PHÂN TÍCH đột BIẾN GEN tARN và ND3 của ADN TY THỂ ở BỆNH NHÂN UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN
TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người
thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện luận văn này.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ của TS. Đỗ Minh Hà và các anh chị, các bạn sinh viên làm việc tại Phòng
Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,
giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện
K Tam Hiệp, Hà Nội và khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội. Tôi xin
chân thành cảm ơn.
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, Ban lãnh đạo và bạn bè đồng
nghiệp Bệnh viện 19-8 đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu để
hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và
luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học Viên

Nguyễn Thị Ngọc Tú


MỤC LỤC

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

bp

Base pair (cặp bazơ)

CPEO

Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt
cơ ngoài tiến triển mãn)

cs

Cộng sự

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

KSS

Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre)

LHON

Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di
truyền Leber)

LS

Leigh syndrome (Hội chứng Leigh)

MELAS

Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like
episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện
tương tự đột quỵ)

MERRF

Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co
giật cơ và có sợi đỏ nham nhở)

mtDNA

Mitochondrial DNA (ADN ty thể)

NARP

Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, mất
điều hòa và thoái hóa võng mạc)

ND3

NADH dehydrogenase 3

PCR

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)

ROS

Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

5


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

TBE

Tris borate EDTA

TNM

Tumor−Node−Metastasis

6


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC BẢNG

7


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC HÌNH

8


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

MỞ ĐẦU

Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể được coi
là trung tâm năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất
hữu cơ thành năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể
còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis
(quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi
chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, người ta
đã thống kê được trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể
quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng,
chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là
những đột biến do thay đổi các nucleotide [57].
Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể
được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y
học. Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang
phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh
chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các
dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề
tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.
Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế

giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới.
Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm
khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực
tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường
tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh
nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày

9


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể,
đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng”
với mục đích:
− Phát hiện đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân
ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
− Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty
thể với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở người
Việt Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

10

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. TY THỂ
Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh
dưỡng thành năng lượng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty
thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt tên là
mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường có
dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường [3].
Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các
chất hữu cơ thành năng lượng tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể
đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa như: Apoptosis (quá trình
tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của
tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32].
1.1.1. Hệ genome ty thể
Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di
truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước
16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa
nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen,
chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này
có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa
oxy hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã
của ty thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và
chức năng của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong
ribosome của tế bào chất.

Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng
riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ,
có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số

11


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ
gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không
mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc
mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen
ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố
quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi
vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi
polypeptide được mã hóa trong ty thể [41].

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75].

Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ,
lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra
trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN
ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên
phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến,
tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng
đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau.

Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện
lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến

12


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

[51]. Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý
nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể.
1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể
Những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980,
và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy
[68]. Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các
hư hại trong quá trình tạo ATP. Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối
thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham gia
vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lượng các phân tử ADN ở các mô, các cơ
quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh
hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ
xương, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm
sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của
bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa
trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học
phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học
trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan
đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong
quần cư dân [22] (hình 2).

13


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người
được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc
đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột
biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có
thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột
biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột
biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới
các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và
ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:
Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm
gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,
G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô
hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác
chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.

14


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột
biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Người bệnh có biểu hiện chậm
phát triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh.
Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,
giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội
chứng Leigh. Người bệnh có biểu hiện rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu
hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của
hệ thần kinh trung ương.
Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ
(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các
triệu chứng rối loạn thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa.
Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra
bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys). Người bệnh có biểu hiện tai
biến, co giật cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não, nhược
cơ.
1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư
Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thư đã được
Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng
sự tăng tốc độ của quá trình đường phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hư
hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70]. Theo Warburg, một số biến đổi của ty
thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi
trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp.
Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại
oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị
thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ
enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, hoặc stress
oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và
protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố

15


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể
có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển
điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận
chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện
tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS,
làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa
protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Như vậy biến đổi của hệ gen ty
thể có liên quan đến bệnh ung thư [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã được xác
định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng
trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở
vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi
ADN ty thể đã được xác định trong ung thư. Các biến đổi này bao gồm: đột biến
điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty
thể.

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]

16


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Đột biến điểm
Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải
trình tự genome ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của cùng bệnh
nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột
biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) được xác định trong các gen 16S
rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất
base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi
mã và không ghi mã [55].
Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng. Polyak và
cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5,
cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53].
Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu và cs đã xác định được 60% đột biến
ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột
biến điểm T→C hoặc G→A. Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA,
16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả
năng bị đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng [45].
Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày, Wu và cs đã xác định được 48% mang đột
biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base
tại vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72].
Mất đoạn
ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, như mất đoạn 4977 bp, đã được xác định ở
ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và
cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%)
bệnh nhân ung thư dạ dày [17].

17


Luận văn Cao học

Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Thêm đoạn
Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp)
trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ
dày [72]. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.
Thay đổi số bản sao ADN ty thể
Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung
thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung
thư đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác
định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng
trứng [69]. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung
thư.
Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể
phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong
vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt
khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl
hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất
chức năng của ty thể [38].
1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm
ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao
gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn
xuống (descending colon). Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối
giữa đại tràng và hậu môn (hình 4). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại
tràng và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể
xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi
chung là ung thư đại trực tràng [79].

18


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76].
Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế
giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trường hợp được chẩn đoán là do ung
thư. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử
vong. Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ước tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nước phát
triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nước đang phát triển. Trên thực tế, số lượng
bệnh nhân ở cả hai nhóm nước đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân số và
đời sống ngày càng được nâng cao. Ung thư đại trực tràng thường được phát hiện ở
giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số người), tuy nhiên bệnh có
xu hướng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rượu bia, thuốc lá
[78].
1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh. Có 2 dạng polyp
phổ biến ở ung thư đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thư
sau này và polyp ác tính, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi
thành u tuyến lớn và dần hình thành ung thư xâm lấn. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu
lại cho rằng nguy cơ mắc ung thư trực tràng tăng lên ở một số gia đình nhiều thành
viên là do ảnh hưởng của dạng polyp không phải khối u [33]. Các nhà khoa học chỉ ra
rằng có rất nhiều nguyên nhân hình thành ung thư đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến

19

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống
kê cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này đó là:
− Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thư, bất hoạt các gen ức chế khối
u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình.
− Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; quá trình lão hóa, chế
độ ăn uống ít xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá
thường xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng,
gây viêm loét đại tràng.
Ngoài 2 nhóm nguyên nhân chính trên còn có các nguyên nhân khác như tuổi,
giới tính, chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng
[33].
1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học
Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại
trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thư biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa
cao), ung thư biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp. Ngoài ra, một số dạng hiếm gặp
khác như sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn
thương dạng khối lớn), u hắc tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào hình thoi (xuất hiện
riêng lẻ hay kết hợp với ung thư biểu mô tuyến hoặc ung thư biểu mô vảy và được
gọi là ung thư biểu mô – sacom), ung thư biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay
kết hợp với một loại khác của ung thư đại trực tràng), ung thư biểu mô vảy đơn
thuần…Trong các dạng này thì ung thư biểu mô tuyến là dạng rất hay gặp, chiếm
đến 95% trong tổng số các dạng ung thư đại trực tràng. Đây là dạng ung thư xuất
phát từ niêm mạc ruột với tổn thương ban đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát
sinh từ một u tuyến, biểu hiện của nó được xác định theo các giai đoạn phát triển và
loại cấu trúc trước đó là dạng polyp hay dạng nhú [7].

Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:
Việc xác định giai đoạn của ung thư cho biết kích thước của khối u và mức độ
lan rộng của nó khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết

20


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thư. Hiện nay có một số hệ thống phân
giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Sự khác nhau giữa các hệ
thống này phụ thuộc vào mục đích của từng người sử dụng trong việc chẩn đoán và
bệnh án của từng bệnh nhân [20]. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đề cập
đến hệ thống TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases). Đây là hệ thống phân loại
được áp dụng đối với các mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu.
Hệ thống TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng dựa vào kích thước, mức
độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết (Bảng 1). Trong đó:
T cho biết kích cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u.
N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch
huyết bị lây nhiễm.
M cho biết mức độ di căn của ung thư đến các cơ quan hoặc bộ phận khác của cơ thể.
Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29]

T – Khối u nguyên phát
Tx − U nguyên phát không được đánh giá
T0 − Không có bằng chứng của u nguyên phát
Tis – Ung thư biểu mô tại chỗ: nội biểu mô hay xâm nhập lớp đệm
T1 – Ung thư biểu mô xâm nhập hạ niêm mạc

T2 – Ung thư biểu mô xâm nhập lớp đệm cơ niêm
T3 – Ung thư biểu mô xâm nhập qua lớp đệm cơ niêm tới dưới thanh mạc hoặc vào mô
quanh đại tràng và trực tràng không có phúc mạc
T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác hoặc cấu trúc và/ hoặc gây thủng phúc
mạc tạng
N – Hạch lympho
Nx – Hạch bạch huyết vùng không được đánh giá
N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng
N1 – Di căn 1 đến 3 hạch bạch huyết vùng

21


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

N2 – Di căn 4 đến nhiều hơn hạch bạch huyết vùng
M – Di căn xa
Mx – Di căn xa không được đánh giá
M0 – Không có di căn xa
M1 – Di căn xa

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 5) [29]:
• Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy
trong các lớp trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thường
có thể trở thành ung thư và lây lan vào các mô bình thường gần đó.
Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư biểu mô tại chỗ.
• Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên
trong.

• Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng
hoặc trực tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.
• Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến
những phần xa của cơ thể.
• Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ
thống bạch huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực
tràng thường di căn đến là phổi và gan.

22


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77].

Tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ở các giai đoạn bệnh được thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác
nhau [29]

Giai đoạn
Giai đoạn 0
Giai đoạn I
Giai đoạn II−A
Giai đoạn II−B
Giai đoạn III−A
Giai đoạn III−B
Giai đoạn III−C
Giai đoạn IV

TNM
Tis N0 M0
T1−2N0M0
T3N0M0
T4N0M0
T1−2N1M0
T3−4N1M0
T bất kỳ, N2M0
T bất kỳ, N bất kỳ, M1

Khả năng sống sót sau 5 năm
100%
80−95%
72−75%
65−66%
55−60%
35−42%
25−27%
0−7%

1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20]
Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ
thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi
hiệu quả điều trị ung thư đại trực tràng. Các phương pháp chẩn đoán bệnh này bao
gồm:

23

Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

− Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng: tiêu chảy hoặc táo bón, có
máu lẫn trong phân, phân chặt, khó chịu chung ở bụng (căng phồng hoặc co thắt),
đầy hơi thường xuyên, sụt cân không rõ lý do.
− Chẩn đoán hình ảnh: phương pháp phổ biến nhất hiện nay đó là nội soi đại tràng
sigma bằng ống soi mềm giúp nhìn rõ các khối u và làm sinh thiết.
− Chẩn đoán mô học và tế bào học: phương pháp này cho phép phân biệt giữa các tế
bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phổ biến hơn cả là kỹ thuật
chọc hút kim nhỏ.
− Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ biến có
thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thư (CEA), xét
nghiệm máu trong phân (FOBT).
1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã
hóa và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Năm
1998, Polyak và cs đã xác định được đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1,
ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S
và 16S [53].
Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cặp mô thường
và mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột
biến trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau. Đột biến T4216C chiếm
27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thường và mô bệnh [49].
Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên
vùng D-Loop. Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp,
và đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên
cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thấy rằng
88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các

pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một
purin với một pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA.
60% đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này

24


Luận văn Cao học
Nguyễn Thị Ngọc Tú
_________________________________________________________________________

làm thay đổi acid amin [56]. Trong luận văn này chúng tôi muốn đi sâu vào đột biến
ADN ty thể trên gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí A10398G).
1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể
Đột biến điểm tARN ty thể là đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty
thể gây ra bệnh ty thể. Hai đột biến tARN được phát hiện đầu tiên là A8344G trên
tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến và được nghiên cứu nhiều nhất.
Đột biến A3243G có liên quan đến rất nhiều biểu hiện lâm sàng và thường gây ra
hội chứng MELAS [31]. MELAS cũng có thể bị gây ra bởi những đột biến khác
trên tARNLeu(UUR). Đột biến A8344G liên quan đến chứng MERRF, cũng là bệnh về
cơ thần kinh. Bệnh này còn có thể bị gây ra bởi một vài đột biến khác trên tRNA Lys
[56]. Ngoài ra, có thể kể đến đột biến A7445G trên tARN Ser(UCN) có liên quan đến
bệnh mất thính giác [54], đột biến A4269G trên tRNA Ile gây bệnh liệt cơ tim hoặc
liệt mắt cơ ngoài tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6).

Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59].

1.3.1.1. Đột biến A3243G và các bệnh liên quan
Đột biến A3243G trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNA Leu (UUR) đã được phát
hiện ra đầu tiên như là một nguyên nhân di truyền của bệnh MELAS [31]. Đột biến

A3243G liên quan tới MELAS là một trong số những đột biến gây bệnh phổ biến
nhất của ty thể với tần số được xác định trong khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số

25