BC HÓA SINH ĐỊNH TÍNH VÀ KHẢO SÁT GLUCIDE

TỔNG LIÊN ĐỒN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG
KHOA DƯỢC

🙢✵🙠

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
HĨA SINH
BÀI 3. GLUCIDE
GVHD: TS. Phạm Phước Điền
Sinh viên: Nguyễn Quỳnh Như

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2021


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

BÀI 3. GLUCIDE
I.

PHẢN ỨNG MOLISCH
1. Nguyên tắc
 Các loại glucide đều cho phức màu tím khi phản ứng với dung dịch α-naphthol trong
sulfuric acid đậm đặc
 Có thể dùng phản ứng Molisch để phân loại các nhóm carbohydrate và phân biệt
các nhóm carbohydrate với những chất khác dựa vào cường độ màu của chúng.
2. Thuốc thử
Thuốc thử Molisch là dung dịch naphthol 1% trong ethanol 90%.
3. Cách tiến hành

Chuẩn bị 5 ống nghiệm như bảng sau:
Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

1 ml nước cất

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml hồ tinh

glucose 1%

fructose 1%

sucrose 1%

bột 1%

3 giọt

3 giọt

3 giọt

3 giọt

1 ml

1 ml

1 ml

Dung dịch
Glucide

3 giọt

TT Molisch

Lắc đều
H2SO4 đậm đặc

1 ml

1 ml

4. Hiện tượng và giải thích
4.1. Hiện tượng

1

 Ống 1: Khơng có hiện tượng xảy ra.

4 5
2 3

 Ống 2: Xuất hiện vịng màu tím.
 Ống 3 và 4: Xuất hiện vịng máu tím đỏ.
 Ống 5: Xuất hiện vịng màu tím nhạt màu.

2

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

4.2. Giải thích
 Dưới tác dụng của acid H2SO4 đậm đặc fructose, glucose, sucrose và hồ tinh bột
đều bị khử nước cho ra một aldehyde (furfulral hoặc 5-hydroxyl methyl furfural).
Trong môi trường acid, aldehyde sẽ phản ứng thế nhân điện tử với α-naphthol (trong
thuốc thử Molisch) cho ra phức chất màu tím hoặc tím đỏ.

 Do fructose có cấu trúc vịng 5 cạnh nên trong môi trường acid H2SO4 đậm đặc sẽ
dễ bị khử nước để tạo thành furfulral. Glucose có cấu trúc vịng 6 cạnh nên bền hơn.
Sucrose có liên kết α-1,2 glycoside nối giữa fructose và glucose nên khá bền. Hồ
tinh bột bền nhất vì có nhiều liên kết α-1,4 glycoside và do đó cũng tạo phức có

màu tím nhạt nhất.
II. PHẢN ỨNG FEHLING
1. Nguyên tắc
 Phản ứng Fehling dùng để xác định các đường khử như lactose, maltose, glucose,
fructose, pentose (arabinose, ribose),… Trong môi trường kiềm mạnh, các
monosaccharide ở dạng endiol không bền dễ dàng khử các kim loại nặng như Cu2+,
Ag+, Hg2+. Các nối đôi bị cắt đứt tạo ra những hỗn hợp đường – acid.
 Phản ứng Fehling được ứng dụng trong hóa sinh lâm sàng để kiểm tra nhanh lượng
đường có trong nước tiểu của bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường.

3

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

2. Thuốc thử
Thuốc thử Fehling gồm 2 dung dịch:
 Dung dịch A

 Dung dịch B

CuSO4 kết tinh

35 g

H2SO4 đậm đặc

5 ml

Nước cất

vừa đủ 1000 ml

KOH hoặc NaOH

135 g

Natri kali tartrate

150 g

Nước cất

vừa đủ 1000 ml

3. Cách tiến hành
Chuẩn bị 5 ống nghiệm như bảng sau:
Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Ống 5

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml hồ

glucose 1%

fructose 1%

Dung dịch
TT Fehling
Glucide

lactose 1% sucrose 1% tinh bột 1%

Lắc đều. Đun sôi cách thủy 3 phút
4. Hiện tượng và giải thích
4.1. Hiện tượng

Glucose Fructose Lactose

4

Email:

Sucrose Hồ tinh bột


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

Khi trộn dung dịch Fehling A và B ta thấy dung dịch chuyển sang màu xanh dương đậm.
Khi cho tiếp các dung dịch glucide tương ứng vào mỗi ống nghiệm ta thấy:
 Ống 1, 2, 3: Đều xuất hiện kết tủa đỏ gạch. Cường độ màu: ống 1 > ống 2 > ống 3.
Thời gian tạo tủa: ống 3 > ống 2 và ống 1.
 Ống 4, 5: Khơng xảy ra hiện tượng gì.
4.2. Giải thích
 Thuốc thử Fehling: Khi trộn 2 dung dịch Fehling A và Fehling B với thể tích bằng
nhau, natri kali tartrate sẽ hịa tan tủa Cu(OH)2 do CuSO4 trong mơi trường kiềm
sinh ra, tạo ra phức chất Cu2+ alcolate màu xanh dương đậm. Phức chất này cung
cấp Cu2+ cho phản ứng oxy hóa – khử tiếp theo.

 Ống 1 và 2: Đều xuất hiện tủa đỏ gạch, nhưng tủa ở ống 1 (chứa glucose) đậm màu

hơn so với tủa ở ống 2 (chứa fructose) vì glucose và fructose đều là monosaccharide
có nhóm –OH hemiacetal → có tính khử. Nhưng nhóm –CHO của glucose có tính
khử mạnh hơn nhóm –C=O của fructose.

5

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

↓ tủa đỏ gạch

D-Glucose

D-Gluconic acid

 Ống 3: Có kết tủa đỏ gạch nhưng chậm hơn ống 1,2 là do lactose là disaccharide bị
thủy phân tạo ra β-D-galactose và D-glucose (có nhóm –OH hemiacetal tự do ở C1)
→ có tính khử.

 Ống 4: Khơng tạo tủa đỏ gạch do sucrose (saccharose) khơng có nhóm –OH
hemiacetal để chuyển thành aldehyde → khơng có tính khử. Do đó khơng tác dụng
với thuốc thử Fehling.

 Ống 5: Khơng có hiện tượng do tinh bột là polysaccharide → khơng có tính khử
III. PHẢN ỨNG SELIWANOFF (PHẢN ỨNG ĐẶC TRƯNG CHO CETONE)
1. Ngun tắc

 Khi đun nóng với acid vơ cơ, fructose và những cetohexose khác tạo thành hydroxy
methyl furfural. Các chất này tác dụng với resorcinol cho phức màu đỏ. Các aldose
cũng có thể tạo thành hydroxy methyl furfural khi đun nóng với acid, nhưng phản
ứng xảy ra rất chậm, nên phản ứng Seliwanoff có tính đặc hiệu cho cetose.
 Phản ứng dùng để nhận biết đường aldose và đường cetose.

6

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

2. Thuốc thử
Thuốc thử Seliwanoff:

Resorcinol (resorcin)

0,05 g

HCl pha loãng 1/3

100 ml

3. Cách tiến hành
Chuẩn bị 2 ống nghiệm như bảng sau:
Ống nghiệm

Ống 1

Ống 2

1 ml

1 ml

0,5 ml fructcose 1%

0,5 ml glucose 1%

Dung dịch
TT Saliwanoff
Glucide

Lắc đều. Đun sôi cách thủy 10 phút
4. Hiện tượng và giải thích

Ống 1: Xuất hiện màu đỏ

Ống 2: Khơng xảy ra hiện tượng

Dưới tác dụng của acid HCl đậm đặc và nhiệt độ, các Các aldose cũng có thể tạo thành
cetohexose và cetopentose tạo thành hydroxy methyl hydroxy methyl furfural khi đun

7

Email:

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

furfural và furfural. Các chất này ngưng tụ với resorcinol nóng với acid nhưng phản ứng xảy ra
tạo thành phức chất có màu đỏ.

rất chậm.

Phức màu đỏ

IV. THỦY PHÂN SACCHAROSE
1. Ngun tắc
Saccharose (sucrose) khơng có tính khử, nhưng khi thủy phân saccharose bằng acid sẽ cho
ra D-glucose và D-fructose đều có tính khử.

2. Cách tiến hành
 Tạo dung dịch thủy phân: Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch saccharose 1% và 4
giọt HCN 1N, đun sôi cách thủy 5 phút. Lấy dịch thủy phân đem làm thí nghiệm.
 Chuẩn bị 4 ống nghiệm như bảng sau:
Ống 1

Ống 2

Ống 3

Ống 4

Dịch thủy phân saccharose

0,5 ml

-

0,5 ml

-

Dung dịch saccharose 1%

-

0,5 ml

-

0,5 ml

1 ml

1 ml

-

-

-

-

1 ml

1 ml

TT Fehling
TT Seliwanoff
Đun cách thủy

3 phút

8

Email:

10 phút


Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

3. Hiện tượng và giải thích

1

3

2

4

 Ống 1: Tạo tủa màu đỏ gạch do khi thủy phân saccharose bằng acid HCN 1N cho
ra D-glucose và D-fructose đều có tính khử nên phản ứng với thuốc thử Fehling.
 Ống 2: Không xảy ra hiện tượng với thuốc thử Fehling vì saccharose khơng có
nhóm –OH hemiacetal nên khơng có tính khử.
 Ống 3: Tạo kết tủa màu đỏ do khi thủy phân saccharose bằng acid HCN 1N tạo ra
D-fructose – một cetose, fructose sẽ phản ứng với resorcinol trong thuốc thử
Seliwanoff tạo phức màu đỏ.
 Ống 4: Tạo kết tủa màu đỏ do trong thuốc thử Seliwanoff có chứa 1/3 HCl pha
lỗng nên khi đun sơi cách thủy ống nghiệm trong 10 phút thì saccharose trong ống
nghiệm bị thủy phân cho ra fructose và tạo phản ứng như trong ống nghiệm 3.
V. PHẢN ỨNG MÀU POLYSACCHARIDE
1. Nguyên tắc
Các polysaccharide kết hợp với iod tạo thành các phức chất có màu khác nhau tùy vào độ
dài mạch carbon.
2. Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1%. Thêm vào 1 giọt thuốc thử Lugol.
Quan sát màu xuất hiện. Tiếp theo đun ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát hiện
tượng. Sau đó cho ống nghiệm vào cốc nước để nguội và quan sát hiện tượng.
3. Hiện tượng và giải thích
3.1. Hiện tượng

9

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

1 ml hồ tinh bột 1% + 1 giọt lugol

Thực tập hóa sinh

Đun nóng ống nghiệm

Nhúng ống nghiệm vào
cốc nước lạnh

Khi cho 1 giọt thuốc thử Lugol vào ống nghiệm chứa hồ tinh bột 1% ta thấy xuất hiện dung
dịch đổi sang màu xanh dương tím. Khi đun nóng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, dung
dịch dần mất màu. Khi ngân ống nghiệm vào cốc nước lạnh màu xanh xuất hiện trở lại
3.2. Giải thích
 Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột tồn tại dưới dạng các chuỗi
xoắn; cứ 6 phân tử glucose lập thành 1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm
cho dung dịch có màu. Màu này thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột
(tỉ lệ amylose/amylopectin) và chiều dài của phân tử. Amylose cho màu xanh dương
đậm với iod trong khi amylopectin lại cho màu tím đỏ với iod.
 Khi đun nóng, các vịng xoắn trong phân tử tinh bột duỗi ra, khơng cịn hấp phụ iod
nữa nên dung dịch bị mất màu. Khi làm nguội, các phân tử có xu hướng trở về dạng
chuỗi xoắn làm hồ tinh bột có màu trở lại.
VI. PHẢN ỨNG BENEDICT (PHẢN ỨNG GLUCOSE TRONG NƯỚC TIỂU)
1. Nguyên tắc
 Glucose có nhóm aldehyde sẽ khử Cu2+ thành Cu+ tạo Cu2O (tủa màu đỏ gạch).
 Phản ứng Benedict là phản ứng bán định lượng vì thơng qua phản ứng này người
ta có thể ước chừng được lượng glucose trong nước tiểu.

10

Email:

Nguyễn Quỳnh Như

Thực tập hóa sinh

2. Thuốc thử
Thuốc thử Benedict gồm 2 dung dịch:
 Dung dịch A

 Dung dịch B

Natri citrate

173 g

Natri carbonate (Na2CO3)

200 g

Nước cất đun nóng

700 ml

Cu2SO4.5H2O

17,3 g

Nước cất

100 ml

Chuẩn bị thuốc thử: Đổ dung dịch B từ từ vào dung dịch A, lắc đều. thêm nước cất vừa
đủ 1000 ml. Đun sôi cách thủy. Thuốc thử phải khơng có tủa đỏ.
3. Cách tiến hành
Cho vào ống nghiệm 1 ml thuốc thử Benedict. Thêm vào 0,1 ml (2 giọt) nước tiểu. Đun
sôi cách thủy và nhận xét sự chuyển màu.
4. Hiện tượng và giải thích
4.1. Hiện tượng

Hiện tượng
Ống 1

Kết luận

Thuốc thử trong, màu xanh dương.

Phản ứng âm tính (-).
Khơng có glucose trong nước tiểu.

Ống 2
Ống 3

Có ít tủa, thuốc thử chuyển sang màu Phản ứng dương tính (+).
xanh lá.

Lượng glucose trong nước tiểu ≤ 5 g/l.

Có tủa màu vàng cam.

Phản ứng dương tính (++).
Lượng glucose trong nước tiểu 5 – 10 g/l.

11

Email:


Nguyễn Quỳnh Như

Ống 4

Thực tập hóa sinh

Có tủa đỏ gạch.

Phản ứng dương tính (+++).
Lượng glucose trong nước tiểu 10 – 20 g/l.

Thanh đánh giá kết quả phản ứng Benedict
4.2. Giải thích
 Dưới sự có mặt của đường khử, ion Cu2+ có trong thuốc thử Benedict sẽ bị khử thành
ion Cu+. Các ion Cu+ sẽ tạo thành tủa đồng oxide (Cu2O) màu đỏ gạch.
 Glucose có nhóm aldehyde -CHO có tính khử nên sẽ tạo tủa khi phản ứng với thuốc
thử Benedict, và tùy thuộc vào lượng glucose có trong nước tiểu mà sẽ có sự chuyển
màu khác nhau.

↓ tủa đỏ gạch

 Phản ứng Benedict và phản ứng Fehling đều tạo tủa Cu2O màu đỏ gạch. Tuy nhiên,

phản ứng Fehling chỉ có thể định tính glucose trong nước tiểu, cịn phản ứng
Benedict là phản ứng bán định lượng vì thơng qua phản ứng này người ta có thể ước
chừng được lượng glucose trong nước tiểu.

12

Email: