THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME ΒGALACTOSIDASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE VÀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


TIỂU LUẬN: CÔNG NGHỆ ENZYME
ĐỀ TÀI: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME Β-GALACTOSIDASE TỪ
ASPERGILLUS ORYZAE VÀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Nhóm thực hiện

:

01

Giảng viên hướng dẫn

:

TS. Hoàng Hải Hà

Hà Nội - 2021


DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHĨM
Họ tên

Mã sinh viên

Lớp

Hồng Thị Ánh

636306

K63CNTPA

Tống Hoàng Hà

636010

K63CNSTHA

Hà Ngọc Hiếu

646064

K64CNTPD

MỤC LỤC



PHẦN THỨ NHẤT: TỔNG QUAN CHUNG VỀ ENZYME Β-GALACTOSIDASE
I.1. Giới thiệu về enzyme β-galactosidase

β-galactosidase (β-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23) hay còn gọi là enzyme
lactase. β-galactosidase là enzyme có khả năng xúc tác cho hai kiểu phản ứng: phản ứng thủy
phân và phản ứng chuyển gốc galactozyl. Phản ứng thủy phân chính của β-galactosidase thủy
phân đường đôi lactose thành hai đường đơn glucose và galactose, và trong một số trường hợp
enzyme tham gia phản ứng transgalactosylation chuyển gốc galactose đến cơ chất lactose tạo
galacto - oligosaccharides (GOS) (Davail và cs, 1994)

I.2. Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase
β-galactosidase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể thu từ nhiều nguồn khác nhau như
thực vật (hạnh, đào, mơ, táo) hoặc từ nội tạng động vật, hoặc các loại nấm men, vi khuẩn hay
nấm sợi (Mlichová, Z. – Rosenberg, M. 2006). Nguồn enzyme từ động vật và thực vật rất khó để
triển khai theo quy mơ cơng nghiệp vì những hạn chế sinh lí và hạn chế kĩ thuật. Vì có những ưu
điểm mà vi sinh vật đã được chọn để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp. Theo (Nguyễn
Đức Lượng và cs, 2004), những ưu điểm đó là:
(1) Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh. Trong một thời gian ni cấy ngắn, ta có thể
thu được một lượng sinh khối rất gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và
thực vật. Để đạt được tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa một khối
lượng cơ chất rất lớn. Cũng từ nghiên cứu trên E. coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong
vòng 24 giờ, vi khuẩn E. coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn lần
khối lượng cơ thể chúng. Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy, chúng phải tổng
hợp ra được lượng enzyme rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất trong tế bào là do enzyme
đảm nhận. Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồn sinh học để sản xuất enzyme rất có
lợi. Trong một khoảng thời gian ngắn, khơng những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu
enzyme nội bào) mà còn thu được lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất
cao.
(2) Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao. Ưu điểm này gắn liền với tốc độ
chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh sản và phát triển của vi sinh vật.
(3) Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp. Trong sản xuất này, quá
trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn khơng phụ thuộc vào
khí hậu bên ngồi như sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật.
4


(4) Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mơ cơng nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm.
Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá thành sản phẩm và có
thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới.
Tính chất, tính đặc hiệu hay cấu trúc không gian của các enzyme β-galactosidase tương đối

khác nhau ví dụ như độ dài chuỗi amino acid, pH tối ưu hay là nhiệt độ tối ưu do được phân lập
từ các nguồn khác nhau. Lựa chọn phù hợp nguồn sản xuất β-galactosidase phụ thuộc vào quá
trình thủy phân lactose. Ví dụ nguồn nấm men có pH tối ưu từ 6,5-7,0 sẽ được sử dụng cho các
sản phẩm sữa hay whey ngọt. Hay là nguồn nấm sợi có pH tối ưu từ 3-5 phù hợp với whey có
tính acid. Ngồi ra, khả năng hoạt động của enzyme β-galactosidase còn phụ thuộc vào các ion.
Kluyveromyces lactics yêu cầu các ion như Mn2+, Na+ hay Kluyveromyces fragilis yêu cầu các
ion như Mn2+, Mg2+, K+.
Nguồn
Nấm sợi

Nấm men

Aspergillus niger
Aspergillus oryzae

Sản phẩm enzyme pH tối ưu
Ngoại bào

Kluyveromyces lactis

Nội bào

Kluyveromyces fragilis
Escherichia coli

Vi khuẩn

Lactobacillus thermophilus

Nội bào

Leuconostoc citrovorum
Bacillus circulans

Nhiệt độ tối ưu (°C)

3,0 - 4,0

55 - 60

5,0

50 - 55

6,5 - 7,0

30 - 35

6,6

30 - 35

7,2

40

6,2

55

6,5

66

6,0

65

(Mlichová, Z. – Rosenberg, M. 2006)

PHẦN THỨ 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Β-GALACTOSIDASE
Enzyme β-galactosidase có vai trị quan trọng trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, βgalactosidase được ứng dụng phổ biến nhất cho q trình thủy phân lactose trong cơng nghiệp
chế biến sữa, các sản phẩm từ sữa và sản xuất galactose-oligosaccharides trong dược phẩm.
5


2.1. Thủy phân lactose trong sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa
Enzyme β-galactosidase xúc tác cho quá trình thủy phân lactose thành 2 phân tử đường
glucose và galactose, làm tăng độ ngọt của sản phẩm khoảng 50% (Mlichová, Z. – Rosenberg, M.
2006). Quá trình thủy phân lactose của enzyme β-galactosidase:

Đây là một ứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong công nghiệp chế biến sữa hay để
sản xuất sữa không chứa lactose (Harju, M., Kallioinen, H., & Tossavainen, O. (2012). Trong các
sản phẩm như sữa đặc hay kem, nồng độ lactose quá cao sẽ dẫn đến kết tinh lactose làm cho các
sản phẩm này sẽ có sạn đường, sử dụng β-galactosidase sẽ làm ngăn các tinh thể lactose kết tinh,
nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm. Theo Parmjit S. Panesar và cs, 2006 thủy phân lactose
cũng sẽ tạo ra các monosaccharides dễ dàng cho quá trình lên men hơn, giảm thời gian để bổ
sung vi sinh vật nuôi cấy đạt được pH mong muốn trong các sản phẩm lên men như phơ mai, sữa
chua. Do đó, lượng chất làm ngọt trong sữa chua giảm làm cho sản phẩm cuối cùng có chứa ít
calo hơn.

2.2. Sản xuất galactose-oligosaccharides
Lactase tham gia vào q trình chuyển hóa lactose thành galactose-oligosaccharides (GOS).
GOS là một prebiotic được ứng dụng trong các sản phẩm dược phẩm có lợi đối với sức khỏe con
người đặc biệt là hệ tiêu hóa. GOS giúp ổn định hệ vi sinh đường ruột, kết hợp với các chủng vi
sinh vật có lợi trong đường ruột làm tăng khả năng miễn dịch, ... Chu trình chuyển hóa Lactose
thành galactose-oligosaccharides dưới tác dụng của enzyme:

6


PHẦN THỨ 3: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME Β-GALACTOSIDASE
3.1. Thu nhận và tinh sạch enzyme β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus
3.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng giống Lactobacillus acidophilus được lấy giống từ bộ môn công nghệ sinh học Đại
học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. Lactobacillus acidophilus được ni cấy trong môi
trường MRS trên thạch nghiêng agar, ở 4°C.
7


3.1.2. Thu sinh khối vi sinh vật và enzyme thô
Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự tiến hành nuôi cấy trong môi trường cảm ứng sinh βgalactosidase bao gồm: lactose (10 g/l), cao nấm men (60 g/l), cao thịt (10 g/l), Tween 80 (6 g/l),
K2HPO4 (3 g/l), KH2PO4 (1 g/l), CH3COONa (3 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), MnSO4(0,15 g/l).
Quá trình lên men thực hiện trong erlen 500 ml, ở 37°C, pH 6,0, tốc độ lắc 100 vòng/phút trong
50 giờ. Kết thúc q trình lên men, ly tâm canh trường 5000 vịng/phút trong 15 phút, ở 4°C thu
nhận sinh khối. Rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0. Bảo
quản sinh khối ở -20°C cho đến khi cần sử dụng.
Để thu nhận β-galactosidase, tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng phương pháp xử lý sóng
siêu âm dịch huyền phù vi sinh vật 5% w/v trong đệm sodium phosphate pH 7,0, công suất siêu
âm 396kW, thời gian siêu âm 3,2 phút. Dịch huyền phù sau khi xử lý sóng siêu âm được đem ly
tâm ở 6000 vịng/phút, 4°C, 15 phút, để thu dịch enzyme thô.

3.1.3. Tinh sạch enzyme
Tiến hành thu protein enzyme bằng muối (NH4)2SO4 nồng độ (w/v) lần lượt 25,1%; 31,4%;
39%; 47,2%; 56,1%; 65,7%; 76,1%, NaCl nồng độ (w/v) lần lượt 15%, 20%, 25%, 30% và 35%
và dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol, aceton) với tỷ lệ giữa thể tích dung mơi và thể tích
dịch enzyme lần lượt: 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15 và 90:10. Đánh giá
các tác nhân kết tủa protein enzyme hiệu quả nhất.

Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme bằng dung môi isopropanol là cao nhất với hiệu
suất thu hồi là 89,93% và độ tinh sạch 4,5 lần. Nhóm tác giả đã lựa chọn dung mơi isopropanol
làm tác nhân kết tủa. Kết tủa enzyme thơ sau đó được đưa đi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Enzyme thô sẽ được đem đi tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel (GPC - Algilent
1100series) sử dụng cột Ultrahydrogel 250. Cột được cân bằng và rửa giải bằng dung dịch đệm
8


sodium phosphate 0,05M, pH 7,0. Tốc độ dòng là 1ml/phút, áp lực bơm 41 bar. Thu nhận các
phân đoạn và xác định hoạt tính β-galactosidase.

Thời gian lọc gel được diễn ra trong 18 phút thu được 4 phân đoạn enzyme nhưng chỉ có phân
đoạn enzyme thu được từ 6-8 phút có hoạt tính β-galactosidase, các phân đoạn cịn lại khơng có
hoạt tính. Sau khi sắc ký lọc gel thì hiệu suất thu hồi enzyme là 58,57%, độ tinh sạch tăng 22,6
lần so với enzyme sau khi phá vỡ tế bào.
3.1.4. Đánh giá nhiệt độ, pH tối ưu, hằng số động học của enzyme β-galactosidase
a. Nguyên tắc
Nguyên tắc: Hoạt tính β-galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme này phản ứng
với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG). Dưới tác dụng của βgalactosidase, oNPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. o-nitrophenol khi giải phóng
sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ (Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm. Một
đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1μmol oNP (onitropheny) trong 1 phút ở điều kiện thích hợp.

Hoạt tính enzyme trong 1ml dịch ni cấy được tính theo cơng thức sau:

Trong đó:
9


U/ml:

Hoạt tính β- galactosidase

Abs420nm:

Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại 420
nm

Blank:

Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng

SlopeoNPstandardcurve:

Hệ số góc của đường chuẩn oNP

treaction:

Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)
(TS. Nguyễn Hoàng Anh, 2018)

b. Đánh giá nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme, xác định hằng số động học của enzyme
Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự tiến hành chuẩn bị cơ chất ONPG (ortho-nitrophenyl-βD-galctopyranoside) với nồng độ 3mM trong dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0.
Nhiệt độ đánh giá từ 30 - 70°C và xác định hoạt tính enzyme.

Từ kết quả, tác giả xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme đạt cao nhất ở 40°C và bắt đầu giảm
mạnh ở 60 - 70°C. Trên 70°C thì enzyme vơ hoạt hồn tồn.
Đánh giá pH tối ưu của enzyme, tiếp tục sử dụng cơ chất ONPG với nồng độ 3mM, thay
đổi pH môi trường phản ứng từ 3 – 9 sử dụng các dung dịch đệm là: acetate 0,05M, pH 3 – 4,5;
phosphate 0,05M, pH 5 – 8, borate, pH 8,5 – 9.

10


Nguyễn Thị Vân Linh và cộng sự xác định được pH tối ưu của enzyme ở trong khoảng 7 – 7,5. Ở
pH = 6,5 thì hoạt tính của enzyme cũng khá cao (90%) và pH dưới 4,5 thì hoạt tính enzyme
không đáng kể.
Nguyễn Thị Vân Linh và cs sử dụng ONPG làm cơ chất phản ứng, nồng độ cơ chất thay đổi
từ 0,6 mM – 5,4 mM. Hằng số động học V max và Km được tính tốn từ phương trình Lineweaver –
Burk và giá trị Vmax và Km lần lượt là 2,3 µmol/phút và 0,73 mM.

3.2. Thu nhận và tinh sạch enzyme β-galactosidase từ Aspergillus oryzae
3.2.1. Nguyên vật liệu
Chủng giống Aspergillus oryzae được lấy từ nguồn giống sử dụng trong sản xuất công
nghiệp α-amylase được nuôi cấy trên thạch Sabouraud.
Thu sinh khối vi sinh vật
Park và cộng sự tiến hành nuôi cấy và thu sinh khối Aspergillus oryzae bằng môi trường:

3.2.2.

4% tinh bột khoai tây, 1.5% peptone, 1.0% yeast extract, 1.0% KH 2PO4, and 0.2% NaNO3, ở pH
5.5 trong erlen 500 ml. Ủ ở 30°C với tốc độ lắc 250 vịng/phút trong 4 ngày. Sau khi kết thúc q
trình lên men, sinh khối được lọc và thu dịch bằng ethanol nồng độ thể tích 70% ở 4°C.
3.2.3. Tinh sạch enzyme

11


Park và cộng sự tiến hành thu protein enzyme thô được trong phòng lạnh 4°C. Thêm 560 g
(NH4)2SO4 vào dịch lọc lên men (80% bão hịa). Kết tủa hình thành sau khi để qua đêm và lắng
bằng lực li tâm 20000 x G trong thời gian 10 phút. Kết tủa được làm sạch bằng 100ml nước khử
ion. Sau đó kết tủa được thẩm tách bằng dung dịch đệm sodium acetate 0,05M, pH 5,0 trong 48h.
Tinh sạch enzyme bằng sắc ký cột DEAE-cellulose. Protein enzyme được tinh sạch trong hệ
thống sắc ký trao đổi ion dạng cột (4 x 50cm) với chu kì 1N NaOH và 1N HCl và được cân bằng
với dung dịch đệm là sodium acetate (0.05-0.6M), pH = 5, dòng chảy 5ml trong thời gian 30
phút. Các phân đoạn chứa hoạt tính β-galactosidase được kết tủa bằng amoni sulfate. Sau đó, kết
tủa có chứa protein enzyme β-galactosidase được thẩm tách bằng dung dịch đệm 0,05M sodium
acetate, pH = 5 trong 48h. β-galactosidase tinh chế được tiếp tục thẩm tách bằng sắc ký cột CMcellulose với cột và quy trình tương tự sắc ký DEAE-cellulose với dung dịch đệm sodium acetate
0,05M, pH = 5. Sau quá trình này, enzyme được tinh sạch bằng sắc ký cột DEAE-Sephadex A50
(2x 50cm) quy trình tương tự DEAE-cellulose với dung dịch đệm sodium acetate 0,05M, pH = 5.

12


Sau khi sử dụng amoni sulfate và sắc ký DEAE-cellulose thì hoạt tính của enzyme thu được là
40U/mg. Trong q trình sắc ký CM-cellulose vẫn tách một phân đoạn khơng thủy phân pnitrophenyl-α-D-galactopyranoside nhưng vẫn thủy phân lactose, ONPG và tinh bột. Đó là do βgalactosidase và α-amylase cùng xuất hiện trong 1 phân đoạn. Sau khi sắc ký DEAE-Sephadex
A50 thì hoạt tính enzyme β-galactosidase thu được là 106U/mg.
3.2.4.

Đánh giá nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme, xác
định hằng số hoạt động của enzyme
Nguyên tắc đánh giá enzyme β-galactosidase tương tự như mục 3.1.4.a
Để xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme, Park và cs sử dụng 4mM ONPG trên dung dịch
đệm sodium acetate 0,1M, pH = 5. Nhiệt độ đánh giá từ 30 - 70°C với enzyme thô và enzyme đã
tinh sạch.

Từ kết quả, Park và cộng sự xác định được nhiệt độ tối ưu của enzyme thô là từ 55 - 60°C, nhiệt
độ tối ưu của enzyme đã tinh sạch là từ 50 - 55°C. Enzyme thô bền với nhiệt hơn so với enzyme
đã được đã tinh sạch.
13


Xác định pH tối ưu của enzyme, sử dụng enzyme và 4mM ONPG ở nhiệt độ 60°C, thay đổi
dung dịch đệm tạo pH tương ứng. Ở pH 3,6 - 5,6, dung dịch đệm là 0,1M sodium acetate; 0,1M
dung dịch đệm sodium phosphate cho pH 5,7 - 8,0. Enzyme β-galactosidase xác định được pH tối
ưu ở pH = 5.

Đánh giá độ bền pH của enzyme β-galactosidase tinh chế ở nhiệt độ phòng, để qua đêm. Sử
dụng 60μg/ml trong các dung dịch đệm: 0.05M acetate pH 3,6 – 5,6; 0.05M phosphate pH 5,7 –
8,0; 0.05M boric acid pH 8,2 – 9,2; NaOH pH 9,4 – 10,1.

Kết quả cho thấy enzyme β-galactosidase không bị mất hoạt tính ở pH từ 3,6 đến 8 trong điều
kiện nhiệt độ phòng, qua đêm.
Đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại tới hoạt tính của enzyme, Park và cộng sự tiến
hành sử dụng 2 ml cơ chất ONPG, 0,5 ml enzyme đã tinh chế và 1,5 ml ion kim loại tiến hành
trộn lẫn ở nhiệt độ 60°C trong 15 phút.
14


Các tác giả đánh giá được khơng có ion kim loại nào ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của
enzyme β-galactosidase.
Để xác định hằng số hoạt động của enzyme, Park và cộng sự sử dụng 4 ml cơ chất ONPG
hoặc lactose phản ứng với 1 ml enzyme đã tinh sạch ủ ở 60°C trong 15 phút. V max và Km được
tính tốn theo phương pháp Lineweaver – Burk. Km của enzyme từ Apergillus Oryzae xấp xỉ
0,77mM cho ONPG và 50mM cho lactose. Vmax của enzyme là 55,6 μg/phút/mg protein cho

ONPG và 2,46 μg/phút/mg protein cho sữa. ONPG là chất nền tốt nhất để xúc tác xác định hoạt
tính enzyme
β-galactosidase.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Zuzana Mlichová - Michal Rosenberg (2006). Current trends of β-galactosidase application in
food technology, Journal of Food and Nutrition Research. 2, 47-54.
2. Harju, M., Kallioinen, H., & Tossavainen, O. (2012). Lactose hydrolysis and other conversions in
dairy products: Technological aspects, Int Dairy J, 22, 104-109.
3. Parmjit S, P., Shweta, K., Reeba, P. (2010). Protential Applications of Ininiobilized β-galactosidase in
Food Prossesing Industries. Enzyme Research.
4. Davail, S., Feller, G., Narinx, E., Gerday, C. (1994). Cold adaptation of protein. J Biol Chem,
269.
5. Xavier, J. R., Ramana, K. V., & Sharma, R. K. (2018). β-galactosidase: Biotechnological
applications in food processing. Journal of Food Biochemistry.
6. Y. K. Park, M. S. S. De Santi and G. M. Pastore (1979). Production and characterization of β
-galactosidase from Aspergillus Oryzae. Journal of Food Biochemistry. 1, 100-103.
7. Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Bích Lam (2012). Thu nhận và tinh sạch βgalactosidase từ Lactobacillus acidophilus. Tạp chí phát triển KH&CN tập 15.

15


8. TS. Nguyễn Hoàng Anh (2018). Tuyển chọn, định danh vi khuẩn Bacillus an toàn trong thực phẩm
sinh enzyme β-galactosidase chịu nhiệt, bước đầu tinh sạch và xác định một số đặc tính của
enzyme.

16