TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM đề tài PHÁT HIỆN và ĐỊNH DANH SALMONELLA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

LÊ THỊ HỒNG ÁNH

BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Đề tài:
PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH SALMONELLA
Nhóm: 05
GVHD: Hồng Xn Thế
Sinh viên thực hiện:
Phạm Thị Mỹ Huyền
Nguyễn Thị Trúc Linh
Trịnh Ngọc Như Huỳnh 2005181102
Hồ Trúc Linh
Nguyễn Võ Nhật Khanh 2005181107

TP. HƠ CHÍ MINH, NĂM 2020


STT

1

2
3
4
5

Bảng phân công nhiệm vụ

MỤC LỤC
1. Cơ sở sinh học.....................................................................................................1
2. Tình hình ngộ độc, gây bệnh của Salmonela.......................................................2
3. Ngun tắc phân tích...........................................................................................5
4. Quy trình phân tích..............................................................................................6
5. Các bước tiến hành..............................................................................................7
6. Mơi trường và hóa chất..................................................................................... 15
7. Dụng cụ và thiết bị............................................................................................ 16
9. So sánh TCVN 10780-1: 2017 và ISO 6579-1:2017........................................ 19
10.

Thuật ngữ đề xuất...........................................................................................20

11.

Kết luận.......................................................................................................... 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 21

1


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 7.1 Tủ sấy.......................................................................................................16
Hình 7.2 Tủ ấm........................................................................................................16
Hình 7.3 Tủ lạnh......................................................................................................17
Hình 7.4 Nồi cách hâp thủy.....................................................................................17
Hình 7.5 Que cấy vơ trùng.................................................................................................................... 17

Hình 7.6 Dụng cụ đo pH......................................................................................... 18
Hình 7.7 ĐĨa petri vơ trùng.....................................................................................18
Hình 7.8 Ống nghiệm, bình tam giác vô trùng........................................................18


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BPW: dung dịch Buffered Peptone Water
CDC: Trung tâm Kiểm sốt và Phịng ngừa dịch bệnh Mỹ
HE: Hektoen Entric Agar
LD: lysine decarboxylase
MKTTn: Mueller Kauffman Tetrathionate Novobiocin Broth
RVS: Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton
TSA: Tryptone Soy Agar
TSI: Kilgler Iron Agar
VP: Voges-Proskauer
XLD: Xylose Lysine Desoxycholate


1. Cơ sở sinh học
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi
khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi,
có khả năng di động (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), sinh acid
từ glucose và mannitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh
indol và không phân giải ure. Hầu hết các chủng đều sinh H2S (trừ Salmonella
typhi). Chúng có mặt khắp nơi trong đất, nước, nước đá, sữa, sản phẩm bơ sữa, gia
cầm, sản phẩm gia cầm, trứng, sản phẩm trứng, thịt, phân động vật, thú ni… sinh
sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7µm đến 1,5µm, dài từ 2µm đến
5µm và có vành lơng rung hình roi. Salmonella có hơn 2000 kiểu huyết thanh và mỗi
kiểu đều có khả năng gây bệnh. chung phat triên tôt ơ nhiêṭđô ̣ 6℃ – 42℃, thich hợp
nhât ơ 35℃ – 37℃, pH tư 6 – 9 va thich hợp nhât ơ pH = 7,2. Ở nhiêṭđô ̣tư 18℃ –

40℃ vi khuân co thê sông đên 15 ngay.
Tại Bắc Mỹ, Salmonella typhimurium và Salmonella enteridis là hai chủng thường
gặp nhất. Tại Việt Nam, bệnh thương hàn do Salmonella typhi và Salmonella
paratyphi A, B, C gây ra. Bệnh do Salmonella gây ra là một trong những vấn đề
quan trọng nhất liên quan đến sức khỏe cộng đồng, gây nguy hiểm và tử vong đến
người và động vật trên thế giới. Liều gây bệnh khoảng 10 5-6 tế bào, nhưng đối với
một số chủng độc, thì việc ăn một lượ ̣ng nhỏ tế bào cũng có thể gây bệnh.
Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm. Có ba
dạng bệnh do Samonela gây ra. Sốt thương hàn do S. typhy, nhiễm trùng máu do S.
cholera-sius, rối loạn tiêu hóa do S.typhymurium và S.enterithdis.
Hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh về an toàn thực phẩm đều khơng cho phép có sự
hiện diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu. Theo phương pháp truyền thống
việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn
lọc, phân lập, phuc hồi và khẳng định.
Vi khuẩn Salmonella kém chịu nhiệt, dễ bị tiêu diệt khi thức ăn đượ ̣c đun nấu phù
hợ ̣p. Việc làm lạnh, cấp đơng, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm
thiểu nguy cơ nhiễm bệnh.
Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể
thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợ ̣p đặc hiệu với những sản phẩm
của sự kích thích đó, gồm: kháng ngun thân O, kháng nguyên lông H và kháng
nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu
1


tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch
cầu.
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc tố
+ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn
loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
+ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi

colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy
truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây
bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện
invivo và ni cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.

2. Tình hình ngộ độc, gây bệnh của Salmonela
Trong nước:
Tại Việt Nam, hằng năm nước ta xảy ra khoảng 168 ca ngộ độc thực phẩm nghiêm
trọng, nguyên nhân phần lớn là do Salmonella
Tại TP Hồ Chí Minh, trong đợ ̣t giám sát thí điểm năm 2013, sau khi lấy 1.618 mẫu
tại chợ ̣ đầu mối Bình Điên, Hóc Mơn, Thủ Đức đã phát hiện Salmonella trong 30%
mẫu thịt heo và 45% trong mẫu thịt gà.
Ngày 10/7/2013, tại Công ty TNHH Foremart Việt Nam (thị trấn Ân Thi, huyện Ân
Thi, tỉnh Hưng Yên) đã làm 232 công nhân bị ngộ độc thực phẩm do ăn bữa trưa
tại bếp ăn đặt trong Cơng Ty với các món giị, ngao nấu mùng tơi, giá xào mướp,
đậu sốt cà chua. Đồn cơng tác và đại diện các cơ quan y tế tại địa phương đã
thống nhất đánh giá nguyên nhân của vụ ngộ độc là do vi khuẩn Salmonella và độc
tố của chúng gây ra.
Ngày 3/10/2013, sau bữa ăn ca trưa tại Bếp ăn tập thể Công ty TNHH MTV
WONDO VINA tại ấp Tân Bình, xã Long Bình Điền, huyện Chợ ̣ Gạo, tỉnh Tiền
Giang, hàng loạt cơng nhân có biểu hiện nơi mửa, đi ngồi và phải nhập viện. Tính
đến ngày 08/10/2013, tổng số bệnh nhân ghi nhận đượ ̣c là 779 người phải nhập
viện điều trị. Rất may mắn, các bệnh nhân đều có tiến triển tốt, khơng có diễn biến
bất thường. Thưc ăn nghi ngơ chưa tac nhân la mon thit boc trưng chim cut kho;
nguyên nhân ngộ độc nghi do vi sinh vâṭva đôc ̣ tô vi khuân nhom Gram âm và đến
nay, mẫu kiểm nghiệm đã xác định hàng loạt công nhân bị ngộ độc là do thức ăn
nhiễm khuẩn Salmonella.
2

Tại Thành phố Đồng Hới với gần 250 người phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10
năm 2015 vì bánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khuẩn.
Những ngày đầu tháng 5 năm 2018, ở bản Nà Mện, xã Nậm Ty, huyện Sông Mã,
tỉnh Sơn La, sau khi ăn cỗ cưới, đã có tới hơn 300 người bị ngộ độc thực phẩm do
vi khuẩn Salmonella (vi khuẩn thương hàn) gây ra.
Ngày 14/11/2018, vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân khiến trên 200 trẻ mầm non
tại Đông Anh (Hà Nội) bị ngộ độc thực phẩm sau khi tổ chức liên hoan. Kết quả
kiểm tra cho thấy 1 mẫu bánh ngọt dương tính với vi khuẩn Salmonella. Mẫu bánh
này đượ ̣c cung cấp bởi Công ty Cổ phần sản xuất và thương mại Nguyên Cát có
địa chỉ tại phường Hạp Lĩnh, tỉnh Bắc Ninh.
Ngày 28/11/2018, hơn 200 người nhập viện sau khi ăn bánh mì vỉa hè ở TP Bn
Ma Thuột. Ngày 5/12, bà Lê Thị Châu - Chi cục trưởng Chi cục Vệ sinh An toàn
thực phẩm thuộc Sở Y tể Đắk Lắk xác nhận liên quan đến vụ 215 người bị ngộ độc
thực phẩm sau khi ăn tại tiệm bánh mì ở ngã tư đường Hồng Diệu - Phan Chu
Trinh (TP Bn Ma Thuột), đơn vị đã xác định nguyên nhân ngộ độc hàng loạt là
do nhiễm vi khuẩn Salmonella. Sau khi lấy mẫu thực phẩm gồm thịt heo, giò chả,
nước sốt, hành phi, bơ kiểm trathì phát hiện tất cả những mẫu trên đều nhiễm vi
khuẩn Salmonella.
Ngày 25/3/2019, hàng chục người bị ngộ độc khi ăn giỗ ở xã Hòa Hải, huyện
Hương Khê, tỉnh Hã Tĩnh do thức ăn trong đám giỗ bị nhiễm Salmonella. Nguyên
nhân gây nhiễm Salmonella là do khơng đảm bảo an tồn thực phẩm trong khâu
chế biến, mặt nước bị ô nhiễm và nước tù đọng…
Các triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Salmonella thường xuất hiện nhanh chóng,
trong vịng 8 – 72 giờ sau khi ăn thức ăn hoặc uống nước nhiễm Salmonella. Các
triệu chứng điển hình như đau bụng co thắt, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt, đau cơ, buồn
nơn, nước tiểu có màu sẫm, khơ miệng, phân tồn nước đơi khi có máu…
Ngồi nước:
Theo dự đốn của WHO, trên tồn thế giới có hơn 16 triệu ca bệnh thương hàn
hàng năm, hơn nửa triệu trong số đó là tử vong. Salmonella có khả năng sống sót
hàng tuần bên ngồi cơ thể con người hoặc động vật. Ánh sáng mặt trời (tia UV)

làm tăng tốc độ chết của các tác nhân gây bệnh. Trong phân khô, chúng cịn có thể
sống đượ ̣c 2,5 năm. Vi khuẩn không bị giết bằng cách đông lạnh. Trong môi trường
axit, vi khuẩn Salmonella chết đi nhanh chóng và chất diệt khuẩn phổ biến giết
chết chúng trong vòng vài phút. ỞỞ̉ nhiệt độ dưới 6 °C, mức tăng trưởng của
3


chúng chậm hơn nhiều. Để ngăn ngừa nhiễm khuẩn Salmonella, thực phẩm đượ ̣c
khuyến cáo là khi chế biến ít nhất nên giữ ở nhiệt độ ở 75°C trong ít nhất mười
phút (nhiệt độ trong lõi), trứng tươi cần bảo quản trong tủ lạnh.
Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm đượ ̣c Salmonella từ lợ ̣n mắc bệnh dịch tả và
gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella.
Tại Hoa Kỳ, Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợ ̣p ngộ độc thực phẩm.
Ngày 15/12/2011, tại trường học trên đảo Hokkaido phía Bắc Nhật Bản có 953 học
sinh và 48 giáo viên và nhân viên nhà trường có triệu chứng ngộ độc thực phẩm
sau khi ăn trưa gồm súp miso, salad và củ cải với thịt băm Nhật Bản. Các mẫu thức
ăn trên đã đượ ̣c thử nghiệm và xác định nguyên nhân phát sinh vụ ngộ độc là do
thức ăn nhiễm Salmonella.
Ngày 3/7/2019, đu đủ tươi nhập khẩu từ Mexico khiến 62 người bị ngộ độc do
nhiễm khuẩn Samonella
Ngày 26/9/2020, ít nhất 41 người dân tại Mỹ đã nhiễm khuẩn Salmonella sau khi
ăn mộc nhĩ chế biến đi kèm với món mỳ ramen. Trung tâm Kiểm sốt và Phòng
ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) cho rằng các ca nhiễm trên đều do sử dụng món mộc
nhĩ khơ do cơng ty nhập khẩu đồ Châu Á có trụ sở ở Sante Fe Springs, California
phân phối.
Chính quyền tỉnh Saitama ngày 2/7/2020 xác nhận 3.453 người tại các trường tiểu
học và trung học ở Yashio - thành phố phía Bắc thủ đơ Tokyo, đã bị đau bụng, đi
ngồi sau khi ăn bữa trưa với các suất ăn do công ty TQC cung cấp vào ngày 26/6.
Suất ăn bao gồm gà rán, khoai tây sốt cá ngừ, salad rong biển cùng cơm và súp đậu
hũ.

Salmonella đượ ̣c ghi nhận là nguyên nhân phổ biến nhất của các vụ ngộ độc thực
phẩm ở EU. Năm 2018, các quốc gia thành viên EU đã báo cáo 5.146 vụ ngộ độc
thực phẩm ảnh hưởng đến 48.365 người, theo báo cáo của cơ quan an toàn thực
phẩm Châu Âu (EFSA) và Trung tâm phòng chống dịch bệnh Châu Âu (ECDC),
có 1.581 vụ trong số các vụ ngộ độc này là do Salmonella, 67% trong đó có nguồn
gốc từ Tây Ban Nha và Ba Lan và chủ yếu liên quan đến trứng.

4


3. Nguyên tắc phân tích
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 10780-1:2017 dùng để phát hiện
Salmonella trong tất cả các loại thực phẩm.
Phương pháp này chỉ dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện
Salmonella trên lượ ̣ng mẫu đã lấy.
Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn và phải sử dụng
chủng đối chứng trong tồn bộ q trình phân tích
+ Tiền tăng sinh: mẫu đượ ̣c tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh
không chọn lọc (BPW) ủ ở 37℃ trong khoảng 18h.
+ Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu đượ ̣c chuyển
qua môi trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ ở 41,5 ℃ và MKTTn ủ ở 37℃
trong khoảng 24h.
+ Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai
môi trường rắn chọn lọc ( XLD và HE), ủ ở 37℃ trong khoảng 24h.
+ Phục hồi: Cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonela trên các
môi trường phân lập sang môi trường dinh dưỡng.
+ Khẳng định: Cấy chuyển sinh khối trên môi trường dinh dưỡng sang các
môi trường thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh lọc.

5

4. Quy trình phân tích
Cân 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng
Dập mẫu trong 1 phút
Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu thử

Thêm 225 ml BPW

Ủ ở (37±1)oC/(18±2)h

1ml

0.1ml
10ml môi trường RVS broth

10ml môi trường MKTTn broth

Ủ ở (41±1)oC/(24±3)h

Ủ ở (37±1)oC /(24±3)h

Cấy lên XLD agar

Cấy lên HE agar

Ủ ở (37±1)oC /(24±3)h

Ủ ở 35oC /(18 - 24)h

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ, cấy lên NA/TSA

Khơng có khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ từ mỗi mơi trường phân lập

Ủ ở (37±1)oC /(24±3)h

Thử một khuẩn lạc điển hình
hoặc nghi ngờ

Thử bốn khuẩn lạc còn
lại đã đượ ̣c đánh

TSI Ure agar LDC ONPG VP

Dương

o

Ủ ở (37±1) C/(24±3)h
6

Khơng phát hiện Salmonella
trong 25g/25ml

Âm tính

tính

Báo cáo kết quả


5. Các bước tiến hành
Cân một lượ ̣ng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho
phép ± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vơ trùng (hoặc bình tam
giác), bố sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu
(stomacher) trong 60 giây
+

Bước 1: Tiền tăng sinh (Tăng sinh sơ bộ)

Mẫu đượ ̣c tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn lọc (BPW) ủ ở

37±1oC trong 18±2h
+

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh thu đượ ̣c vào ống chứa 10 ml môi
trường
RSV
Chuyển 1 ml dịch cấy thu đượ ̣c vào ống có chứa 10 ml mơi trường
MKTTn
 Ủ mơi trường RVS đã cấy ở 41,5 °C trong 24 h ± 3 h.
 Ủ môi trường MKTTn đã cấy ở 37°C trong 24 h ± 3 h.
+

Bước 3: Phân lập

Từ dịch cấy thu đượ ̣c trong canh thang RVS, cấy phân lập lên bề mặt đĩa
thạch XLD và HE sao cho thu đượ ̣c các khuẩn lạc riêng rẽ
Từ dịch cấy thu đượ ̣c trong canh thang MKTTn, cấy phân lập lên bề mặt
đĩa thạch XLD và HE sao cho thu đượ ̣c các khuẩn lạc riêng rẽ
Lật úp các đĩa XLD và HE và ủ ở 37°C trong 24±3h.
Sau khi ủ 24±3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển
hình và các khuẩn lạc khơng điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella
F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển trên thạch XLD có màu
hồng trong suốt, có hoặc khơng có tâm màu đen
F Các khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển trên thạch HE có màu
xanh lam, có hoặc khơng có tâm màu đen
+

Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA

7


- Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường
phân lập XLD và HE. Nếu trên mỗi đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc
khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả cá khuẩn các điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy
ria lên NA/TSA. Ủ ở 37±1oC trong 24±3h
+
Trường hợ ̣p 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các
kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợ ̣p thì kết luận phát hiện Salmonella trong
mẫu
+
Trường hợ ̣p 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh
hóa khơng phù hợ ̣p thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã đượ ̣c đánh
dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợ ̣p

thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu và ngượ ̣c lại thì kết luận khơng
phát hiện Salmonella trong mẫu
F

Chọn khuẩn lạc để khẳng định

Đánh dấu các khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa. Chọn ít nhất một khuẩn lạc điển
hình hoặc nghi ngờ để cấy truyền và khẳng định. Nếu khuẩn lạc này âm tính thì
chọn nhiều hơn bốn khuẩn lạc nghi ngờ để chắc chắn rằng các khuẩn lạc này đã
đượ ̣c cấy truyền trên hỗn hợ ̣p các môi trường phân lập/môi trường tăng sinh chọn
lọc khác nhau cho thấy các khuẩn lạc nghi ngờ phát triển.
Cấy ria các khuẩn lạc đượ ̣c chọn trên bề mặt môi trường thạch không chọn lọc đã
đượ ̣c làm khô trước, sao cho các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ. Ủ các đĩa đã cấy ở
nhiệt độ từ 34°C đến 38°C trong 24± h.
Cách khác, nếu có các khuẩn lạc riêng rẽ (ni cấy thuần) trên mơi trường đĩa
thạch chọn lọc thì có thể thực hiện khẳng định sinh hóa trực tiếp với khuẩn lạc
riêng rẽ nghi ngờ từ môi trường đĩa thạch chọn lọc. Sau đó có thể thực hiện bước
ni cấy trên mơi trường thạch không chọn lọc song song với các phép thử sinh
hóa để kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc từ môi trường thạch chọn lọc.
Sử dụng các chủng cấy thuần để khẳng định bằng phép thử sinh hóa và huyết
thanh.

8


+

Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh

-Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các

môi trường sau:
Thạch TSI
Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết
hợ ̣p với mơi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc khơng có sinh hơi và
hydrogen sulfide (H2S).
Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu
xuống đáy. Ủ ở 37±1°C trong 24±3h. Diễn giải những thay đổi trong môi
trường như sau:

Cấy đâm sâu
Màu vàng
Màu đỏ hoặc khơng đổi màu

Màu đen
Bọt khí hoặc nứt thạch


Bề mặt nghiêng của thạch

màu vàng

màu đỏ
hoặc không
đổi màu
Phần lớn các chủng cấy Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề
mặt nghiêng của thạch và tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí), (với khoảng
90% trường hợ ̣p) sinh hydro sunfua (thạch bị đen) khi cấy đâm sâu.

9

Khi Salmonella phân lập đượ ̣c dương tính lactose, trên bề mặt nghiêng của thạch
TSI có màu vàng. Do vậy, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella không chỉ
dựa trên các kết quả của phép thử trên thạch TSI.
Lysine decarboxylase
Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, các
enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo
thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2).
Cách lấy mẫu: cấy ngay phía dưới của bề mặt môi trường lỏng, phủ một lớp
paraffin hay dầu khống lên trên bề mặt mơi trường. Ủ ở 37± 1°C trong 24 h ± 3 h.
Salmonella có phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau khi ni cấy, mơi
trường vẫn giữ ngun màu tím. Phản ứng âm tính khi mơi trường có màu vàng.
Phần lớn các chủng cấy Salmonella điển hình có phản ứng LDC dương tính.
Thạch urê
Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành amoniac do hoạt
tính của enzyme urease từ VSV và kết quả là mơi trường bị kiềm hóa do NH 3 đượ ̣c
tạo ra.
Cách cấy mẫu: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 37± 1°C trong 24 h ± 3
h. Nếu phản ứng dương tính thì urê đượ ̣c phân giải thành amoniac, làm phenol đỏ
chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Ngượ ̣c lại, nếu phản
ứng là âm tính thì mơi trường khơng đổi màu (vàng cam).
Mơi trường thử phản ứng indol
Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol:
Indol, Skatol (methyl indol) và indol-acetate.
Cách cấy mẫu: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường trypton
water. Ủ ở 37 ±1°C trong 24 h ± 3 h. Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs, nếu
xuất hiện một vòng màu đỏ (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng dương tính, xuất hiện
màu khác là phản ứng âm tính.
10

Phép thử indol có thể đượ ̣c sử dụng khi cần phân biệt Salmonella (thường phản
ứng âm tính indol với Escherichia coli và Citrobacter (cả hai phản ứng dương tính
indol) vì các vi sinh vật này có thể cho các phản ứng điển hình trên mơi trường
phân lập Salmonella.
Phát hiện β-galactosidase
Nguyên tắc: xác định khả năng lên men lactose của vi sinh vật.
Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vơ trùng
có chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý. Thêm một giọt toluen và lắc ống. Đặt ống
này vào trong nồi cách thủy ở 37°C và để trong vài phút (khoảng 5 phút). Thêm
0,25ml thuốc thử để phát hiện β-galactosidase và lắc đều. Đặt lại ống vào nồi cách
thủy để ở 37°C trong 24h ± 3h, kiểm tra ống thường xuyên. Màu vàng cho thấy
phản ứng dương tính. Phản ứng thường xuất hiện sau 20 phút. Nếu sử dụng đĩa
giấy bán sẵn, thì theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Voges – Proskauer
Nguyên tắc: xác định khả năng sinh acetymethylcarbinol (acetoin) trong quá trình
lêm men glucose của một só vi sinh vật
Cách cấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ống vơ trùng
có chứa 3ml mơi trường VP. Ủ ở 37±1°C trong 24h ± 3h. Sau khi ủ, thêm 2 giọt
dung dịch creatine, 3 giọt dung dịch α-naphthol và sau đó thêm 2 giọt dung dịch
kali hydroxyde (KOH), lắc dều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc thử. Khi xuất hiện
màu hồng đến màu đỏ sáng trong 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, cịn phản
ứng âm tính khi dịch vi khuẩn vẫn khơng đổi màu.
Phép thử huyết thanh
 Yêu cầu chung
Các khuẩn lạc thuần cho thấy các phản ứng sinh hóa điển hình đối với Salmonella
đượ ̣c thử nghiệm tiếp để phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên Salmonella O
và H (và cũng như với kháng nguyên Vi, tại những nơi dự kiến có mặt Salmonella
Typhi trong nguồn cung cấp thực phẩm) bằng cách ngưng kết với kháng nguyên đa
giá trên lam kính. Các khuẩn lạc thuần đượ ̣c nuôi cấy trên

11


môi trường thạch không chọn lọc và đượ ̣c kiểm tra khả năng tự ngưng kết. Loại bỏ
các chủng tự ngưng kết mà không đượ ̣c thử nghiệm tiếp để phát hiện sự có mặt của
các kháng nguyên Salmonella. Sử dụng kháng nguyên theo hướng dẫn của nhà sản
xuất nếu khác với phương pháp đượ ̣c mô tả dưới đây để phát hiện sự có mặt của
các kháng nguyên Salmonella O và H.


Loại bỏ các chủng tự ngưng kết

Cho một giọt dung dịch nước muối lên lam kính thủy tinh sạch. Dùng que cấy
vòng trộn đều dung dịch nước muối với khuẩn lạc cần thử nghiệm, để thu đượ ̣c
huyền phù đục và đồng nhất.
Lắc nhẹ lam kính từ 30s đến 60s (tùy theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Quan sát
huyền phù trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp. Nếu có sự vón cục, khơng rời
nhau (ít hoặc nhiều) của vi khuẩn, thì chủng này đượ ̣c xem là tự ngưng kết, không
cần thử phản ứng huyết thanh tiếp theo. Nếu khơng có sự vốn cục và vi khuẩn rời
nhau, thì chủng xem như khơng tự ngưng kết, cần phảo tiếp tục thử phản ứng huyết
thanh.
+

Kiểm tra O, H,...

Nhỏ một giọt anti-O hoặc H lên một lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh
khối vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ
30-60s, quan sát trên nền đen. Phản ứng dương tính khi có hiện tượ ̣ng ngưng kết
xảy ra. Đôi khi cần quan sát hiện tượ ̣ng ngưng kết bằng kính lúp hay kính hiển vi
với độ phóng đại thấp. Ngượ ̣c lại, nếu vi khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm

cho giọt dung dịch đục đều đượ ̣c xem là kết quả âm tính.
Mẫu đượ ̣c kết luận dương tính với salmonella khi có khuẩn lạc đặc trưng trên các
môi trường phân lập và cho những kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng,
có/khơng có H2S và sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+).
+

Kiểm tra các kháng nguyên O

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên O với khuẩn lạc thuần đã xác định khơng có
khả năng tự ngưng kết, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên K đa giá thay
cho dung dịch nước muối.
12


Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng đượ ̣c coi là dương tính.
+

Kiểm tra các kháng nguyên Vi (tùy chọn)

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên Vi với khuẩn lạc thuần đã xác định khơng có
khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên
Vi thay cho dung dịch nước muối.
Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng đượ ̣c coi là dương tính.
+

Kiểm tra các kháng ngun H

Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên H với khuẩn lạc thuần đã xác định khơng có
khả năng tự ngưng kết, tiến hành theo, sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên
H đa giá thay cho dung dịch nước muối.

Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng đượ ̣c coi là dương tính.


13




Diễn giải các phản ứng sinh hóa và huyết thanh
Bảng diễn giải các kết quả của các phép thử khẳng định với các khuẩn
lạc đã thử nghiệm
Phản ứng sinh hóa
Điển hình

Điển hình

Điển hình

Phản ứng khơng
điển hình

14


6. Mơi trường và hóa chất
Mơi trường và hóa chất
Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW)
Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Peptone (RVS)
Selenit xystin / Tetrathionat (TT)
Xylose Lysine Desoxycholate (SLD)

Hektoen Entric Agar (HE)
Tryptone Soy Agar (TSA)
Lysine Decacboxylase broth (LDC)
Voges-Proskauer (VP)
Ure Broth
Tryptone Water
Kligler Iron Agar (KIA)/TSI
Đĩa giấy ONPG
Dung dịch creatine
Kháng huyết thanh
Dung dịch α-naphtol
KOH 40%
Thuốc thử Kovac's
HCl và NaOH 10%


15


7. Dụng cụ và thiết bị
Sử dụng các thiết bị dụng cụ của phịng thử nghiệm vi sinh thơng thường như:

Hình 7.1 Tủ sấy

Hình 7.2 Tủ ấm

16


Hình 7.3 Tủ lạnh

Hình 7.4 Nồi cách hâp thủy

Hình 7.5 Que cấy vô trùng
17


Hình 7.6 Dụng cụ đo pH

Hình 7.7 ĐĨa petri vơ trùng

Hình 7.8 Ống nghiệm, bình tam giác vơ trùng

8. Ví dụ minh họa
Thực hiện thí nghiệm để phát hiện (hay khơng phát hiện) Salmonella có trong mẫu ruột
cá qua các mơi trường:
-

Thạch TSI: thạch có màu đỏ, vàng, thạch bị đen, có sinh hơi
18


Mơi trường LDC: mơi trường vẫn giữ ngun màu tím => Phản ứng dương
tính
(+)
Thử nghiệm Urê: Mơi trường chuyển sang màu đỏ hồng => Phản ứng âm
tính (-)
Mơi trường phản ứng Indol: Trên bề mặt môi trường xuất hiện 1 vịng màu
vàng nhạt => Phản ứng âm tính (-)
- galactosidase: Khuẩn lạc nghi ngờ đưa vào que thử Oxidase, hiện tượ ̣ng

khơng màu => Phản ứng âm tính (-)
Thử nghiệm phản ứng VP (Voges-Proskauer): Môi trường không đổi màu
=>Phản ứng âm tính (-)

TSI: đỏ/ vàng, có sinh H2S, có sinh hơi; Urease (+); Indol (-); ONPG (-);
LDC
(+)

Kết luận: Không phát hiện Salmonella trong mẫu ruột cá dựa vào TCVN 83-2012/BYT

9. So sánh TCVN 10780-1: 2017 và ISO 6579-1:2017
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 10780 -1 :2017 về vi sinh vật trong chuỗi thực
phẩm - phương pháp phát hiện, định lượ ̣ng và xác định typ huyết thanh của
samonella, phần 1 phương pháp phát hiện Samonella spp
ISO 6579-1: 2017 Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1:
Detection of Salmonella spp.

Giống nhau