Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng






i hc Khoa hc T nhiên
 ngành: ; 60 42 30
PGS. TS. 
 2011

Abstract: 
              

 

    

-


Keywords: ; Gen CXCL12; ; 

Content
1.Mở đầu


 -80%.
  

y 




dù, 
[7].
            
    

, “Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh
nhân ung thư đại trực tràng”
1. Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng:
- CXCL12 

- CXCL12 


2
2. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại
trực tràng:
- 
CXCL12.
- CXCL12.
- quan gen CXCL12 

2. Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu :Gồm mẫu mô và mẫu máu

cách 5-

                
-80

o
C.






Hóa chất
-                

- Enzyme: Proteinase K, Fastdigest® Msp
- -f, U-r, M-f, M-
- 
- 
- 
- Enzyme CpG Methyltrasferase (M.SssI) (N
- 
- 
- dNTPs 
- Phenol, Chloroform, Isopropan
- 
3
, Na
2
CO
3

- Acid boric, Tris-base, ETDA, ethanol,
- 

Thiết bị
- 
- g: Mini-Subcell GT (Bio-
- -protein 3 (Bio-
- 
- 
- 
-20
o
C
2.Phương pháp nghiên cứu

3
2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô
- ADN 
.
2.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu

[5
- -1%.
2.3. Phương pháp phân tích PCR- RFLP
 [1] 

- CAGTCAACCTGGGCAAAGCC -3'
- AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC -3'
 



2.4. Phân tích RFLP

Msp 
-
o
C.
2.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
Xử lý bisulfite ADN bằng kit DNA Methylation-Gold TM kit và xử lý bisulfite ADN
theo phương pháp của Herman va
̀
cs (1996) [2]
Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gen CXCL12

                
Wendt và cs, (2006) [3]            
MethPrimer.

CXCL12 
CXCL12-
- f ): - GGA GTT TGA GAA GGT TAA AGG TC - 
- r) :- TTA ACG AAA AAT AAA AAT AGA CGA T - 
CXCL12-
-- GAG TTT GAG AAG GTT AAA GGT TGG - 
- - TAA CAA AAA ATA AA ATA CAA CAA T - j
2.6. Phân tích kết quả bằng phương pháp thống kê
2

 CXCL12 và tình

tràng.
3. Kết quả.

4
3.1. Kết quả phân tích PCR- RFLP
3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Hình1. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách từ máu
(Điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)




3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR

Hình2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen CXCL12
(Điện di trên gel agarose 2% và nhuộm ethidium bromide)
-



1 2 3 4 5 6 7
8

5
3.1.3. Kết quả phân tích RFLP
  CXCL12  
MspI

o



Hình3. ảnh điện di sản phẩm cắt ADN bằng enzyme MspI với 3 băng 302bp, 202bp và
100bp
(Điện di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)

enzyme MspI.
 enzyme MspI 


. 

                   
enzyme MspI 
N

n
3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê
Q


CXCL12 trong ung

3.2. Kết quả phân tích MSP





6

Hình4. ảnh điện di ADN tổng số tách từ mô

(điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide)
-10 cm.



3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã
của gen CXCL12
C   3000 nu ( 3001 
6001).  (Li Lab, UCSF)  (EMBOSS) 


 ( 100
bp,  50%  


Hình 5. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer [6]
Sequence Name:
Sequence Length: 3001
CpG island prediction results
(Criteria used: Island size > 100, GC Percent > 50.0, Obs/Exp > 0.6)

7
5 CpG island(s) were found in your sequence
Size (Start - End)
Island 1 297 bp (137 - 433)
Island 2 161 bp (623 - 783)
Island 3 225 bp (891 - 1115)
Island 4 1346 bp (1174 - 2519)
Island 5 341 bp (2526 - 2866)

Hình 6. Kết quả khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm cpgplot (EMBOSS)[4]
CPGPLOT islands of unusual CG composition
3001-6001 from 1 to 3001
Observed/Expected ratio > 0.60
Percent C + Percent G > 50.00
Length > 100
Length 297 (137 433)
Length 161 (623 7833)
Length 225 (891 1115)
Length 1346 (1174 2519)
Length 341 (2526 2866)
Kết quả khuyếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của
gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP

8

Hình7. ảnh điê
̣
n di sản phẩm PCR cu
̉
a gen CXCL12
(điê
̣
n di trên gel polyacrylamide 10% và nhuộm bạc)
-
- 
1,3,5,7: UMethyl.

                
promoter cCXCL12.

3.2.4. Phân tích tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở
bênh ung thư đại trực tràng



16 
5, có 11/25 


.
,   và
CXCL12 
  3               ,  
un
63,63
 

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Mô U Mô lân cận u
loại mô
Tỷ lẹ %

U
M


9
Hình 8.Tỷ lệ methyl và unmethyl khảo sát trên 2 loại mô u và lân cận u
U: unmethyl; M: methyl
 (hình 13) 
,  
(43,75
(62,5%).

CXCL12


, 
 có 
  
methyl hóa hoàn toàn

có 
Kết Luận

-CXCL12:

CXCL12 

(p>0,05).
2. 








 5 

 CXCL12 và






 
oán.
3. 



















CXCL12  

CXCL12 


References
Tài liệu tiếng Việt
1. , Di truyền ung thư 
tr.12.
2,  hóa
a gen CXCL12  Tạp chí y học Việt
Nam (2), tr. 72-77.
3. ), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà

4 
- 
MLH1 y
Tạp chí khoa học   27(2), tr 315.
Tài liệu Tiếng Anh

10
5. Anollés          
Promega Notes Magazine
40, pp. 13.

6. Cindy A.E., Kathleen D., Kazuyuki K., Leonard B.S., Corey B., Darryl S., Peter V.D.,
     -throughput assay to measure ADN
Nucleic Acids Research, 28(8), pp.32
7. Davuluri R.V., Grosse I.      
Nature Genetics, 29, pp. 412-417.
8. Dimberg J., Dienus O., Hugander A., Wågsäter D.   
circulating         
International Journal of Molecular Medicine, 19(1), pp. 11-15.
9. -specific
PCR: a novel PProceedings of
the National Academy of Science of the United States of America, 93, pp. 9821
9826.
10. Hidalgo-Pascual M, Galan J.J.,Chaves-Conde.M., Ramirez-Armengol J.A., Moreno.
C., Calvo E,Pelaez. P., Crespo. C., Ruiz. A., 
   Oncology Reports,
18(6), pp. 1583-1588.
11. Indrieux.  
prostatndocrine-Related Cancer, 16(3), pp. 663-673 .
12.      ADN methylation markers in colorectal
Cancer Metastasis Review, 29, pp. 181-206
13. Li 
Bioinformatics, 18(11), pp. 1427-1431
14 
       Brazilian Journal of
Medical and Biological Research, 38(10), pp. 14491454
15.            
Annual Review of Immunology, 22,
pp. 891928.
16.          
  The New England Journal of Medicine, 361(25), pp. 2449-

2460.
17. Sun X., Cheng G., Hao M., Zheng J., Zhou X., Zhang J., Taichman R.S., Pienta K.J.,
          
Cancer Metastasis Review, pp.269-270
18.         
Humana Press, New York, pp. 520.
19. Tones P.A., Baylin S.B. (2002) The fundamental role of epigenetic events in
Nature Reviews Genetics, 3(6), pp. 415428
20. Van Dijk D., Oostindiër M., Kloosterman W., Krijnen P., Vasen H.W. (2007),
     -up of patients with colorectal cancer: a
Familial Cancer, 6(1), pp. 131-134.
21.   Springer, Ohio, pp. 453-
462.
22. Wendt M.K., Johanesen P.A. , Kang N., Binion D., Shah V., Dwinell M.B. (2006),
      ADN hypermethylation promotes
Oncogene, 25, pp. 49864997.

11
23. detection of
      World Journal of
Gastroenteraol, 10, pp. 3127-3131.
24. Zhou W., Jiang Z., Liu N., Xu F., Wen P., Liu Y., Zhong W., Song X., Chang X.,
Zhang X., Wei G., Y-regulation of CXCL12 mRNA expression
by promoter hypermethylation and its association with metastatic progression in
   Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,
135, pp. 91-102.
25. Zymo research EZ ADN Methylation- Gold TM Kit
Tài liệu World Wide Web
26. (2/2012)
27.

28.
(11/2011)
29. (3/2012)
30. (12/2011)
31. (3/2012)
32. (11/2011)
33. (12/2011)
34.
35. (11/2011)
36. (3/2011)
37. (3/2011)
38. 9-trong-chan-
doan-va-dieu-tri-ung-thu-bieu-mo-truc-trang.htm(3/2012)
39. (3/2012)