Khảo sát khả năng ức chế enzyme polyphenol oxidase từ thực vật

Đề tài: Khảo sát khả năng ức chế
enzyme Polyphenol oxidase từ thực vật


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU..................................................................................................................................1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................................2
I.

Đặt vấn đề..........................................................................................................................2

II. Tổng quan..........................................................................................................................2
1.

Các enzyme................................................................................................................2

2.

Rau răm (Persicaria odorata).....................................................................................3

3.

Rau đắng (polygonum aviculare)...............................................................................5

TRIỂN KHAI THÍ NGHIỆM..........................................................................................................9
I.

Điều chế cao mẫu thí nghiệm............................................................................................9
1. Điều chế cao cồn...........................................................................................................9
2. Điều chế cao nước.........................................................................................................9

II. Tách chiết enzyme polyphenol oxidase (từ củ khoai tây)...............................................10
III. Xây dựng đường chuẩn...................................................................................................10
1.

Tiến hành kiểm hoạt tính của cao mẫu....................................................................10

2.

Tiến hành đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính........................................11

IV.

Kết quả và biện luận....................................................................................................12
1.

Điều chế cao mẫu thí nghiệm..................................................................................12

2.

Xây dựng đường chuẩn............................................................................................12

3.

Kết quả đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính............................................13

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................16


LỜI MỞ ĐẦU
Một chế độ ăn uống hợp lý giúp cung cấp cho cơ thể có đủ năng lượng hoạt động hằng

ngày và sức đề kháng chống lại các bệnh tật. Một bữa ăn cân đối cần có đủ các nhóm
thức ăn: nhóm đường bột (các loại ngũ cốc), nhóm chất đạm (thịt, cá, trứng, sữa,…),
nhóm chất béo (dầu thực vật và động vật), nhóm vitamin và khống chất (các loại trái
cây, rau, củ,..). Trong đó, đặc biệt là nhóm vitamin và khoáng chất là các chất thiết yếu
của cơ thể. Tuy cơ thể chỉ cần một lượng nhỏ nhưng lại rất quan trọng để giúp cơ thể phát
triển khỏe mạnh.
Vitamin thường có trong các loại trái cây, một loại trái cây được đa số người dân ăn
thường ngày để bổ sung vitamin là táo. Nhưng ngày nay, con người khơng chỉ quan tâm
đến dinh dưỡng mà cịn có sự quan tâm đặc biệt đối với thẩm mỹ của thực phẩm. Bạn
nghĩ thế nào nếu cuối bữa ăn trong gia đình có một đĩa táo bị thâm đen? Tuy dinh dưỡng
trong táo không bị ảnh hưởng nhưng về mặt thẩm mỹ lại hồn tồn khơng có. Hiện nay có
nhiều cách để giúp táo không bị thâm đen như: ngâm táo vào nước chanh, nước muối,
rượu gừng, bọc táo bằng màng bọc thực phẩm,…Ngồi những phương pháp trên nhóm
em muốn tìm thêm phương pháp khác để giúp cải thiện vấn đề trên.


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.

Đặt vấn đề:
Polyphenol oxydase (PPO) là một loại enzyme rất phổ biến trong thực phẩm sử dụng
hàng ngày của chúng ta, chúng xúc tác cho quá trình oxi hóa phenol thành quinone, có
màu nâu nhạt. Việc biến đổi này không làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của thực
phẩm nhưng lại làm giảm đi tính cảm quan, khiến người ăn cũng khơng cịn thấy ngon.
Mặc dù hiện tại đã có rất nhiều cách đều có thể ngăn được oxi hóa như dùng nước muối,
nước uống có ga, nước chanh,… Chưa thỏa mãn với những phương pháp hiện tại, nhiều
người thắc mắc rằng: Có thể dùng thực vật để ức chế hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa
này? Vì điều đó mà nhóm chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mục tiêu: Khảo sát khả năng
ức chế enzyme polyphenol oxydase từ thực vật. Từ đó có thêm giải pháp để ngăn chặn sự
oxi hóa của phenol để thành quinone.

Thơng qua một thí nghiệm vui đơn giản nhóm chúng tôi quyết định sử dụng cao cồn và
cao nước được chiết từ rau răm, rau đắng để thử khả năng ức chế sự oxi hóa có enzyme
polyphenol oxydase làm chất xúc tác.

II.

Tổng quan:

1. Các enzyme:
- Enzyme Polyphenol Oxydase (PPO hoặc monophenol monooxygenase hoặc polyphenol
oxydase 1-chloroplastic) là một tetramer có chứa 4 nguyên tử Cu trên mỗi phân tử và các
vị trí liên kết cho 2 hợp chất thơm.
- Polyphenol Oxidase gồm monophenol oxydase và diphenol oxydase (gồm: o-diphenol
oxydase và p-diphenol oxydase). Trong đó, monomphenol oxydase giúp thủy phân gốc
monophenol tạo thành gốc o-diphenol oxydase.
- Tuy nhiên, khi polyphenol oxydase gặp khơng khí trở thành o-quinone, bản thân của oquinone này khơng có màu nâu, nhưng vì tiếp tục phản ứng với các amino acid và khơng
khí mà tạo ra melanin – chất được tạo ra từ các loài thực vật sẽ có màu nâu.


2. Rau răm (Persicaria odorata):
Là một loài thực vật ăn được thuộc họ Polygonaceae – họ thân đốt/họ Rau răm, đây là loài
cây thân thảo, lá của chúng được sử dụng rộng rãi trong các bữa ăn của khu vực Đơng
Nam Á. Đây là một lồi cây lưu niên, sinh trưởng tốt ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới trong điều kiện nóng ẩm. Mặt trên của lá có màu xanh sẫm, có một chút đốm màu nâu
nhạt, mặt dưới màu hung đỏ, thân có đốt.

Hình 1. Rau râm


Trong tinh dầu của rau răm người ta đã tìm thấy các chuỗi aldehyd chuỗi dài

như:
- Decanal chiếm 28% trong tinh dầu rau răm. Decanal là một hợp chất hữu cớ có cơng
thức hóa học C10H20O. Decanal xuất hiện trong tự nhiên như ở trong Chi Citrus (thực vật
có hoa và cây bụi thuộc họ Rue, Rutaceae), cùng với octanal (hợp chất hữu cơ – với tính
chất vật lý như đây là một chất lỏng, có mùi, khơng màu; là một thành phần trong nước
hoa), citral (đây có thể là một hợp chất hữu cơ của terpenoid với cơng thức hóa học
C10H16O), và sinensal (cơng thức hóa học C15H22O), hay ở trong kiều mạch,và trong tinh
dầu rau mùi nó được sử dụng trong nước hoa và hương liệu.

Hình 2. Cơng thức cấu tạo Decanal


- Dodecanal chiếm 44% trong tinh dầu răm răm. Dodencanal còn được gọi là lauraldehyde
hoặc dodecyl aldehyde, là một hợp chất hữu cơ có cơng thức hóa học CH3(CH2)10CHO.
Đây là một chất lỏng không màu, là một thành phần của nhiều loại nước hoa. Trong tự
nhiên thương có trong các loại dầu cây có múi.

Hình 3. Cơng thức cấu tạo Dodecanal
- Decanol chiếm 11% trong tinh dầu rau răm. Đây là một chuỗi fatty alcohol, có cơng thức
hóa học là C10H21OH, tồn tại trong tự nhiên có màu vàng, chất lỏng nhớt, khơng hịa tan
trong nước và có mùi thơm. Decanol có thể được điều chế bằng cách hydro hóa Acid
Decanoic (còn được gọi là Capric hoặc Acid Decylic, là một acid béo bão hịa, có cơng
thức hóa học là CH3(CH2)8COOH), q trinhg hydro hóa xảy ra một số ít trong dầu
dừa (khoảng 10%) và dầu hạt nhân Palm (một loại dầu thực vật ăn được có nguồn gốc từ
hạt nhân của cọ dầu Elaeis guineensis) (khoảng 4%). Nó cũng có thể được sản xuất tổng
hợp qua q trình Ziegler (phương pháp để sản xuất rượu béo từ ethylene, sử dụng hợp
chất organoaluminium)

Hình 4. Cơng thức cấu tạo Decanol

- Ngồi ra trong tinh dầu rau răm cịn tìm thấy các sesquiterpene gồm: α-humulene (còn
được gọi là α-humulene hoặc α-Caryophyllene, là một monocyclic sesquiterpene tự nhiên,
cơng thức hóa học là C15H24, được tìm thấy hầu hết ở trong tinh dầu), β-caryophyllene
chiếm khoảng 15% trong tinh dầu.


Hình 5. Cơng thức cấu tạo α-Caryophyllene

Hình 6. Cơng thức cấu tạo Beta – caryophyllene
3. Rau đắng (polygonum aviculare):
Hay có người cịn gọi là cây càng tơm, cây xương cá hoặc rau đắng, danh pháp khoa học:
Polygonum aviculare là một loài thực vật thuộc họ Rau răm. Rau đắng là một loài cây
thân thảo, lưu niên, được ứng dụng nhiều trong y tế, trong Đông y được sử dụng như một
phương thuốc có cơng dụng lợi tiểu, sát trùng, viêm bàng quan, sỏi niệu đạo, bí đái, đái
buốt, trĩ, kiết lỵ, lở ngứa ngoài da, vàng da tắc mật,…Trong Tây y, rau đắng cịn có tác
dụng hạ huyết áp, tăng cường hô hấp, tăng thời gian đông máu,…


Hình 7. Rau đắng


Thành phần hóa học chính trong rau đắng gồm:
- Tanin chiếm 0,35% trong rau đắng, là một hợp chất polyphenol có trong thực vật. Các
hợp chất tanin có rất nhiều trong nhiều lồi thực vật, chúng có vai trị bảo vệ khỏi bị các
lồi ăn chúng, và có lẽ cũng có tác dụng như thuốc trừ sâu, và điều hòa sinh trưởng của
thực vật. Chất chát từ tanin tạo ra cảm giác khô và puckery trong miệng sau khi ăn trái cây
chưa chín hoặc rượu vang đỏ. Cũng vì thế, sự phân hủy tanin theo thời gian đóng vai trị
quan trọng trong việc làm cho trái cây chín và ủ rượu vang. Trong một số trường hợp bị
nhiễm trùng vì rắn độc cắn thì các bác sĩ thường dùng chất này để làm giảm sự nhiễm
trùng của vết thương do tanin tạo thành chất kết tủa với protit của nọc rắn. Tanin có tác

dụng khử các gốc tự do, ngăn ngừa bện tim, có khả năng chơng oxy hóa và ngăn ngừa ung
thư.


Hình 8. Cơng thức cấu tạo Acid tanic - cũng là 1 tanin
- Vitamin C hay còn gọi là acid ascorbic là một loài dinh dưỡng thiết cho các loài linh
trưởng bậc cao và cho một số nhỏ các loài khác. Sự hiện diện của ascorbic là cần thiết
trong một loạt các phản ứng trao đổi chất trong tất cả các động vật và cây cối và
được được tạo ra trong cơ thể bởi hầu như tất cả các cơ thể sinh vật, loại trừ loài người,
khỉ, cá heo do thiếu enzyme đặc hiệu xúc tác chuyển hóa Glucose thành Vitamin C. Đây là
một chất được mọi người biết đến rộng rãi là một vitamin mà thiếu nó thì sẽ gây ra bệnh
scorbut cho con người

Hình 9. Cơng thức cấu tạo Acid Ascorbic
- Flavonoid (hoặc bioflavonoid) là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy
nhiên một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại khơng có màu.
Nhóm Flavonoid trong rau đắng gồm có:
+ Avicularin là một flavonol hoạt động sinh học, được phân lập từ một số loài thực
vật như polygonum aviculare, Rhododendron aureum và Taxillus kaempferi.


Hình 10. Cơng thức cấu tạo Avicularin
+ Juglanin là một flavonoid được tìm thấy trong polugunm aviculare

Hình 11. Cơng thức cấu tạo Juglanin
+ Astragalin là một hợp chất hóa học đã được phân lập từ phytolacca americana
hoặc trong chiết xuất methanolic của Fronds của dương xỉ Phegopteris connectilis. Nó
cịn được tìm thấy trong rượu vang.

Hình 12. Cơng thức cấu tạo Astragalin

+Aviculin là một Lignan, được cô lập từ Pseudocydonia sinensis và Polygonum
aviculare.

Hình 13. Cơng thức cấu tạo Aviculin
TRIỂN KHAI THÍ NGHIỆM
I.

Điều chế cao mẫu thí nghiệm:

1. Điều chế cao cồn:
Rửa sạch mẫu, để ráo nước. Cân mẫu, giã nhuyễn thêm cồn 96 0 như bảng 1. Lọc lấy dịch
trích, bảo quản ở 200C.
Mẫu vật
Rau râm
Rau đắng
Khối lượng (g)
25
40
o
Cồn 96 (ml)
25
40
Bảng 1. Mẫu vật thí nghiệm điều chế cao cồn

2. Điều chế cao nước:
Rửa sạch mẫu, để ráo nước. Cân mẫu, giã nhuyễn thêm nước cất như bảng 2. Lọc lấy dịch
trích, bảo quản ở 200C.

Mẫu vật
Khối lượng

Rau râm
15

Rau đắng
50

(g)
Nước cất

15

50

Bảng

2.

(ml)

Mẫu

vật thí nghiệm điều chế cao nước
II.

Tách chiết enzyme polyphenol oxidase (từ củ khoai tây):
Rửa sạch mẫu, đem xay nhuyễn với nước cất. Lấy 25 ml dịch mẫu xay thêm 25 ml cồn

960, đem đi ly tâm 6000 vòng/phút. Xong thu lấy cặn thêm 10 ml nước cất, tiếp tục đem ly
tâm 6000 vòng/ phút. Xong thu lấy dịch.

III. Xây dựng đường chuẩn:
Tiến hành chuẩn bị các ống nghiệm như bảng 3. Rồi tiến hành đo OD ở bước sóng 260 nm.
Vẽ đồ thị biểu diễn đường chuẩn.
Ống nghiệm
Tyrosin 1 mM

0
0

1
0.2

2
0.4

3
0.6

4
0.8

5
1

(ml)
HCl 0.2 N (ml)
NaOH 0.5 N

1
2

0.8
2

0.6
2

0.4
2

0.2
2

0
2

(ml)
Bảng 3. Số liệu tiến hành xây dựng đường chuẩn

1. Tiến hành kiểm hoạt tính của cao mẫu
Tiến hành thực hiện thí nghiệm như bảng 4.


Ống nghiệm

Blank

Cao

Cao

Cao

Cao

cồn

nước

cồn

nước

rau

rau

rau

rau

râm

râm

đắng

đắng

Buffer (ml)

1

(1)
1

(2)
1

(3)
1

(4)
1

Polyphenol

1

1

1

1

1

Tyrosin 1m

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

(ml)
Inhibitor (ml)

0

0.5

0.5

0.5

0.5

oxidase (ml)

Ủ 20 phút
Đun sôi các ống nghiệm để dừng phản ứng
Bảng 4. Số liệu chuẩn bị thí nghiệm kiểm tra hoạt tính ức chế emzyme polyphenol oxidase

Sau đó thêm vào ống blank 0.5 ml Inhibitor để cân bằng giữa các ống nghiệm.
2. Tiến hành đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính.
Tiến hành thực hiện thí nghiệm như bảng 5. Sau đó đo OD các ống nghiệm ở bước sóng
260 nm.
Ống nghiệm

Dung dịch sau

Blank

Cao

Cao

Cao

Cao

cồn

nước

cồn

nước

rau

rau

rau

rau

râm

râm

đắng

đắng

1

(1)
1

(2)
1

(3)
1

(4)
1

2

2

2

2

2

khi kiểm tra
hoạt tính (ml)
NaOH 0.5 N

(ml)
Bảng 5. Số liệu thí nghiệm đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt ức chế


IV. Kết quả và biện luận:
1. Điều chế cao mẫu thí nghiệm:

2. Xây dựng đường chuẩn:
- Sau khi đo có được kết quả như bảng 6.
Ống

0

1

2

3

4

5

nghiệm
OD260nm

0

0.184

0.327

0.428

0.863

1.042

Bảng 6. Kết quả đo OD của tyrosin 1nM ở bước sóng 260 nm

Hình
16.
nước
rau
raurâm
đắng
râm
Hình
17.
Cao

cồn
Hình15.
14.Cao
Caonước
cồnrau

- Xây dựng đường chuẩn theo bảng 6.


Hình 17. Đường chuẩn Tyrosin 1nM với OD 260nm

2. Kết quả đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính:

Hình 18. kết quả đo Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính

- Sau khi đo có được kết quả như bảng 7:


Ống nghiệm

OD260nm

Blank

2.294

Cao

Cao

Cao

Cao

cồn

nước

cồn

nước

rau

rau

rau

rau

râm

râm

đắng

đắng

(1)
1.904

(2)
1.330

(3)
2.113

(4)
1.655

Bảng 7. Kết quả đo OD của Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính
- Dựa vào phương trình đường tuyến tính đường chuẩn của Tyrosin 1nM với OD 260 nm ta
tính lượng tyrosin trong các ống nghiệm sau khi kiểm tra hoạt tính.:
Ống nghiệm

Lượng

Blank

3.360

Cao

Cao

Cao

Cao

cồn

nước

cồn

nước

rau

rau

rau

rau

râm

râm

đắng

đắng

(1)
2.789

(2)
1.948

(3)

3.095

(4)
2.424

Tyrosin
(ml)
Bảng 8. Lượng Tyrosin sau khi kiểm tra hoạt tính

- Lượng Tyrosin sẽ bị enzyme polyphenol osidase oxy hóa trở thành o-quinone. Do vậy
lượng tysosin trong mẫu cịn càng nhiều thì cho thấy tyrosin ít bị oxy hóa. Dựa vào kết
quả thấy được: Mẫu blank khơng có chất ức chế nhưng lượng tyrosin trong ống nghiệm là
3.360 ml cao hơn các lượng tyrosin có trong các ống nghi ệm có chất ức chế. Dựa trên kết
quả khảo sát trước khi thực hiện thí nghi ệm về hoạt tính ức chế enzyme polyphenol
osidase của rau đắng và rau râm.


- Do đó kết quả thí nghiệm có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố làm sai lệnh kết quả như:
+ Mẫu vật thí nghiệm khơng được tươi, khơng đạt chất lượng.
+ Điều kiện bảo quản mẫu cao không tốt.
+ Sai xót trong q trình thao tác thí nghiệm.
+ Sai trình tự khi thực hiện các bước thí nghiệm.
+Thực hiện sai phương pháp.
- Nhưng trên kết quả này có thể thấy được:
Hình
19.
Mẫu
táo ngâm
rau râm
+ Hoạt tính ức chế của cao cồn lớn hơn hoạt tính ức chế

của
caoMẫu
nước.
Hình
20.
táoLượng
ngâm
trongtrong
nướcnước
rau đắng
16
16 giờ
giờ

tyrosin trong ống cao cồn rau râm là 2.789 ml trong khi lượng tyrosin có trong ống cao

nước rau râm chỉ có 1.948ml. Kết quả so sánh của cao cồn và cao nước rau đắng cũng cho
ra kết luận tương tự.
+Hoạt tính ức chế của rau đắng cao hớn hoạt tính ức chế của rau râm. Lượng
tyrosin trong ống cao cồn rau đắng là 3.095 ml cao hơn lượng tyrosin có trong ống cao
cồn rau râm. Kết quả so sánh của cao nước rau đắng và cao nước rau râm cũng cho ra kết
quả tương tự.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1], [2], [3]
1. Gertzen R, Escobar M A, (2014), "Assays of Polyphenol Oxidase Activity in Walnut Leaf
Tissue", Bio-protocol, 4 (16), pp. e1213.


2. Kotagiri D, Chaitanya V, (2017), "Antimicrobial and Antioxidant Activities in the Root, Stem
and Leaf Extracts of Centella asiatica", advances in biotechnology & microbiology, 3 pp.

3. Peng X, Du C, Yu H, Zhao X, et al, (2019), "Purification and characterization of polyphenol
oxidase (PPO) from water yam (Dioscorea alata)", CyTA - Journal of Food, 17 (1), pp.
676-684.