Phân tích vi sinh thực phẩm salmonella typhi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

SALMONELLA TYPHI

TP HỒ CHÍ MINH, 2021
1


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
thầy Nguyễn Thành Luân khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Cơng nghiệp thực
phẩm Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho chúng em
trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Dù đã cố gắng nhưng không thể tránh khỏi những sai sót. Rất mong sự thơng cảm và
đóng góp ý kiến của q thầy cơ và các bạn để khóa luận được hồn thiện.
Cuối cùng, xin kính chúc thầy và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong công việc
và cuộc sống.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
TP Hồ Chí Minh, tháng 09, năm 2021
SVTH

2


MỤC LỤ
PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ.......................................................................................iii
BẢN NHẬN XÉT CỦA GVHD................................................................................iv
LỜI CẢM ƠN..............................................................................................................i

MỤC LỤC..................................................................................................................ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH.........................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU.......................................................................................vi
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN......................................................................................3
1.1. Nêu đôi nét về salmonella ( Đặc điêm, độc tố, ngộ độc, các nguồn lây nhiễm,
biện pháp phòng ngừa)............................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hình thái Salmonella typhi.........................................................3
1.1.2. Độc tố:.......................................................................................................3
1.1.3. Các nguồn lây nhiễm:................................................................................4
1.1.4. Triệu chứng:..............................................................................................4
1.1.5. Biện pháp phòng ngừa...............................................................................5
1.2. Tầm quan trọng của S. typhi.............................................................................5
1.3. Vì sao phải sử dụng các phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác nhau.6
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..........................................................7
2.1. Nghiên cứu 1: Enrichment-ELISA để phát hiện Salmonella typhi từ thực phẩm
và nước....................................................................................................................7
2.1.1. Nội dung nghiên cứu:................................................................................7
2.1.2. Kết quả nghiên cứu:..................................................................................9
2.2. Nghiên cứu 2: Phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trong trứng bị ô
nhiễm bằng cách sử dụng RT - PCR......................................................................11
2.2.1. Tổng quan:...............................................................................................11
2.2.2. Nguyên liệu nghiên cứu...........................................................................12
2.2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.......................................................12
2.2.4. Kết quả....................................................................................................13
2.3. Nghiên cứu 3: Phát hiện trực tiếp Salmonella typhi trên sản phẩm tươi sống
bằng cách sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa trên phage...................15
2.3.1. Vật liệu và phương pháp.........................................................................16
2.4. Nghiên cứu 4: Nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật Multiplex Pcr trong phát hiện
vi khuẩn Salmonella sp.s. enterica gây ngộ độc thực phẩm...................................19

2.4.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................19
2.4.2. Nguyên liệu nghiên cứu...........................................................................19
2.4.3. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR đối
với 2 loại vikhuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus............................19
2.4.4. Kết quả nghiên cứu..................................................................................20
2.4.5. Đề xuất quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện nhanh và đồng
thời vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus trong thực phẩm bằng
3


gen invasive và gen nuclease.............................................................................21
2.4.6. KẾT LUẬN.............................................................................................22
2.5. Nghiên cứu 5: Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) để phát hiện
nhanh Salmonella trong thịt cừu băm nhỏ.............................................................23
2.5.1. Đầu dò Oligonucleotide...........................................................................23
2.5.2. FISH protocol..........................................................................................23
2.5.3. Hiệu quả FISH.........................................................................................24
2.5.4. Phát hiện vi khuẩn Salmonella trong thịt cừu băm nhỏ...........................24
2.5.5. Kết quả của nghiên cứu...........................................................................25
CHƯƠNG 3. KIẾN NGHỊ.......................................................................................26
3.1. Nhận định đối với phương pháp Enrichment-ELISA để phát hiện Salmonella
typhi....................................................................................................................... 26
3.2. Nhận định đối với phương pháp RT - PCR.....................................................26
3.3. Nhận định đối với phương pháp sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa
trên phage..............................................................................................................26
3.4. Nhận định đối với phương pháp Multiplex Pcr...............................................27
3.5. Nhận định đối với phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)...................27
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................28

4

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình chụp salmonella ( nhuộm màu đỏ) bằng kính hiển vi..........................3
Hình 2.1. Độ nhạy của phương pháp sandwich ELISA kháng thể kép để phát hiện S.
typhi. (Đường ngang thể hiện giá trị ngưỡng cho sELISA)........................................10
Hình 2.2. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ ủ mồi của gen fimC S. Typhi..........................14
Hình 2.3. Đường cong khuếch đại của nuôi cấy dự trữ vi khuẩn Salmonella typhi với
mẫu DNA nồng độ 56 nanogam và đối chứng âm tính..............................................14
Hình 2.4. Đường cong nóng chảy (melting curve) của Salmonella typhi ni cấy với
mẫu DNA 56 nanogam..............................................................................................15
Hình 2.5. Đường cong khuếch đại và đường cong kiểm tra độ nhạy đối với gen fimC
Salmonella typhi........................................................................................................15
Hình 2.6. Đường cong khuếch đại và đường cong nóng chảy trong đánh giá xác nhận
của fimC-F (mồi thuận) và fimC-R (mồi ngược) Salmonella Typhi với ba mẫu trứng.
................................................................................................................................... 15
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình được sử dụng để phát hiện trực tiếp Salmonella typhi trên
bề mặt cà chua bằng cảm biến sinh học ME..............................................................17
Hình 2.8 Hiển thị số lượng lớn các tế bào Salmonella trên bề mặt cảm biến.............17
Hình 2.9 ảnh SEM hiển thị số lượng giới hạn nhỏ hơnSalmonella tế bào đến bề mặt
cảm biến..................................................................................................................... 18
Hình 2.10. Ảnh chụp SEMphotomicrograph của bề mặt cà chua có gai Salmonella. 18
Hình 2.11. Sự thay đổi đo được trong tần số cộng hưởng của cảm biến sinh học ME và
cảm biến điều khiển sau khi tiếp xúc với bề mặt cà chua tăng đột biến với các nồng độ
khác nhau của Salmonella..........................................................................................18
Hình 2.12. Kết quả điện di kiểm tra mật độ tế bào Salmonella sp. và Staphylococcus
aureus được nuôi cấy có thể phát hiện được bằng phản ứng multiplex PCR.............21
Hình 2.13. Kết quả của phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng thời Salmonella sp. và
Staphylococcus aureus...............................................................................................21
Hình 2.14.Tế bào S. Typhi được nhuộm bằng DAPI ở các mức độ ô nhiễm nhân tạo

khác nhau...................................................................................................................24
Hình 2.15. Tế bào S. Typhi được phát hiện bằng đầu dò Salm63 ở các mức độ ô nhiễm
nhân tạo khác nhau....................................................................................................25
5


DANH MỤC BẢNG BIỂU
BẢNG 2.1. Định lượng S. typhi trong các môi trường tiền tăng sinh khác nhau để phát
hiện bằng sELISA......................................................................................................10
BẢNG 2.2. Định lượng S. typhi trong các chất lỏngtăng sinh khác nhau để phát hiện
bằng sELISA.............................................................................................................. 10
BẢNG 2. 3. Phát hiện S. typhi trong các mẫu thực phẩm khác nhau bằng EnrichmentELISA.......................................................................................................................... 11
Bảng 2.4. Độ tinh khiết và nồng độ DNA phân lập được của mẫu nuôi cấy gốc và mẫu
trứng bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi................................................................. 13
Bảng 2.5. Mật độ tế bào Salmonella sp. Và Staphylococcus aureus được ni cấycó
thể phát hiện được bằng phản ứng multiplex PCR..................................................... 20
Bảng 2.6. Trình tự Oligonucleotide của mẫu dị Salm63........................................... 22

6


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Ngày nay, xã hội càng phát triển nhu cầu về chất dinh dưỡng càng cao, màu sắc trong
thực phẩm càng được cải thiện nhằm tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm.
Vệ sinh thực phẩm luôn là vấn đề ưu tiên hàng đầu của nước ta và thế giới. Thực phẩm
nếu không đảm bảo vệ sinh sẽ gây bệnh và ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người tiêu
dùng. Đặc biệc là thịt, cá, rau… ở chợ và một số cửa hàng khác có nguy cơ nhiễm bẩn
gây ngộ độc cho người tiêu dùng. Đa số các vụ ngộ độc đều là do vi sinh vật gây ra.
Có nhiều bài báo, phóng sự nói về nói về các nguy hiểm, hậu quả của nó. Nhưng tình

trạng ngộ độc thực phẩm vẫn còn nghiêm trọng.
Các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thường là Clostridium botinium, Bacillus
cereus, Pseudomonas aeruginosa … Nhưng Salmonella đặc biệt là vi khuẩn
Salmonella typhi là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. Salmonella typhi xâm nhập
vào cơ thể con người thông qua các sản phẩm thịt, cá,… mang nó. Khi vào cơ thể vi
khuẩn này gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con người. Ngoài ra các
tiêu chuẩn nước ta và nước ngoài quy định rất chặt chẽ sự xuất hiện của Salmonella
typhi trong thực phẩm. Đặc biệt hơn các sản phẩm như sữa, thịt, phomat,…. Nếu có
mặt Salmonella typhi thì khơng được chấp nhận Theo tơng tư 05/2012/TT-BYT. Chính
vì vậy cần có nhiều kỹ thuật phân tích Salmonella typhi để có thể xác định một các
chính xác và khách quan.
Xuất phát từ mong muốn biết thêm về Salmonella typhi như chất độc, thực phẩm
thường nhiễm, phương phương pháp định danh và định tính …. Nên nhóm 3 quyết
định làm đề tài “Salmonella typhi” để tìm hiểu rõ hơn về nó.
Mục tiêu của đề tài
Tìm hiểu sơ bộ về S. typhi.
Biết được các phương pháp dùng để xác định S. typhi.
Nội dung nghiên cứu chính
Tìm hiểu về S. typhi.
Các phương pháp dùng xác định S. typhi.
Bố cục luận văn gồm có 3 phần
Phần 1: Mở đầu: trang 1 đến trang 2.
Phần 2: Tổng quan: từ trang 3 đến trang 6.
1


Phần 3: Phương pháp nghiên cứu: từ trang 7 đến trang 25.
Phần 4: Kết quả và bàn luận: từ trang 50 đến trang 68.
Phần 5: Kết luận và kiến nghị: trang 26 đến 27.
Phần 6: Tài liệu tham khảo: trang 28

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Nêu đôi nét về salmonella ( Đặc điêm, độc tố, ngộ độc, các nguồn lây nhiễm,
biện pháp phịng ngừa)
1.1.1. Đặc điểm hình thái Salmonella typhi
Salmonella là trực khuẩn hình que, gram âm, khơng có nha bào, hiếu khí hoặc kỵ khí
tùy tiện, chủ yếu di động, có đường kính từ 0,7-1,5 μm, chiều dài từ 2-5 μm,sinh độc
tố và sinh ra chủ yếu qua đường tiêu hóa của người và động vật bị nhiễm bệnh. Chúng
dẫn đến các triệu chứng của bệnh sốt thương hàn (Salmonella typhi, Salmonella
paratyphi).

Hình 1.1.
salmonella
bằng kính

Hình chụp
( nhuộm màu đỏ)
hiển vi

Salmonella enterica serotype typhi(Salmonella typhi),thuộc nhóm huyết thanh D trong
phân lồi I của chi Salmonella, là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, Gram âm, gây nhiễm trùng
toàn thân và sốt thương hàn ở người. Các đặc điểm của S. typhicả về kiểu gen và về
kiểu hình giống với chi Salmonella.
1.1.2. Độc tố:
Độc lực của S. typhi rất phức tạp và đa yếu tố. Độc lực của S. typhi phụ thuộc vào khả
năng xâm nhập tế bào của nó và hình thành một lớp bảo vệ lipopolysaccharide (LPS),
sự hiện diện của kháng nguyên Vi, sản xuất và bài tiết invitro (gen xâm nhập), một loại

protein xâm nhập vào các tế bào không phân bào, nơi vi khuẩn có thể tồn tại và nhân
bản nội bào.
Các chủng Salmonella typhi tổng hợp hai loại tế bào phổ biến đối với mầm bệnh
đường ruột là aerobactin và enterochelin.
Sản sinh độc tố bao gồm enterotoxin, là một trong nhiều yếu tố độc lực biểu hiện bởi
các chủng S. typhi. Nó tạo ra một nội độc tố có cấu trúc tương tự như độc tố tả và cũng
làđộc tố tế bào, tương tự như độc tố ruộtdo Yersinia enterocolitica sản xuất.
3


Một yếu tố độc lực cực kỳ quan trọng và rất khác biệt của S. typhi là sản xuất kháng
nguyên Vi. Kháng ngun Vi đóng vai trị quan trọng trong sinh bệnh học của S. typhi
trong thời gian sống sót trong đại thực bào và trong máu.
1.1.3. Các nguồn lây nhiễm:
Salmonella typhi là một mầm bệnh có đặc điểm sống trong các mô bạch huyết của ruột
non, gan, lá lách, và máu của người bị nhiễm bệnh. Nó có phổ biến ở các nước đang
phát triển có hệ thống vệ sinh kém, thiếu thuốc kháng sinh như các nước ở châu Á,
châu Mỹ Latinh, châu Phi.
Salmonella typhi gây ra bệnh thương hàn, là một chứng sốt bệnh tồn thân. Nó lây qua
đường phân - miệng, chủ yếu qua thức ăn và nước bị ô nhiễm. Những người bị sốt
thương hàn có thể mang vi khuẩn trong máu và đường ruột. Một số lượng nhỏ (1-5%)
những người khỏi bệnh nhưng vẫn tiếp tục nuôi dưỡng vi khuẩn trong túi mật của họ
như một ổ chứa cho những mầm bệnh và lại tiếp tục lây lan sang người khác. Cả người
bệnh và người mang mầm bệnh đều nhiễm S. typhi trong phân. Do đó, sự lây nhiễmS.
typhi là phổ biến do ăn thức ăn hoặc uống đồ uống đã được xử lý bởi một người để rơi
S. typhi hoặc vật dụng có chứa vi khuẩn vào nước dùng để uống hoặc rửa thực phẩm.
Sốt thương hàn phổ biến hơn ở những nơi ít thường xuyên rửa tay vànguồn nước có
khả năng bị nhiễm bẩn từ cống rãnh.
1.1.4. Triệu chứng:
Sốt thương hàn là một căn bệnh ngấm ngầm với đặc điểm là sốt, nhức đầu, táo bón,

khó chịu, ớn lạnh và đau cơ và có ít các đặc điểm lâm sàng giúp phân biệt một cách
chính xác với nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác. Biểu hiện bệnh nặng (bao gồm sốc
nhiễm trùng), là xuất huyết hoại tử các mảng Peyer ở hồi tràng (PP), dẫn đến mô
thủng, viêm phúc mạc, nhiễm trùng huyết và tử vong. Cơ chế sinh bệnh của sốt thương
hàn phụ thuộc vào kích thước chất cấy của các tế bào S. typhi ăn vào, độc lực của
chủng, phản ứng miễn dịch của vật chủ và sự tiếp xúc trước đó.
Các triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh này thường bao gồm đột ngột sốt cao, nhức
đầu và buồn nôn. Các triệu chứng phổ biến khác bao gồm chán ăn, tiêu chảy, đau
bụng, lá lách to (tùy thuộc vào vị trí của nó), và táo bón, tiến triển thành sốt, và xuất
hiện các nốt đỏ trên thân. Thời gian tiến triển đến biểu hiện lâm sàng đầu tiên chậm,
dao động từ 3 đến 56 ngày, với 10–20 ngày là điển hình hơn. Có thể phân lập được
mầm bệnh dễ dàng từ máu và nước tiểu trong giai đoạn trước của bệnh. Cơn sốt có thể
kéo dài vài tuần, trong thời gian đó vi khuẩn đến túi mật và nhân lên trong mật.
Nhiễm khuẩn Salmonella typhi trong túi mật có thể dẫn đến tái nhiễm trùng đường
ruột khi dịch mật giàu mầm bệnh chảy ra vào ruột non. Từ đó gây viêm, loét và hoại tử
hồi tràng. Điều này thường xảy ra trong tuần thứ ba bị bệnh và được đánh dấu bằng
4


tiêu chảy ra nước. Xuất huyết các vết loét cuối cùng có thể dẫn đến tiêu chảy ra máu
và thủng ruột tiềm ẩn, dẫn đến viêm phúc mạc và nhiễm trùng huyết, đây là nguyên
nhân tử vong phổ biến nhất trong bệnh sốt thương hàn. Sự tiến triển của bệnh này phổ
biến ở ít hơn 5% người bệnh; tuy nhiên nó có tỷ lệ tử vong là 40%, có thể tăng lên
83% nếu trì hỗn điều trị hơn 96 giờ.
1.1.5. Biện pháp phịng ngừa
Vì S. typhi chỉ giới hạn ở người với tư cách là vật chủ của nó và sự lây truyền phổ biến
qua đường nước hơn là qua đường thực phẩm, nên các biện pháp kiểm soát hơi khác
so với các biện pháp áp dụng cho Salmonella ở phạm vi rộng.
 Vệ sinh cá nhân tốt và biết cách thực hành xử lý thực phẩm là chìa khóa để kiểm
soát mầm bệnh quan trọng này.

 Cần phải nhấn mạnh vào việc xác định những người mang S. typhi mãn tính và loại
họ ra khỏi q trình xử lý và sản xuất thực phẩm.
 Ngoài ra, cần chú trọng việc sử dụng nước uống trong sản xuất và việc chế biến các
loại thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm tươi sống.
Điều trị Salmonella typhi:
 Thuốc truyền thống được lựa chọn là chloramphenicol, ampicillin, amoxicillin hoặc
các hợp chất sulfa, chẳng hạn như trimethoprim hoặc sulfamethoxazole.
 Cùng với điều trị kháng sinh, hỗ trợ các biện pháp như ngậm nước bằng đường
uống hoặc tĩnh mạch, truyền máu (nếu cần), tắm nước ấm, đắp bọt biển và chế độ
dinh dưỡng hợp lý đều quan trọng khơng kém trong việc kiểm sốt sốt thương hàn.
1.2. Tầm quan trọng của S. typhi
Sốt thương hàn là một bệnh rất nghiêm trọng mắc phải do lây truyền qua đường phânmiệng do ăn phải thức ăn hoặc nước bị ơ nhiễm. Nó phổ biến hơn ở trẻ em và thanh
niên và ở những khu vực đông đúc với điều kiện vệ sinh kém. Trên thế giới, tỷ lệ mắc
bệnh sốt ruột rất cao từ 100 trường hợp trên 100.000 người năm ở các khu vực Châu
Phi và Châu Những ước tính này có thể khơng chính xác lắm vì nhiều trường hợp
được điều trị theo kinh nghiệm, khơng có chẩn đốn, do báo cáo trường hợp khơng
nhất qn và xét nghiệm chẩn đốn khơng đầy đủ.
Khoảng 200–300 trường hợp nhiễm bệnh được báo cáo ở Hoa Kỳ mỗi năm, 80% trong
số đó xảy ra ở những du khách trở về từ các quốc gia lưu hành bệnh thương hàn. Bệnh
có thể do diều nguyên nhân gây ra nhưng vấn đề ngộ độc do thực phẩm bị nhiễm S.
typhi là đặc biệt đáng quan tâm nhất. Chính vì vậy việc sử dụng phương pháp phát
hiện một cách nhanh chóng S. typhi trong thực phẩm là một yêu cầu rất quan trọng.
Có rất nhiều phương pháp phân tích S. typhi tuy nhiên trong q trình tìm hiểu nhóm
5


em thấy được 5 phương pháp phân tích nổi trội nhất là Enrichment-ELISA, RT – PCR,
cảm biến sinh học ME, MULTIPLEX PCR, phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ
(FISH). Phương pháp Enrichment-ELISA Nghiên cứu này được thực hiện với mục
đích phát triển thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme sandwich dựa trên

kháng thể đơn dòng (sELISA) giúp phát hiện nhanh Salmonella typhi từ mẫu thực
phẩm và mẫu nước. RT – PCR (Realtime – PCR) là phương pháp phân tích dùng để
khuếch đại phân tử ADN in vitro, cho phép phát hiện sự tồn tại của Salmonella Typhy
trong thực phẩm hay không. Cảm biến sinh học ME là cảm biến khơng dây, có dao
động cộng hưởng và tần số cộng hưởng được kích hoạt và phát hiện thơng qua từ
trường. MULTIPLEX PCR sử dụng 2 mồi đặc hiệu tối ưu nhận diện đoạn gen đặc hiệu
invA và nuclease (nuc) đểphát hiện gen gây độc của S. typhi. Phương pháp FISH dựa
trên việc lai các đầu dị oligonucleotide có đánh dấu huỳnh quang với các mục tiêu cụ
thể trong tế bào và sử dụng RNA ribosome (rRNA) nhằm để phát hiện vi sinh vật
trong khoa học môi trường và y tế
1.3. Vì sao phải sử dụng các phương pháp phân tích Salmonella Typhy khác nhau
Salmonella nói chung và S. Typhi nói riêng là một trong những mối quan tâm hàng
đầu của kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm. Chúng ta ln tìm mọi cách để tối ưu hóa
việc định danh, định tính hay xác định sự có mặt của chúng trong thực phẩm cũng như
nguồn nước. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phân tích đối tượng S. Typhi, từ các
phương pháp nuôi cấy truyền thống cho đến hiện đại như PCR, Multix – PCR,
Realtime – PCR,… Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm khác nhau.
Tùy theo hồn cảnh, thời gian, mục đích hay điều kiện kỹ thuật mà chúng ta có thể đưa
ra lựa chọn phương pháp phù hợp nhất.

6


CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.1. Nghiên cứu 1: Enrichment-ELISA để phát hiện Salmonella typhi từ thực
phẩm và nước
2.1.1. Nội dung nghiên cứu:
Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích phát triển thử nghiệm hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzyme sandwich dựa trên kháng thể đơn dòng (sELISA) giúp phát hiện
nhanh Salmonella typhi từ mẫu thực phẩm và mẫu nước; tối ưu hóa các quy trình tăng

sinh sử dụng với sELISA để tăng độ nhạy phát hiện của xét nghiệm.
Nguyên liệu và phương pháp:
- Các chủng vi khuẩn:

 S. typhi (chủng SKST), một phân lập lâm sàng ban đầu thu được từ trường Cao
đẳng Y tế Christian (CMC), Vellore, Ấn Độ, đã được sử dụng trong nghiên cứu này
để tiêm chủng cho chuột, sản xuất hybriodoma và kháng huyết thanh ở thỏ.
 Các chủng vi khuẩn khác được sử dụng để xác định đặc tính của MoAbs và kháng
thể đa dòng (PoAbs) bao gồm 14 phân lập S. typhi, 12 chủng của 9 huyết thanh khác
của Salmonella bao gồm S. paratyphi A, S. typhimurium, S. livingstone, S.
strasbourg, S. schwarzengrund, 3 chủng Escherichia coli, 3 Proteus spp, 2 Yersinia
spp, và 9 loại vi khuẩn khác như Shigella flexneri và Pseudomonas aeruginosa
- Môi trường và điều kiện sinh trưởng
 Sử dụng môi trường Buffered peptone water (BPW) và brain heart infusion broth
(BHIB) để tiền tăng sinh
 Sử dụng môi trường Selenite F broth (SFB) và Rappaport-Vassiliadis broth (RVB)
để tăng sinh.
 BHI được sử dụng làm môi trường nuôi cấy sau tăng sinh để phân lập S. typhi bằng
phương pháp nuôi cấy.
 Thạch xylose lysine deoxycholate (XLD, Oxoid) và Thạch MacConkey được sử
dụng để cấy chọn lọc.
 S.typhi được nuôi trong chất lỏng broth và ủ ở 37℃ trong tối đa 24 giờ dưới điều
kiện lắc (150 vòng / phút). Các đĩa được ủ ở 37 ℃ trong 24 giờ. Số lượng vi khuẩn
được xác định bởi phương pháp đổ đĩa.
Phương pháp thực hiện:
- Tế bào lá lách của những con chuột BALB/c được miễn dịch với kháng nguyên lông
(H=d) của S.typhi hợp nhất với các tế bào u tủy Sp2/0. Dòng tế bào hybridoma đặc
7

hiệu cho kháng nguyên H=d được tạo thành và cổ trướng nổi lên đối với những dòng
này. Dịch cổ trướng kết tủa với amoni dung dịch sulphat và được thẩm tách chống lại
PBS. Nồng độ protein của MoAb tinh khiết một phần này xác định bằng phương pháp
của Lowry.
- Huyết thanh Hyperimmune với kháng nguyên trùng roi được nuôi ở thỏ trắng New
Zealand. Kháng huyết thanh được kết tủa bằng dung dịch amoni sunfat và dung dịch
kháng thể đã thẩm tách được tinh chế thêm bằng sắc ký lọc gel sử dụng Bio-Rad
matrix Bio A1.5 (từ đó được gọi là PoAb). Protein là ước tính bằng phương pháp của
Lowry.
- Sandwich ELISA: Phương pháp Sandwich ELISA được thực hiện bằng cách sử dụng
PoAb làm kháng thể bắt giữ và MoAb 2/56 làm kháng thể phát hiện. Giếng được phủ
PoAb (1 μg/100 μL) trong đệm cacbonat-bicacbonat trong 2 giờ ở 37 ℃ , tiếp theo là
khóa qua đêm (PBS với 1% BSA) tại 4℃. Các tế bào vi khuẩn đã được phép phản ứng
với các kháng thể trong 1 giờ ở 37℃. Tiếp theo là việc bổ sung MoAb 2/56 (kháng thể
phát hiện, 1 μg / giếng) và ủ bệnh trong 1 giờ. Để kiểm tra giới hạn phát hiện của xét
nghiệm, vi khuẩn S.typhi đã rửa sạch chính thức được thử nghiệm ở các dung dịch pha
loãng từ 103 -108 tế bào / mL. Phản ứng ELISA dương tính khi A490 của một mẫu lớn
hơn 2 lần giá trị của đối chứng âm tính.
- Ảnh hưởng của các mơi trường ni cấy tăng sinh chọn lọc và tiền tăng sinh khác
nhau trong sELISA
Vi khuẩn S. typhi được nuôi trong BPW, BHIB, RVB và SFB ở nồng độ 101-105 cfu /
mL và ủ trong 24 h. Trước khi phát hiện bởi sELISA sau 6 giờ hoặc 24 giờ, vi khuẩn bị
bất hoạt bởi gia nhiệt các mẫu cấy ở 96℃ trong 10 phút. Sự liệt kê vi khuẩn được thực
hiện bằng đếm đĩa.
- Cấy nhân tạo mẫu thực phẩm
Thịt hoặc thịt gà và rau lá xanh (100 g) từ nhà cung cấp bán lẻ ở địa phương rửa sạch
thủ công với 100 mL BPW. Các nước rửa được phân phối trong các bình định mức 10
mL và đơng lạnh ở -20 ℃. Mỗi mẻ thịt hoặc rau rửa sạch là kiểm tra sự hiện diện của
S. typhi bằng phương pháp nuôi cấy. Các mẫu sữa tươi và sữa đông được thu thập từ
thị trường sữa và thị trường địa phương tương ứng và được thử nghiệm cho sự hiện

diện của S. typhi bằng phương pháp nuôi cấy. Thịt gà rửa sạch, rau củ rửa sạch, sữa và
sữa đơng khơng có S. typhi đã được cấy S. typhi chủng SKST ở nồng độ 10-1, 100 ,
101và 102 cfu / mL. BPW (90 mL) đã được thêm vào 10 mL của các mẫu đã cấy và ủ
ở 37℃ để 24 giờ. Hai mẫu mỗi mẫu một mL được lấy ở 6 và 24 giờ ủ và gia nhiệt ở
96 ℃ trong 10 phút trước khi kiểm tra bằng sELISA.
8


- Lĩnh vực nghiên cứu
Mẫu thực phẩm (n = 30) và nước uống (n = 25) được kiểm tra sự có mặt của S. typhi
bằng Enrichment-ELISA và phương pháp ni cấy thông thường. Các mẫu thực phẩm
được lấy từ chợ địa phương gồm mẫu sữa (n = 10), rau lá xanh (n = 5), thịt (n = 10) và
gà (n = 5). Các mẫu nước được thu thập từ các khu vực khác nhau và các mẫu bao
gồm từ nguồn cấp nước công cộng (n = 15), cống hở (n = 10) và nước ngầm (n = 10).
Khi kiểm tra bằng Enrichment-ELISA, tất cả mẫu thực phẩm được tiền tăng sinh trong
BPW ở 37℃ trong 24 giờ với tỷ lệ 10:90 (w/v hoặc v/v). Mẫu nước từ nguồn cấp
nước công cộng và nước ngầm (100 mL) được lọc qua màng lọc (0,45 µm). Các bộ lọc
được lấy ra và cấy vào BPW (50 mL). Mẫu nước từ cống hở được ly tâm ở 2000 g
trong 15 phút để loại bỏ vật chất dạng hạt trước khi lọc. Môi trường được ủ ở 37 ℃
trong 24 giờ. 1 ml mẫu BPW tiền tăng sinh được làm nóng ở 96 ℃ trong 10 phút và
được thử nghiệm bằng ELISA.
Kết quả nghiên cứu:
- Sản xuất kháng thể đơn dòng và đa dòng:
Trong 4 dòng đặc hiệu đối với kháng nguyên H=d, dòng ( #2/56, IgG2a isotype) được
sử dụng trong phương pháp sELISA
- Sandwich ELISA:
Phương pháp Sandwich ELISA có giới hạn phát hiện là 104-105cfu của S. typhi như thể
hiện trong Hình 2.1. Dựa trên các giá trị OD được quan sát trong các giếng kiểm soát
âm (0,060-0,075), OD = 0,135 được lấy làm giá trị ngưỡng để xác định phản ứng
dương tính.

Hình 2.2. Độ nhạy của phương pháp sandwich ELISA để phát hiện S. typhi. (Đường
ngang thể hiện giá trị ngưỡng cho sELISA)

- Ảnh hưởng của các môi trường tiền tăng sinh khác nhau lên sELISA
Sau khi tăng sinh sơ bộ trong 6 giờ trong BPW và BHIB, cách nuôi cấy truyền thống
9


S. typhi tăng 1-2 log từ nồng độ ban đầu (Bảng 2.1). Sau 24 giờ, tăng lên 108-109cfu /
mL. Khi S. typhi phát triển từ cả hai môi trường này đã được kiểm tra bởi sELISA,
khơng có sự khác biệt đáng kể trong các giá trị OD đã được quan sát giữa hai môi
trường ở cả 6 giờ và 24 giờ (P> 0,05).Tuy nhiên, độ hấp thụ sau 6 giờ tăng trưởng
trong BPW cao hơn một chút so với BHIB.
BẢNG 2.1. Định lượng S. typhi trong các môi trường tiền tăng sinh khác nhau để phát
hiện bằng sELISA

- Ảnh hưởng của các môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau đối với sELISA
Sự phát triển của vi khuẩn S. typhi là kém trong SFB và RVB sau 6 giờ ủ. Không quan
sát thấy sự tăng trưởng dù chỉ 1 log sau 6 giờ và sự gia tăng này khơng có ý nghĩa
(P>0,05). Nuôi cấy truyền thống tăng lên 107-108 cfu/ml sau 24 giờ tăng trưởng. Khi
được kiểm tra bằng sELISA, vi khuẩn S. typhi phát triển đến nồng độ 105cfu/mL sau 6
giờ trong SFB. Sau 24 giờ ủ, các giá trị OD được tìm thấy là nhỏ hơn 1. S. typhi phát
triển từ RVB ở nồng độ 108 cfu / mL chỉ có thể được phát hiện bằng sELISA (Bảng 2).

BẢNG 2.3. Định lượng S. typhi trong các chất lỏng tăng sinh khác nhau để phát hiện
bằng sELISA

- Phát hiện S. typhi trong nuôi cấy tăng sinh của các mẫu thực phẩm được cấy nhân tạo
bằng sELISA

Có thể phát hiện 102 cfu / mL S. typhi sau 6 giờ phát triển trong BPW. Ngoại trừ nước
rửa rau, có thể phát hiện ít nhất 2 vi khuẩn trên 10 ml mẫu tất cả thực phẩm được cấy
nhân tạo sau 24 giờ tăng trưởng trong BPW.

10


BẢNG 2. 3. Phát hiện S. typhi trong các mẫu thực phẩm khác nhau bằng EnrichmentELISA

- Lĩnh vực nghiên cứu
Ngoại trừ mẫu nước ngầm cho OD là 0,225 từ việc tăng sinh BPW trong 24 giờ sau 24
giờ, khơng có mẫu thực phẩm hoặc mẫu nước nào cho kết quả trong OD hơn 0,1 bằng
Enrichment-ELISA. Tất cả các mẫu xét nghiệm âm tính bằng phương pháp ni cấy
truyền thống.
2.2. Nghiên cứu 2: Phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trong trứng bị ô
nhiễm bằng cách sử dụng RT - PCR
2.2.1. Tổng quan:
RT – PCR (Realtime – PCR) là phương pháp phân tích dùng để khuếch đại phân tử
ADN in vitro, cho phép phát hiện sự tồn tại của Salmonella Typhy trong thực phẩm
hay không.
RT - PCR là một phương pháp thay thế để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh từ thực
phẩm trong đó có Salmonella Typhy. Phương pháp RT – PCR được cho là có độ nhạy
và độ đặc hiệu cao so với phương pháp PCR thông thường và thời gian cần thiết nhanh
hơn các phương pháp truyền thống hoặc phương pháp nuôi cấy (Dorak, 2006;
Drahovská và cộng sự, 2001; Liu, 2010).
Do đó, phương pháp này có thể được sử dụng cho các phịng thí nghiệm pháp y
hoặc phịng thử nghiệm thực phẩm với số lượng mẫu nhỏ và cung cấp kết quả nhạy,
nhanh chóng.
Năm 2019, Muktiningsih Nurjayadi cùng các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu:
Phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella typhi trong trứng bị ô nhiễm bằng cách sử dụng

RT - PCR
2.2.2. Nguyên liệu nghiên cứu
Trứng là thực phẩm thường bị nhiễm khuẩn Salmonella Typhi do đặc tính là mơi
trường phù hợp cho chúng phát triển và sinh sản. S. Typhi từ đất xâm nhập vào bên
trong vỏ trứng, tại đây chúng được lòng trắng trứng bảo vệ khỏi các tác nhân gây ảnh

11


hưởng khác (Buck và cộng sự, 2003).
2.2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Phân tích RT – PCR nhìn chung bao gồm các bước
 Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng PCR với sự có mặt của mẫu dị huỳnh quang
 Gắn mẫu dò huỳnh quang trong mỗi chu trình khuếch đại
 Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự kích thích trong mỗi chu trình
 Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang
 Phân tích số liệu (theo TCVN11133:2015)
2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu ni cấy
Các mẫu cấy vi khuẩn S. Typhi được nuôi trong 24 giờ trong môi trường đặc hiệu SSA
(Merck) ở 37°C trong đĩa bằng phương pháp phết. Các dòng vi khuẩn được hình thành
khuẩn lạc sau đó được ni cấy qua đêm (18 giờ) trong môi trường Luria Broth
(Deben Diagnostics.Ltd) ở 37°C bằng cách sử dụng tủ ấm.
Đối với các mẫu trứng bị nhiễm vi khuẩn S. Typhi nhân tạo, pha loãng dung dịch
từhuyền phù qua đêm của S. Typhi. Để xác định số lượng khuẩn lạc bị nhiễm trong các
mẫu trứng, 1 mL huyền phù pha loãng ở các nồng độ 10− 4, 10− 5 và 10− 6 được nuôi
trong môi trường SSA (Merck) bằng phương pháp đĩa phết và ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Huyền phù được chọn để tính tốn nồng độ vi khuẩn là huyền phù tạo ra một số khuẩn
lạc từ 30 đến 300 dựa trên tiêu chuẩn đếm đĩa của FDA BAM (Sổ tay phân tích vi
khuẩn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm).
Số lượng khuẩn lạc hình thành được tính bằng CFU/mL nuôi cấy.

2.2.3.2 Mẫu trứng nhân tạo nhiễm S. Typhi
Trứng được mua ở chợ, sau đó luộc chín và nghiền mịn vô trùng. Chuyển mẫu trứng
sang đĩa và chiếu tia UV trong 30 phút. Mẫu trứng được làm nhiễm huyền phù vi
khuẩn theo tỉ lệ thể tích 1:1.Các mẫu thử nghiệm sử dụng huyền phù vi khuẩn ở độ pha
loãng 10-6. Mỗi mẫu được ủ ở 37°C trong 18 giờ bằng tủ ấm.
2.2.3.3 Phân lập DNA
Lấy mỗi nguồn nuôi cấy, mẫu đối chứng dương tính, mẫu thử nghiệm và mẫu đối
chứng âm tính 1mL và chuyển vào ống Eppendorf, ly tâm với tốc độ 5000vòng/ phút
trong 5 phút để tạo cặn. DNA của vi khuẩn được phân lập từ các cặn hình thành bằng
bộ kit thương mại từ QIAamp DNA Mini Kit (ATL, AL, AW1, AW2, AE buffer).
Độ tinh khiết của DNA phân lập được đo ở tỷ lệ A260/A280 và nồng độ DNA bằng
máy quang phổ GE Nanovue Uv –Vis.
12


2.2.3.4 Tiến hành các thử nghiệm đo đạc
 Kiểm tra xác nhận nuôi cấy vi khuẩn Salmonella Typhi
 Thử nghiệm độ nhạy và độ đặc hiệu của mồi fim-C đối với Salmonella Typhi từ
nuôi cấy gốc
 Kiểm tra xác nhận mồi của fim-C đối với mẫu trứng bị nhiễm bẩn
2.2.4. Kết quả
Độ tinh khiết và nồng độ của DNA được phân lập từ nuôi cấy gốc và các mẫu trứng
bị nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi bằng cách sử dụng Máy quang phổ GE
Nanovue UV-VIS được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 4.4. Độ tinh khiết và nồng độ DNA phân lập được của mẫu nuôi cấy gốc và mẫu
trứng bị nhiễm vi khuẩn S. typhi.

Hình ảnh hóa các kết quả của quá trình mồi DNA trong quá trình khuếch đại.
Các dải DNA được tạo ra ở khoảng nhiệt độ 56°C đến 61°C khi so sánh với thang
DNA có kích thước bằng 95 cặp bazơ được thể hiện trong Hình 2.2

Hình 5.2. Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ ủ mồi của gen fimC S. Typhi

(1) Thang DNA 100 bp; (2) Kiểm soát tiêu cực;(3) Đoạn ADN ở nhiệt độ 56 ° C;(4)
Đoạn DNA ở nhiệt độ 57 ° C;(5) Đoạn DNA ở nhiệt độ 58 ° C;(6) Đoạn DNA ở nhiệt
13


độ 59 ° C;(7) Đoạn DNA ở nhiệt độ 60 ° C; (8) Nhiệt độ đoạn DNA 61 ° C.

Hình 6.3. Đường cong khuếch đại của nuôi cấy dự trữ vi khuẩn S. typhi với mẫu DNA
nồng độ 56 nanogam và đối chứng âm tính

Hình 7.4. Đường cong nóng chảy (melting curve) của S. typhi nuôi cấy với mẫu DNA 56
nanogam

Kết quả cho thấy độ nhạy của cặp mồi Salmonella Typhi fimC-F (mồi thuận) và fimCR (mồi ngược) có thể phát hiện các mẫu DNA có nồng độ thấp nhất là 4528 pg / μL và
đường cong khuếch đại ở nồng độ nhỏ nhất. ở giá trị Ct 23,90 (Hình 4)

Hình 8.5. Đường cong khuếch đại và đường cong kiểm tra độ nhạy đối với gen fimC

14


Salmonella typhi.

Hình 9.6. Đường cong khuếch đại và đường cong nóng chảy trong đánh giá xác nhận
của fimC-F (mồi thuận) và fimC-R (mồi ngược) S. Typhi với ba mẫu trứng.

2.3. Nghiên cứu 3: Phát hiện trực tiếp Salmonella typhi trên sản phẩm tươi sống

bằng cách sử dụng cảm biến sinh học từ tính đàn hồi dựa trên phage.
Cảm biến sinh học ME là cảm biến khơng dây, có dao động cộng hưởng và tần số cộng
hưởng được kích hoạt và phát hiện thông qua từ trường.Cảm biến điều khiển giống hệt
với các cảm biến sinh học đo lường, nhưng không có phage. Cả hai cảm biến đo lường
và điều khiển đều bị chặn với BSA để giảm ràng buộc không xác định. Tần số cộng
hưởng của cảm biến đo lường và điều khiển được đo trước và sau khi đặt các cảm biến
trên cà chua. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được sử dụng để xác minh liên kết cụ
thể của S. typhi
2.3.1. Vật liệu và phương pháp
2.3.1.1 Chế tạo bệ cộng hưởng đàn hồi
Các bệ cộng hưởng đàn hi cú kớch thc bng 0,028mmì0,2mmì1mm c ch to
t METGLASđhp kim 2826MB. Các bệ cảm biến được làm sạch bằng siêu âm, đầu
tiên trong axeton, sau đó trong etanol, tiếp theo là ủ ở 220oC trong 2 giờ trong chân
không (10-3 Torr) để loại bỏ ứng suất dư. Sau khi ủ, hai lớp mỏng phim (Cr và Au)
được rải lên tất cả các mặt của bệ cảm biến. Lớp Cr được lắng đầu tiên để cải thiện độ
bám dính giữa bệ cộng hưởng ME và lớp Au. Lớp Au cung cấp một lớp bảo vệ chống
ăn mòn cho bộ cộng hưởng, và một bề mặt tương thích sinh học để cố định phage.
2.3.1.2 Sự cố định phage E2
Thực khuẩn thể được cố định trên bệ máy cộng hưởng ME, được đặt trong một lọ chứa
300μl huyền phù phage E2 (5×1011vir/ml trong 1×TBS). Sau đó được quay và ủ trên
rơto (8 vòng/phút) trong 1h. Sau khi cố định, các cảm biến được rửa ba lần bằng dung
dịch TBS và hai lần với nước cất vô trùng để loại bỏ muối và thực khuẩn thể không
liên kết hoặc lỏng lẻo.
Các cảm biến sinh học ME được nhúng vào dung dịch BSA 1mg/ml trong 1 giờ, sau
15


đó rửa bằng nước cất.Cảm biến điều khiển giống hệt cảm biến sinh học đo lường ngoại
trừ nó thiếu lớp phủ E2 phage, cả hai đều được xử lý bằng BSA.
2.3.1.3 Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Salmonella trên bề mặt cà chua

S. typhi mẫu cấy thu được từ phòng thí nghiệm được cung cấp dưới dạng huyền phù ở
nồng độ 5×108 CFU/ml. Các huyền phù được pha lỗng trong nước cẩn thận để chuẩn
bị cho các huyền phùvới nồng độ từ 5×101 đến 5×107 CFU/ml. Tất cả các giải pháp thử
nghiệm được chuẩn bị cùng ngày với thử nghiệm cảm biến sinh học, được lưu trữ ở
4◦C và được cân bằng về nhiệt độ phòng trong nồi cách thủy trước khi thí nghiệm.

Hình 10.7. Sơ đồ quy trình được sử dụng để phát hiện trực tiếp S. typhi trên bề mặt cà
chua bằng cảm biến sinh học ME.

Đường cong tần số cộng hưởng cho cảm biến sinh học ME và cảm biến điều khiển sau
khi tiếp xúc với bề mặt cà chua có gai và hình ảnh SEM tương ứng của bề mặt cảm
biến sinh học:

(a) Cà chua có 5×108 CFU/ml.

16


Hình 11.8

Hiển thị số
lượng lớn các tế bào Salmonella trên bề mặt cảm biến.

(b) Cà chua có 5×106 CFU/ml.
\

Hình 12.9 ảnh SEM hiển thị số lượng giới hạn nhỏ hơn Salmonella tế bào đến bề mặt
cảm biến.

(c) Cảm biến điều khiển tiếp xúc với cà chua có gai 5×10 8 CFU/ml. Lưu ý rất ít ơ liên

kết.
3. Kết quả
Do sự phân bố không đồng đều của Salmonella tế bào trên bề mặt cà chua, cảm biến
tiếp xúc với các tế bào, số lượng tế bào liên kết sẽ phụ thuộc vào vị trí mà cảm biến rơi
trên bề mặt cà chua. Điều này có nghĩa là phản ứng của một cảm biến sinh học duy
nhất được đặt trên bề mặt cà chua có thể khơng đưa ra dấu hiệu chính xác về việc cà
chua có bị ơ nhiễm hay khơng. Do đó, cần phải áp dụng nhiềucảm biến sinh học ME
cho các vùng khác nhau của cà chua.

17


Hình 13.10. Ảnh chụp SEMphotomicrograph của bề mặt cà chua có gai Salmonella

Nồng độ của (a) 5×108 CFU/ml, (b) 5×106 CFU/ml và (c) 5×103 CFU/ml, và (d) bề mặt
cà chua tươi. Sự phân bố củaSalmonella các tế bào trên bề mặt cà chua trở nên không
đồng nhất khi nồng độ giảm.
Chú thích:
Sự thay đổi tần số cộng hưởng của cảm
biến sinh học ME đo lường
Sự thay đổi tần số cộng hưởng của các
cảm biến điều khiển.

Hình 14.11. Sự thay đổi đo được trong tần số cộng hưởng của cảm biến sinh học ME và
cảm biến điều khiển sau khi tiếp xúc với bề mặt cà chua tăng đột biến với các nồng độ
khác nhau của Salmonella.

Đối với nồng độ 5×102 CFU/ml và cao hơn, đã đo được sự khác biệt thống kê (> 80%)
giữa các cảm biến kiểm soát và đo lường, cho thấy rằng cà chua đã bị nhiễm bẩn đã
được xác định.

4. Kết luận
Bề mặt cà chua có gai với các chất huyền phù chứa Salmonella với nồng độ từ 5×101
đến 5×108 CFU/ml. Salmonella trên bề mặt cà chua trở nên không đồng đều hơn khi
nồng độ của dung dịch chiết xuất giảm. Sự thay đổi tần số cộng hưởng của các cảm
biến sinh học đo lường, trong khi sự thay đổi tần số cộng hưởng của cảm biến điều
khiển là khơng đáng kể. Hình ảnh SEM xác minh rằng sự thay đổi tần số của các cảm
biến đo lường phù hợp với ràng buộc cụ thể của Salmonella vi khuẩn đến các bề mặt
cảm biến sinh học.

18


2.4. Nghiên cứu 4: Nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật Multiplex Pcr trong phát
hiện vi khuẩn Salmonella sp.s. enterica gây ngộ độc thực phẩm
2.4.1. Nội dung nghiên cứu
Theo nghiên cứu của Freitas và cộng sự của mình vào năm 2010 đã sử dụng phương
pháp multiplex PCR để phát hiện nhanh sự hiện diện của vi khuẩn S. enteritidis và S.
typhinurium xuất hiện trong thịt gia cầm thông qua gen xâm lấn invA [1]. Do đó,
nghiên cứu này nhằm hướng đến việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn
Salmonella sp. và Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR, tìm kiếm
phương pháp sử dụng 2 mồi đặc hiệu tối ưu nhận diện đoạn gen đặc hiệu invA và
nuclease đểphát hiện gen gây độc của vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus
aureus. Đây được cho là kỹ thuật ứng dụng một cách nhanh chóng và đơn giản, có độ
nhạy cao. Nó có thể đồng thời khuếch đại hai hay nhiều chuỗi gen trong phản ứng
tương tự nhằm phát hiện một loạt các tác nhân gây bệnh chỉ trong một phép phân tích.
2.4.2. Nguyên liệu nghiên cứu
Các loại thực phẩm tươi sống như thịt gia cầm như thịt gà, thịt động vật như thịt bò,
trứng và sò huyết được bày bán ở các chợ lại không đảm bảo được chất lượng vệ
sinh.Trong số các nhóm có nguy cơ tạp nhiễm cao, nhóm vi khuẩnđược nghi ngờ có
thể nhiễm nhiều nhất làCampylobacter, Coliforms, Vibrio spp. Staphylococcus

sp.Salmonella, Escherichia coli. Chúng thường được chú ý vì xuất hiện thường xuyên
trong thực phẩm. Đặc biệt đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus
aureus là ví dụ điển hình cho vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây bệnh phổ biến
hiện nay và có nguy cơ cao dẫn đến việc kháng kháng sinh trong điều trị bệnh truyền
nhiễm
2.4.3. Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR đối
với 2 loại vikhuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus
DNA tổng số được tách chiết từ vi khuẩn Salmonella sp. và Staphylococcus aureus có
các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 thường được sử dụng làm khuôn cho phản
ứng multiplexPCR. Ngưỡng phát hiện của phản ứng được xác định là nồng độ DNA
thấp nhất mà vẫn cho phép hình thành được vạch sản phẩm PCR xuất ra trên hình ảnh
điện di. Phản ứng multiplex PCR được xem là dương tính (+) khi xuất hiện cả hai vạch
sản phẩm PCR 284bp và 439bp trên bản điện di gel agarose 1%.
2.4.4. Kết quả nghiên cứu
Qua nghiên cứu cho thấy ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR được xác
định là nồng độ DNA đạt mức thấp nhất ở 300 CFU/mL đối với Salmonella sp. Và đạt
70 CFU/mL đối với S. aureus mà nó vẫn cho phép nhận diện sản phẩm khuếch đại
DNA từ phản ứng PCR qua điện di agarose 1% . Khi nồng độ khuôn của Salmonella
19