TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ
VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS

GVHD
SVTH:

TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 04, năm 2022


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP TIỂU LUẬN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO CHOLERA VÀ
VIBRIO PARAHAEMOLYTUCUS

GVHD:
SVTH:

TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 04, năm 2022


Mục lục
1. Tổng quan về Vibrio..............................................................................................2
1.1. Đặc điểm sinh học............................................................................................2

1.2 Tình hình gây bệnh............................................................................................3
2. Quy trình phát hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus.......................4
2.1 Phạm vi áp dụng................................................................................................4
2.2 Nguyên tắc.........................................................................................................4
2.3 Thiết bị dụng cụ.................................................................................................4
2.4 Mơi trường và hóa chất......................................................................................5
2.5 Quy trình phân tich............................................................................................7
2.6 Các bước tiến hành............................................................................................8
2.7 Kết quả..............................................................................................................9
3. Kết luận:...............................................................................................................10
4. An tồn trong phân tích.....................................................................................10
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KẾT QUẢ.........................................................................12
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ...............................................16
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................19

1


1. Tổng quan về Vibrio
1.1. Đặc điểm sinh học
Vibrio là một chi của trực khuẩn gram âm, hình dạng cong-que (dấu phẩy), di
động sống kị khí tùy nghi, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi, không
sinh H2S thường hiện diện trong nước biển, một vài loài trong đó có thể gây ra ngộ độc
thực phẩm và có khả năng gây bệnh cho người: Vibrio cholerae (V. Cholera) , Vibrio
parahaemolyticus (V. Parahaemolyticus), Vibrio vulnificus,…
V. Cholerae là khuẩy khuẩn và là tác nhân gây ra các bệnh dịch tả trên toàn thế
giới. V. Cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực
phẩm và truyền nhiễm qua người khi điều kiện vệ sinh kém. V. cholerae tạo ra độc tố
tả cholera-toxin có độc tính mạnh, chỉ cần 5µg gây nhiễm qua đường miệng có thẻ gây
tiêu chảy cho người trưởng thành.

V. Parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm và tạo độc tố hemolysin bền nhiệt
có phản ứng với kháng nguyên Kanagawa. Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng,
và viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ xuất hiện 2-96 giờ sau khi ăn phải thực
phẩm bị nhiễm. Loài này thường hiện diện và tăng trưởng trong môi trường muối cao,
thường được phân lập từ các sản phẩm thủy sản.
Vibrio vulnificus không gây bệnh đường ruột mà gây nhiễm trùng máu cho
người.
Phân loại khoa học:
Giới : Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài : Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus

2


Hình 01: Vi khuẩn Vibrio cholerae

Hình 02: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
1.2 Tình hình gây bệnh
 Trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ con
người, có thể gây ra nguy hiểm, thậm chí tử vong. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm
bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt và đau đầu. Triệu chứng có thể
xảy ra trong vịng 30 phút sau khi ăn trong một vài giờ, hoặc vài ngày sau đóvà ở mức
độ nặng, nhẹ khác nhau.
Vi khuẩn V. parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc

thực phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1%

vụ

dịch

ngộ

độc

thực phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% các
trường hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm
1981và 2003). Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha
(1989,1999, 2004), Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và
cộng sự, 2005).
 Ở Việt Nam
Mới đây, tại Việt Nam, một người đàn ông 65 tuổi, trú tại TP ng Bí (Quảng
3


Ninh) đã tử vong do nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus do ăn hàu sống.
Triệu trứng do ăn phải Vibrio parahaemolyticus là tiêu chảy và nơn: Có biểu hiện
kiểu tả nhẹ như phân lỏng, tóe nước, phân có mùi hơi tanh, màu xanh hoặc xanh vàng.
Nôn nhiều và tiêu chảy phân nhiều nước dẫn đến mất nước cấp tính. Gần như khơng
sốt, khơng gây đau bụng.
Dạng lỵ trực khuẩn: Phân lỏng, lờ lờ máu cá, mùi thối khẳn, kèm theo sốt và đau
bụng.
Các dấu hiệu mất nước: Người mệt lả, háo nước, tiểu ít, mắt trũng, nặng thì phản
ứng chậm, li bì, thậm chí hơn mê.
Các dấu hiệu thường kéo dài khoảng 3 ngày, có thể nhẹ hoặc nặng tùy từng

trường hợp. Bệnh gây nhiễm trùng nặng hơn ở những người suy giảm sức đề kháng.
Vibrio parahaemolyticu gây ra viêm ruột cấp tính, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm
khuẩn từ vết thương. Người bệnh nhiễm loại vi khuẩn này có thể biểu hiện nhẹ khơng
nguy hiểm, nhưng cũng có thể gây ra tử vong.
2. Quy trình phát hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus
2.1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:
2007) và (ISO 21872-1:2017) dùng để phát hiện Vibrio cholerae

và Vibrio

parahaemolyticus trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi.
2.2 Nguyên tắc
Phát hiện V. Cholerae và V. Parahaemolyticus trong thực phẩm được thực hiện
bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi cấy trong môi trường chọn lọc. Tư
dịch khuẩn được cấy sang môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V.
Cholerae và V. Parahaemolyticus sẽ được thử nghiệm bằng phản ứng sinh hóa.
2.3 Thiết bị dụng cụ
-

Tủ ấm 37.0  1.0oC

-

Tủ ấm 41.50 1.0oC

-

Kéo, kẹp

-

Khây inox

-

Máy đồng nhất mẫu
4


-

Cân phân tích

-

Nồi hấp tiệt trùng

-

Đèn cồn

-

Que cấy

2.4 Mơi trường và hóa chất
Bảng 1: Mơi trường và hóa chất
Mơi trường và hóa chất

Mục đich

APW (Alkaline phosphate water)

Tăng sinh chọn lọc

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose)

Phân lập

TSA

Phục hồi

Đĩa giấy Oxidase

Khẳng định sơ bộ

Dung dịch NaCl
KOH 3%

Thử String khẳng định sơ bộ

Arginine dehydrolase

Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

Lysine decarboxylase
TW (Tryptone Water)
ONGP

Kowac’s

Thuốc thử Indol

HCl và NaOH 10%

Chỉnh pH

Cách pha chế môi trường
-

APW (Alkaline phosphate water; nhà sản xuất: Merck)
Hòa tan 20g/1L nước, hấp tiệt trùng 121 độ C trong 15 phút, đối với mơi trường
APW ống thì phân phối vào ống sau đố hấp tiệt trung. Làm nguội ở nhiệt độ
phòng, pH= 8.5  0.2.

-

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose; nhà sản xuất: Merck)
Hịa tan 88g/1L nước, khơng hấp tiệt trùng, đổ đĩa, pH: 8.6 ± 0.2

-

TSA (Tryptic Soy Agar; nhà sản xuất: Merck)
Hòa tan 40g/1L nước, hấp tiệt trùng 121 độ C trong 15 phút, đổ đĩa, đối với môi
trường TSA 1% muối thì bổ sung thêm 1g muối. pH: 7.3 ± 0.2

-

Lysine decarboxylase (TCVN 7954:2008)

5


Thành phẩn
 Yeast extract: 3.0g
 Glucose : 1.0 g
 L-lysine: 5.0 g
 Bromocresol tía:0.015 g
 NaCl: 10g
 pH : 6.8 ± 0.2 ở 25°C
Hòa tan các thành phần vào 1000 ml nước, phân phối vào ống và hấp tiệt trùng
1210C/15’.
-

Arginine dehydrolase (TCVN 7954:2008)
 Yeast extract: 3.0g
 Glucose : 1.0 g
 L-Aginin: 5.0 g
 Bromocresol tía: 0.015 g
 NaCl: 10g
 pH : 6.8 ± 0.2 ở 25°C
Hòa tan các thành phần vào 1000 ml nước, phân phối vào ống và hấp tiệt trùng
1210C/15’.

6


2.5 Quy trình phân tích

7

2.6 Các bước tiến hành

Đông nhất 25g mẫu với 225ml APW

Bước 1: Tăng sinh
Tăng sinh lần 1:
Cân
25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml
APW, dập mẫu 60
Tăng sinh lần 1/6-8 giờ
Phân lập lên TCBS
giây, ủ ở 37 oC trong 6  1 giờ.
Tăng sinh lần 2:
Chuyển 1ml dịch cấy trên bề mặt ASPW vào trong ống nghiệm chứa 10ml
Tăng sinh lần 2/66-24 giờ

môi trường ASPW. Ủ ở 41,5  1oC trong 18  1 giờ.
Bước 2: Phân lập
Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ ở 37 oC trong 24
 3 giờ.
o
ở 37 0,5
C trong
khoảng 24trịn,
giờ lớn có màu vàng, khuẩn
Trên mơi trường thạch TCBS Ủkhuẩn
lạc
V. Cholera

lạc V. Parahaemolyticus trịn, lớn có màu xanh dương.
Bước 3: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng TSA
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập
Vibrio cholera : Khuẩn lạc vàng, đường kính 2-3 mm

: Khuẩn
lạc xanh,
đườnglạc
kínhđiển
3-4 mm
TCBS.Vibrio
Nếuparahaemolyticus
trên một đĩa có
ít hơn
5 khuẩn
hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì

lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên mơi trường TSA có bổ
sung 1% muối. Ủ ở 37  1 oC trong 24h giờ.
-

Trường hợp 1: Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho kết luận thử
nghiệm sinh hóa phùSinh
hợp
thìsơkết
luận phù
hóa
bộ, khẳng
định, hợp.

kháng huyết thanh

-

Trường họp 2: Nếu trường hợp đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa
khơng phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc cịn lại đã được đánh dấu, nếu
một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả phù hợp thì kết luận phát hiện và
ngược lại kết luận không phát hiện. Kết Luận

Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên TSA, dung que cấy cấy vào các môi
trường thử nghiệm sau.
Bước 4.1. Các phép thử nhận dạng giả định

8


Thử nghiệm

Vibrio parahaemolyticus

Vibrio cholerae

Phản ứng Oxidase

+

+

Thử nghiệm String

+

+

Bảng 4.2. Thử nghiệm khẳng định.
Phản ứng tiêu biểu

Phản ứng tiêu biểu

V. Parahaemolyticus

V. Cholera

-

-

+

+

-

+

+

+

0% NaCl

-

+

6%

+

-

10%

-

-

Phép thử
Arginine dihydrolase
(ADH)
Lysine decarboxylase
(LDC)
ONPG
(galactosidase)
Sinh Indol
Thử nghiệm năng chịu
mặn

Thử nghiệm kiểu huyết thanh:
Trong trường hợp có đủ các chủng chuẩn/ chứng dương cho các thử nghiệm gây kháng
huyết thanh. Tùy theo yêu cầu phân tích, sẽ thực hiện phân tích kiểu kháng nguyên của
các chủng Vibrio
Đối với V. cholera, khi có yêu cầu xác định khả năng gây bệnh bằng phản ứng
kháng huyết thanh thì tiến hành phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh O1 và O139
Thử nghiệm V.parahaemolyticus Kanagawa: Xác định khả năng làm tan máu thỏ
dạng . Ủ 37.0  1.0OC / 24±2 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc
V.parahaemolyticus Kanagawa dương tính được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do
hiện tượng dung huyết dạng .
2.7 Kết quả
Phát hiện (hay không phát hiện) V. Cholerae hay V. Parahaemolyticus trong 25g
9


mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng.
3. Kết luận:
Tùy theo nhu cầu phân tích mẫu mà xây dựng phương pháp phù hợp.
Phương pháp phân tích V. Cholerae hay V. Parahaemolyticus; theo (ISO 218721:2017) còn xác định thêm Vibrio vulnificus và khẳng định bằng bằng phương pháp
PCR để rút ngắn thời gian phân tích.
Ví dụ: Chuẩn bị mẫu cho q trình phân tích Phát hiện V. Cholera và V.
Parahaemolyticus.
 Chuẩn bị mẫu: Mẫu cá bạc má nguyên con

Hình 03: Mẫu cá bạc má
Các yêu cầu về lấy mẫu cho phân tích vi sinh tham chiếu TCVN 6507-3:2019
mục 9.1.2 Cá tươi nguyên con (dài dưới 15 cm)
Lấy mẫu tiến hành phân tich V. Cholera và V. Parahaemolyticus
Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy ra một phần cá ngay phía trước đi bằng cách
thực hiện hai lát cắt để tạo ra các mặt cắt ngang, lát cắt đầu tiên để loại bỏ phần đuôi,

viền đuôi và lát thứ hai để lấy ra miếng thịt 25 gam để tiến hành phân tích.
 Quy trình phân tích: theo mục 2.6
 Kết quả: Ví dụ V. Cholera thử nghiệm sinh hóa đúng với bước 4 khẳng định và
V. Parahaemolyticus khơng đúng thì kết quả:
STT

V. Cholera

V. Parahaemolyticus

Mẫu cá bạc má

Phát hiện

Khơng phát hiện

4. An tồn trong phân tích
Trước khi vào phịng thí nghiệm phải tn thủ các nội quy sau đây để tránh làm
10


nhiễm bẩn mẫu thử và môi trường nuôi cấy, đồng thời cũng để tránh nguy cơ lây
nhiễm sang con người:
-

Phải mặc áo bảo hộ (blouse), đeo khẩu trang, găng tay và khẩu trăng khi thao
tác vi sinh. Không mang áo bảo hộ ra khỏi khu vực làm việc và phòng thay
đồ.

-

Khi tiếp xúc với hóa chất, mơi trường đều phải dùng bao tay, khẩu trang
chống an mòn,...

-

Khi thao tác với chủng gây bệnh , cần thao tác đúng kỹ thuật hướng dẫn để
tránh lây nhiễm.

-

Tất cả mơi trường , hóa chất đều phải dán nhãn và bảo quản đúng yêu cầu của
nhà sản xuất và theo hướng dẫn của phòng thí nghiệm.

-

Khi bắt đầu và kết thúc cơng việc phân tích phải vệ sinh tay và mặt bàn bẳng
cồn 700. Phân tích hoặc thao tác kiểm nghiệm phải đúng nơi quy định, khơng
được tự ý đổi vị trí cũng như dụng cụ, thiết bị thí nghiệm.

-

Tất cả các dụng cụ có vi sinh vật ni cấy bên trong hay dụng cụ bẩn phải
được tiệt trùng ở 1210C/30p.

-

Không ăn hoặc uống trong các khu vực thử nghiệm và hút thuốc trong phịng
thí nghiệm.

11


PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KẾT QUẢ
1 Khuẩn lạc V. Cholera và V. Parahaemolyticus trên môi trường TCBS agar

2 Khuẩn lạc trên môi trường TSA

3 Phản ứng indol

12


Nhân pyrrol của indol chứa CH2 kết hợp với nhân benzen của pDimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên dạng phức chất dạng quinone có
màu đỏ.
Ống (-) phản ứng âm tính – khơng làm đổi màu thuốc thử Kovac’s
Ống (+) phản ứng dương tính – đổi màu thuốc thử Kovac’s từ khơng màu sang màu
hồng
4 Phản ứng ONGP

Thủy phân của o-nitrophenyl–D–galactopyranoside (ONPG) bởi enzyme βgalactosidase và tạo thành o- nitrophenol có màu vàng.
Phản ứng ONPG chuyển sang màu vàng  Có sự sinh tổng hợp β-galactosidase
13


Phản ứng ONPG khơng đổi màu  Khơng có sự sinh tổng hợp β-galactosidase
5 Oxida test

Xác định sự hiện diện của enzyme oxidase
Hoạt tính oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện

diện của enzyme, thuốc thử bị oxy hóa → indolphenol có màu xanh dương
6 Phản ứng Arginine dihydrolase

Arginine chuyển hóa thành citruline nhờ xúc tác của enzyme aginine (ADH) và
chuyển hóa thành CO2 và putrescine
Dương tính: mơi trường có màu tím.
Âm tính: mơi trường có màu vàng.
7 Phản ứng Lysine decarboxylase

14


Khả năng sử dụng lysin được đánh giá qua sự đổi màu của môi trường nuôi. Nếu
các chủng vi khuẩn có enzyme phân giải thì enzyme này sẽ xúc tác cắt bỏ nhóm
carboxyl (-COOH), phóng thích CO2, tạo ra các sản phẩm có tính acid làm thay đổi
màu mơi trường.
Dương tính: mơi trường đục hoặc có màu tím.
Âm tính: mơi trường có màu vàng.
8 String test

Dương tính (có kéo sợi): gram âm
Âm tính (khơng kéo sợi): gram dương

15


PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
1. Kéo lấy mẫu

2. Kẹp lẫy mẫu

3. Khây Inox đựng mẫu

16


4. Các loại pipette

5. Tủ ấm

6. Cân phân tích

7. Máy đồng nhất mẫu

17


8. Nồi hấp tiệt trùng

18


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. />[2]. TCVN 7905:2008 (ISO 21872:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn
nuôi – Phương pháp phát hiện Vibrio spp. Có khả năng gây bệnh đường ruột – Phần 1:
Phát hiện Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae .
[3]. ISO 21872-1:2017: Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal
method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. -- Part 1:
Detection of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera and Vibrio vulnificus.
[4]. TCVN 6507-3:2019 (ISO 6887-3:2017) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm –

Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm
tra vi sinh vật- Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản
phẩm thủy sản.
[5]. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm – Trần
Linh Thước. NXB Giáo dục 2006
[6]. Phân tích vi sinh thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm HCM.
[7]. Sổ tay Phương Pháp Kiểm nghiệm Sinh học – NAFIQAD 4

19