)

Dựa trên nền tang cua kỳ thuật Sanger cố điên, ngày nay các phông xét
nghiệm thướng su dung phương pháp giai trinh tụ gcn băng máy tự động. Kỹ

thuật Sanger cải lien sử dụng cãc ddNTP có đánh dầu huỳnh quang thay cho
việc đánh dấu phóng xạ như trước đây đà giúp cho việc sẩp xếp trinh tự DNA
trơ nên nhanh chóng vã hiệu quá him. Mỏi loại ddNTP được gủn một mâu cơ
bước sóng phát xụ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giãi trinh tư

trong một phan ứng duy nhất. Hệ thống diện di mao quan dược sứ dụng dè

dọc trinh tự DNA một cách tụ động. Nguyên tác hoạt động cua máy là trong
suốt quá trinh diộn di. khi cỏ một vạch diện di di qua chùm tia laser thi’ vạch
điện di sè phát sáng và dược camera ghi nhận va lưu lại thành một cưởng dộ

dinh sáng (peak) trong biêu đồ. Từ biểu dồ cùa các đinh cưởng độ sáng này,

máy sè so dóng cua các dinh tương ứng với nhau và phân lích thành trinh tự

cua các đoạn DNA (25). Ưu diêm cua phương pháp này lã phan ưng giai trinh
lự gen cỏ thê thực hiện trong một ống nghiệm vả chi cần điện di trên một

hang, từ dó tiết kiệm thịi gian và cơng sức cua người thực hiộn kỳ thuật, ỉlon

nừa, vởi nguyên lý trên, hầu hết các dột biên trên gcn sè được phát hiện, diều
náy dàn den ứng dụng vượt trội cua phương pháp Sanger so với Multiplex
ARMS- PCR lá phat hiện ra những đột biền mới. Tuy nhiên chi phí cao him
so với các kỳ thuật giai trinh tự gcn bâng các phương pháp khác.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


14

liinh 1.6. Phương pháp giãi trinh tựgen Sanger hàng /nãy tự dộng
(Nguồn ì

•KT

4» HỄ?


15

Chương 2: ĐỎI TUỌNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu

2.2

Đối tượng nghiên cứu

Tiến hành nghiên cửu trên mầu mảu ngoại vi cua người được chấn
đốn có nguy cơ mang đột biến gen gây bệnh P- Thalassemia sau khi dà có

kct quá xét nghiệm cận làm sàng (tơng phân tích tế bào mâu ngoại vi, xét
nghiệm sinh hóa. điộn di huyết sảc tố) ơ Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein

trường Đại hục V Hà NỘI.

2.2. J. Tiêu chuân chọn mâu

Mầu máu ngoại vi cua người tham gia nghiên cứu dụa trẽn nhùng sàng

lục VC tiền sử gia đinh ( cô họ hàng mắc bệnh Thalassemia), yếu lổ dịch te
(dân tộc Kinh vả các dân tộc thiểu số miền Bắc Việt Nam có nguy cơ mang
dột biến gcn cao) cỏ thê có triệu chửng thiếu máu làm sàng, dược chân doán

lã thiểu máu nhirực sắc. hong cầu nhỏ ( llb giam. MCH < 27pg. MCV<80 fL)
và có nống dộ IỉbAj > 4%).

2.2.2. Tiêu chốn loụi trừ
- Mau bt hu hong trong q trính luu trử. bao quan.
- Đôi tưọng không dõng ý tham gia nghiên cữu.

2.3

Thài gian và dịa diêm nghiên cứu

* Thời gian nghiên cưu: Tháng 11 năm 2020 dến tháng 5 nãm2021
- Dịa diêm nghiên cứu: Trung tám nghiên cửu Gcn - Protein Trường Dai

Học Y Hà Nội
2.4 Phương pháp nghỉcn cứu
2.3.1 Thiết kể nghiên cửu
Phương pháp mô ta cắt ngang

2.3.2 Cữ mầu
Cờ màu thuận tiên 15 mau máu ngoại vi

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


16

2. AS Sư (hl nghiên cửu

• Bước I: Thu thập mầu máu ngoại VI cua đối tượng nghicn cưu.
- Bước 2: Tách chiết DNA tứ máu ngoại vi.

+ Tách DNA bang kit The Wizards Genomic DNA Purification cua hàng
Promega.

4- Đo nồng độ và kiêm tra độ tinh sạch cua DNA băng phương pháp do
mật độ quang.

- Bước 3: Thực hiện kỳ thuật PCR khuếch đại 3 cxon cũa gcn HBB.

4- Khuếch dai các vùng gen với mồi đặc hiệu.

+ Kiềm tra san phẩm being kỳ thuật điện di trên gel agarose.
- Bước 4: Giải trình tự 3 exon cua gcn HBB
- Bước 5: Đọc và phân tích két qua bâng phàn niềm CLC Main

Workbench.

2.4.

Đụng cụ. trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị và húa chắt nghiên cừu Dụng cụ

• Pipct bán tự động và dầu cịn các loại 1000 gL. 200gL. lOOpL. 20pL,
lOpL, 2,5pL

• Óng F.ppcndorf loại 1,5 mL vả 0,2 mL
- Cổc dong, bính thúy rinli
- Găng tay. giấy thắm vó trùng, giá đựng

Sinh phẩm, hóa chổi

r ỉỉịa chát tách chief DNA
- Kit tách DNA cua hãng Promcga bao gốm: Cell Lysis Solution.

Nucleic Lysis Solution, dung dịch Protein Prcpcipitation. Isopropanol, ethanol
70%. DNA Rehydration Solution. Proteinase K
> tỉóư chát khuếch cỉựi PCX

•KT


17

- Nước PCR (nước cal được khu ion, không chứa bất cứ thành phần nào

khác như: DNAase. RNAase. enzyme cát giới hạn ...)

- CìoTaqẴ' Hot Start Polynierascm(Promega) :chứa 4 thánh phần dNTP.

Taq Polymerase. MgCL. buffer, loading dye

** Hóa dial (ỉiên dt

• Dung dịch đệm TBE I0X (Tris Borate EDTA I hàng (Promcga) gồm:
Tris base. Boric acid. EĐTA. Khi sư dụng dung dịch dệm TBE được pha

thảnh đệm TBE IX.
- Bột agarose I Promega)
- Ethidium Bromide lOmg/ml
- DNA Gen Ruler 100 bpDNA Ladder

Thief hị
- Mây ly tâm đê bân (Eppcndorf Cent rì fugc 3424R.)
- Mảy PCR Eppendorf vapo.protect (Eppendorí)

• Máy vortex (Eppendorf Mix Mate)
• Mảy Spindown E-centrifuge (Eppendorf)
- Máy lầc nhiệt (Eppcndort' Thcrmonữxer 5437)

• Máy diện di EC 300X1- Power Supply (Thermo)
- Mảy do quang OD Nanodrop 2000c (Thermo)
- Càn điện tử AB2O4 (Mettler Toledo)
- Lị vỉ sóng
- Tú lạnh SANYO

2.4.2

2.4.2.1

Quy trin ft ngh iên l int

Quy Irinh ihu ihập vù báo quan mẫu
Mầu máu lồn phan cứ thè lích khoang 2 ml dược bao quan trong ông

chứa chắt chống dông EDTA. bao quan Ờ4-8;C tồi da hai tháng.

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?