THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 3 ppsx

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 14
Homepage:

Bài 3. Định tính Salmonella
3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy
ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và
mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose,
không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng
tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh
H
2
S.
Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình
gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng
định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện
diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
BPW, ủ ở 37
0
C, 18-24 giờ
Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn
lọc RV, ủ ở 42
0
C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 37
0
C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang
BHI hay TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H
2
S, sinh hơi/không
- Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol
(+); Sorbitol (+)

Salmonella dương tính/
âm tính trong 25g mẫu
Hình 12: Salmonella trên thạch XLD
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 15
Homepage:

3.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích

Ghi chú
BPW
(Buffered Pepton
Water)
Pepton: 10g
NaCl : 5g
Na
2
HPO
4
: 3.5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
1000 ml nước
cất
pH 7.2 ± 0.2
Phân phối cho mỗi tổ 20ml
BPW trước khi khử trùng.
(buổi 2)

RV
(Rappaport-
Vassiliadis Soya
Pepton)

Môi trường cơ bản
Tryptone:5g
NaCl: 8g
KH
2
PO
4
: 1.6g
Nước cất: 1000 ml
Dung dịch MgCl
2

MgCl
2
.6H
2
O: 400g
Nước cất: 1000 ml
Dung dịch Malachite
green oxalate
Malachite green oxalate:
0.4g
Nước cất: 100 ml
Môi trường hoàn chỉnh
Môi trường cơ bản:

1000ml
Dung dịch MgCl
2
:
100ml
Dung dịch Malachite
green oxalate: 10ml
1110 ml
pH 5.5 ± 0.2
Phân phối 30ml RV cho mỗi
tổ (10ml/ống nghiệm) trước
khi khử trùng. (buổi 2)
XLD
(Xylose Lysine
Desoxycholate)
Cao nấm men: 3g
L-lysine: 5g
Xylose: 3.75g
Lactose: 7.5g
Sucrose: 7.5g
1000 ml nước
cất
pH 7.4 ± 0.2
Đun sôi môi
trường.
Phân phối 50ml XLD cho
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 16

Homepage:

Sodium deoxycholate:
2.5g
Ferric ammonium
citrate: 0.8g
Sodium thiosulfate: 6.8g
NaCl: 5g
Agar:15g
Phenol red: 0.08g
Không hấp.
Không giữ
quá 1 ngày

HE
(Hektoen Entric
Agar)
Proteose Peptone: 12.0g
Yeast Extract: 3.0g
Bile Salts No. 3: 9.0g
Lactose: 12.0g
Saccharose: 12.0g
Salicin: 2.0g
Sodium Chloride: 5.0g
Sodium Thiosulfate:
5.0g
Ferric Ammonium
Citrate : 1.5g
Agar: 14.0g
Bromthymol Blue:

65.0mg
Acid Fuchsin : 0.1g
1000 ml nước
cất
pH 7.5± 0.2
Đun sôi môi
trường.
Không hấp.
Phân phối 50ml HE cho mỗi
tổ (25ml/petri) (buổi 3)
TSA
(Tryptone Soya
Agar)
Trypticase peptone: 15g
Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g
1000 ml nước
cất
pH 7.3± 0.2
Phân phối 50ml TSA cho
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4)
KIA
(Kliger Iron
Agar)
Polypeptone peptone:
20g
Lactose: 20g
Dextrose: 1g
NaCl: 5g

1000 ml nước
cất
pH 7.4± 0.2
Phân phối 20ml KIA cho
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
(buổi 5)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 17
Homepage:

Ferric ammonium
citrate: 0.5g
Sodium thiosulfate: 0.5g
Agar: 15g
Phenol red: 0.025g
MR-VP Both
(Glucose
Phosphate)
Môi trường 1:
Buffered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g
Môi trường 2:
Casein Pancreatic

Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
1000ml nước
cất.
pH 6.9 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 5)
RSU
(Rustigian-Stuart
Urea Broth)
Dipotassium Phosphate:
9.5g
Yeast Extract: 0.1g
Urea: 20g
Monopotassium
Phosphate: 9.1g
Phenol Red: 0.01g
1000ml nước

cất.
pH 6.8 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
phối 3ml/ống nghiệm.
(buổi 5)


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 18
Homepage:

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng
ở 121
0
C trong 15 phút.
Bước 4: Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng,
bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây.
Ủ ở 37
0
C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô,
các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa
cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng
của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK).
Bước 5: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh
RV đã được ủ ấm 42
0

C. Ủ ở 42
0
C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Bước 6: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ
dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella
như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có
hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.

+ Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ
xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số
dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần
hết khuẩn lạc.
Bước 7: Khẳng định
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi
ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 37
0
C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện
trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD
Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 19
Homepage:

+ Thử nghiệm sinh H

2
S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA
được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,
lactose) và khả năng sinh H
2
S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy
ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và
lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được
đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có
màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H
2
S nên có
xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng
sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy
lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm.

+ Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường
urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là
pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ
khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô
trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37
0
C trong 48
giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên
màu vàng cam.

+ Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi
trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que
cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ
khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường.
Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có
VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men
lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí,
chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch
nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử
lưu huỳnh và sinh H
2
S.
Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea
Hình 17: kết quả thử
nghiệm VP
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20
Homepage:

tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo
nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài
này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5
0
C – 50
0
C, tối ưu ở 35
0
C – 40
0
C; pH dao
động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc
loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng
nh
ấ
t
b
ằ
ng Stomacher, đ
ộ

pha loãng 10
-1

Pha loãng đến các độ pha loãng 10
-
2
, 10
-
3

Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch
MYP,
ủ

ở

30
0
C, 24 gi
ờ

Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase
dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 30
0
C, 24 giờ
Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, th
ử

nghi
ệ
m VP.

Kết luận B. cereus