PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH SULFONAMIDE VÀ QUINOLONE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG
THUỐC KHÁNG SINH
SULFONAMIDE VÀ
QUINOLONE TRONG
SỮA BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Giảng viên hướng dẫn:
TS. Nguyễn Kim Diễm Mai
Nhóm: Nevertheless

1


TĨM TẮT
01 Tổng quan
04

Quy trình, Hố
chất và dụng cụ

02

Mục tiêu

05

Nội dung nghiên cứu

03

Phương pháp
nghiên cứu

06

Phạm vi, kế hoạch
nghiên cứu
2


1.1. TỔNG QUAN VỀ
SULFONAMIDE
KHÁI NIỆM
CƠ CHẾ VÀ CÔNG
DỤNG CỦA HỢP
CHẤT
MỘT SỐ THÔNG
TIN THÊM

3


KHÁI NIỆM SULFONAMIDE

Sulfonamide, còn được gọi là
thuốc sulfa, là các dẫn xuất của
sulfanilamide (paminobenzenesulfonamide),

.

Sulfonamide được sử dụng phổ
biến trong việc sản xuất dược
liệu cho cả con người và thú y.

Khung sulfonamide và một số hợp chất phổ biến

4


CƠ CHẾ
Cơ chế hoạt động: dựa trên sự ức chế chuyển
đổi p-aminobenzoic acid, làm gián đoạn quá
trình vi khuẩn sử dụng hợp chất này để tổng
hợp folic acid, purine, và DNA.

5


CÔNG DỤNG CỦA CÁC HỢP CHẤT
Những hợp chất của chúng dùng để điều trị
nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng tai,
viêm phế quản, viêm màng não do vi khuẩn,
nhiễm trùng mắt, viêm phổi carinii, và một số
loại nhiễm trùng khác

6


MỘT SỐ THƠNG TIN THÊM
FDA đã khảo sát tồn quốc

45% mẫu sữa thu thập
được xác định có chứa dư

Báo cáo từ NCTR cho thấy

lượng sulfamethazine.

sulfamethazine được xác

Tiến
hành khảo sát 30 mẫu
 

định là tác nhân gây ung

sữa ở Canada dư lượng

thư.

sulfamethazine

trong

hai

mẫu ở mức 11.40 và 5.24

Ảnh hưởng:
+ Dẫn đến dị ứng hoặc gây
độc cho người tiêu thụ

+ Thúc đẩy sự xuất hiện của
các vi khuẩn kháng kháng
sinh.

.

ppb.

7


1.2. TỔNG QUAN VỀ
QUINOLONE
KHÁI NIỆM

CƠ CHẾ
MỘT SỐ THÔNG TIN
THÊM

8


KHÁI NIỆM

Kháng khuẩn quinolone được
định nghĩa là 1-substitued-1,4dihydro-4-oxo-3pyridinecarboxylic acids và có
vịng ở vị trí số 5,6.

9

CƠ CHẾ

• Quinolones ức chế sự sao chép DNA của vi khuẩn bằng
cách ngăn chặn miền ligase của gyrase DNA vi khuẩn.
• Những enzyme này thường cắt chuỗi xoắn kép của DNA,
đưa một phần khác của sợi qua khoảng trống, sau đó
hàn gắn vết cắt. Nhưng quinolone liên kết với các enzym,
ngăn không cho chúng hàn gắn các vết cắt.

10


MỘT SỐ THÔNG TIN THÊM
FDA yêu cầu thay đổi
nhãn an toàn đối với
một loại kháng sinh
fluoroquinolones để
tăng cường cảnh báo
về nguy cơ tác dụng
phụ đối với sức khỏe

• Ảnh hưởng đến mơi
trường vi sinh của
đất.
• Ơ nhiễm nước thải.
• Ảnh hưởng đến hệ
thực vật và động vật
trong đất.

tâm thần và rối loạn
đường huyết nghiêm
trọng.

11


1.3.1. HPLC DÙNG CHO
ĐỊNH LƯỢNG SULFONAMIDE
Combs và cộng sự dùng HPLC pha đảo, kết
hợp hệ thống ion hoá áp suất khí quyển –
khối phổ (APCI-MS) để xác định hàm lượng
8 loại sulfonamide trong gan gà

Tolika và cộng sự đã áp dụng đầu dò
Diode Array (PDA) cho hệ thống HPLC để
xác định dư lượng 10 sulfonamide trong
sữa

1999

2011

1990
Long và cộng sự dùng sắc ký lỏng pha đảo
với cột ODS-C18 để xác định hàm lượng của
sulfathiazole, sulfadiazine, sulfamethizole,
sulfamethoxazole, sunfisoxazole, và
sulfadimethoxine trong sữa

2000
Naoto Furusawa dùng HPLC với đầu dò
diode quang để xác định dư lượng của
sulfamethizole và sulfadimethoxine trong
sữa

12


1.3.2. HPLC DÙNG CHO
ĐỊNH LƯỢNG QUINOLONE
Yorke và Frox định lượng 6 quinolone khác
nhau trong mẫu gà dùng làm thực phẩm

Evaggelopoulou và Samanidou dùng
HPLC để xác định dư lượng của 7
quinolone khác nhau trong mô cá hồi
Đại Tây Dương

2000

2013

1980
Delepine và cộng sự đã
định lượng được 9
quinolone trong cơ của
loài heo

2001

Okerman, Touraki dùng HPLC kết hợp nhiều
đầu dò khác nhau (UV/Vis, huỳnh quang
hoặc máy sắc ký khí-khối phổ (GC-MS)) để
định lượng được nhiều quinolone hoặc
fluoroquinolone cùng lúc

13


Mục têu

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Tách sulfonamide và
quinolone từ sữa
Cô lập từng sulfonamide và
quinolone bằng HPLC
Định lượng chúng bằng đầu
dò UV và fluorescene
14


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1

2

3

4

Phương pháp lý luận

Phương pháp chuẩn hố

Phương pháp cơ lập

Phương pháp định lượng

15


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
Sulfonamide

Mẫu Sữa
(1g)
Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

pH=4.7

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

AcCN

pH=4.7

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

Lớp trên

AcCN

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

Lớp trên
10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút
n-hexane

AcCN

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa

(1g)

Sulfonamide

Lớp trên
10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới
AcCN

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

Lớp trên
10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới
cơ đặc, sau đó pha lỗng
với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1)

ly tâm 14000 rpm, 10 phút.

AcCN

H2O

Quinolone


4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN
1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Mẫu Sữa
(1g)

Sulfonamide

Quinolone

Lớp trên

Lớp trên

10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới
cô đặc, sau đó pha lỗng
với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1)
ly tâm 14000 rpm, 10 phút

1 mL CCl3CO2H 2.5% (pH = 0.84), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 5000 rpm, 20 phút

Lớp dưới
cơ đặc, sau đó pha lỗng
với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1)
ly tâm 14000 rpm, 10 phút.

AcCN

Lớp trên

Lớp trên
Lọc nylon 0.2

HPLC

Sắc ký đồ


4.2. HỐ CHẤT VÀ DỤNG CỤ
Hố chất
- Mẫu sữa phân tích.
- Các hố chất cho q trình tách chiết và
HPLC: potassium dihydrophosphate, acetonitrile, nhexane, trichloroacetic acid, và nước cất.

- Các hoá chất chuẩn hoá và hiệu chỉnh hệ
thống: sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamethazine,
sulfamethizole,
sulfamethoxypyridazine,
sulfamonomethoxine,
sulfamethoxazole,
sunfasoxazole, sulfadimethoxine, sulfaquinoxaline,
ciprofloxacin,
danofloxacin,
enrofloxacin,
sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid và
flumequine.

Dụng cụ
- Dụng cụ xử lý mẫu: Bình cầu 250 mL; Cốc thủy
tinh 250 mL, 100 mL; Phễu chiết 100 mL; Ống đong
25 mL; Đũa thủy tinh; Cân điện tử 4 số Satorius AG
Germani CPA3235; Máy khuấy từ gia nhiệt Stone
Staffordshire England ST15OSA; Máy ly tâm; Lọc
nylon 2 m.
- Cột sắc ký C18 250 mm x 4.6 mm WatersTM.
- Hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity II LC System
(Phịng Phân tích Trung Tâm, trường Đại học Sư
Phạm TPHCM).


5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Quy trình tách sulfonamide
và quinolone ra khỏi sữa.
- Sử dụng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) để định
lượng sulfonamide và
quinolone trong sữa.

25