Dịch chiết nang trứng chín thúc đẩy quá trình chín sinh lý và phát triển phôi heo trinh sản

DỊCH CHIẾT NANG TRỨNG CHÍN THÚC ĐẨY Q TRÌNH CHÍN
SINH LÝ VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI HEO TRINH SẢN
Nguyễn Bá Tư1
1. Viện Phát triển Ứng dụng. Email:
TÓM TẮT
Dịch chiết nang trứng chín có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của trứng heo in
vitro, khả năng kích hoạt trứng và phát triển phôi heo trinh sản. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy, sau 42 giờ nuôi cấy tỷ lệ trứng heo chín có sự khác biệt ý nghĩa trong tỷ lệ trứng chín
giữa mơi trường bổ sung dịch chiết nang trứng heo chín và dịch chiết nang trứng heo có kích
thước 4-6 mm (lần lượt là 87% và 62%). Ngồi ra, dịch chiết nang trứng chín đã giúp nâng
cao tỷ lệ trứng chín rất tốt từ 30% (nang kích thước 4-6 mm) lên 53% (nang trứng chín), đồng
thời kết quả đã giảm đáng kể tỷ lệ trứng xấu từ 24% (nang kích thước 4-6 mm) xuống 10%
(nang trứng chín). Tỷ lệ trứng kích hoạt thành cơng cũng như phát triển phôi heo trinh sản đến
giai đoạn phôi nang (blastocyst) đã làm rõ vai trò của dịch chiết nang trứng chín đến chất
lượng của phơi heo trinh sản. Trong đó, dịch chiết nang trứng chín đã giúp nâng cao tỷ lệ phơi
nang từ 37% (nang kích thước 4-6 mm) lên 71% (nang trứng chín). Kết quả này góp phần hồn
thiện quy trình ni chín trứng heo in vitro.
Từ khóa: Dịch chiết nang trứng heo; môi trường in vitro; nang trứng chín; phơi heo trinh sản
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch chiết nang trứng đã được chứng minh có các thành phần dinh dưỡng đặc biệt bao
gồm đầy đủ các yếu tố sinh trưởng, phát triển, vi khoáng, vitamin, hormone , vv, cung cấp cho
trứng phát triển theo từng giai đoạn từ GV đến giai đoạn chín sinh lý (Park và nnk., 2021). Hiện
nay, trong quy trình ni trứng heo in vitro, việc bổ sung dịch chiết nang trứng heo đã trở nên
thường quy và hầu hết các quy trình đều thống nhất lấy dịch chiết nang trứng có kích thước 46mm để bổ sung với hàm lượng 10% vào môi trường TCM199 đã giúp cải thiện chất lượng
trứng chín in vitro và phát triển phôi (Pawlak và nnk., 2018). Tuy nhiên, khi nang trứng đạt
kích thước 4-6mm thì trứng bên trong mới gần đạt kích thước tối đa, và thường sẽ phát triển rất
chậm ở giai đoạn này về kích thước mà chủ yếu phát triển về sinh lý giúp đến giai đoạn chuyển
từ giảm phân 1 sang giảm phân 2. Việc ức chế tạm thời quá trình phân chia nhân được đảm
nhiệm bởi hàm lượng cAMP vốn được tiết ra từ lớp tế bào Granulosa cells. Chính vì vậy, trong
ni cấy in vitro, nếu dùng dịch chiết nang trứng giai đoạn này sẽ có một phần hiện hữu hàm
lượng cAMP sẽ cản trở q trình chín sinh lý của trứng hoặc ít nhất sẽ kéo dài thời gian chín

của trứng hơn 38 giờ thậm chí hơn 42 giờ nuôi cấy (Pawlak và nnk., 2018). Thời gian ni cấy
càng kéo dài thì chất lượng trứng càng bị ảnh hưởng, quá trình già hóa càng nhanh, chất lượng
trứng chín càng kém (Pawlak và nnk., 2018). Thực tế cho thấy tỷ lệ trứng chín in vitro so với
chín in vivo chỉ đạt 60-70%, đặc biệt là tỷ lệ phát triển phôi thường chỉ đạt 35-40% đến giai
248


đoạn phơi nang (blastocyst), điều này được giải thích bắt nguồn chủ yếu từ q trình ni trứng
heo in vitro cịn rất xa so với q trình chín sinh lý bên trong nang trứng heo. Chính vì vậy, việc
thiết lập quy trình ni trứng heo in vitro sao cho có thành phần môi trường gần giống nhất với
môi trường in vivo sẽ đóng vai trị quyết định đến chín sinh lý của trứng heo, ảnh hưởng trực
tiếp đến phát triển phơi heo sau khi kích hoạt. Dựa trên sự khác biệt cơ bản về hàm lượng cAMP
giữa dịch chiết nang trứng có kích thước 4-6 mm và nang trứng chín, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu sự ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng lên khả năng chín sinh lý và phát triển của phôi
heo trinh sản.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Hóa chất, mơi trường sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp từ hãng Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO)
Buồng trứng heo được lấy từ lò mổ Tân Bình, Phường Tân Bình, Thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương.
2.2. Phương pháp
Ni trứng chín
Buồng trứng heo được thu từ lò mổ tại địa phương, được bảo quản trong dung dịch PBSPVA trong q trình vận chuyển về phịng thí nghiệm tái biệt hoá tế bào, Đại học Quốc tế, Đại
học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Phức hợp tế bào hạt và trứng được thu nhận bằng
phương pháp cắt các nang trứng có kích thước 4-6 mm. Trứng được lựa chọn có đủ lớp tế bào
hạt (cumulus) và kích thước như nhau trong tất cả các lô thí nghiệm và đối chứng.
Sử dụng mơi trường TCM 199 (Sigma Chemical Co., USA) bổ sung 10% dịch chiết nang
trứng, 10 IU/ml hCG (Human chorionic gonadotropin) để nuôi trứng. Chuyển 20-30 trứng (tuỳ
thí nghiệm) vào ni trong vi giọt lớn (floating drop) 500 µl/ giọt trong đĩa 60 mm phủ dầu ở
điều kiện 5% CO2 tại 38,5oC. Sau 38- 42 giờ ni cấy, trứng chín được loại bỏ tế bào hạt bởi

enzyme hyaluronidase qua mouth pipete, và ủ trở lại trong vịng 1 giờ để tiến hành các thí
nghiệm tiếp theo (Lai và nnk., 2002).
Dịch chiết nang trứng được thu từ hai loại nang: 1/ Nang có kích thước 4-6 mm; 2/ nang
trứng đã chín
Trứng ni trong mơi trường TCM-199 và đánh giá sự ảnh hưởng của dịch chiết nang
trứng đến sự chín của trứng heo bao gồm: (1) thời gian, độ dãn nở của các lớp tế bào hạt
(cumulus cell layers), và (2) sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
Kích hoạt trứng trinh sản
Trứng sau khi ủ 2 giờ được kích hoạt bằng hệ thống điện trong mơi trường mannitol (0,3
mM mannitol, 0,1 mM MgSO4, 0,05 mM CaCl2 and 0,01% (w/v) PVA (Zimmermann &
Vienken, 1982). Khoảng 20 trứng được đặt trong đĩa kích hoạt với chương trình đã thiết lập
(100 V/cm (N = 2), 100 µs nhờ hệ thống dung hợp tế bào LF201 (Cell fusion – Nuclear
transplantation generator LF201), trứng sau khi kích hoạt được chuyển vào mơi trường ni
phơi (IVD, NCSU-23), theo dõi q trình phân cắt phôi trong 7 ngày đầu tiên
249


3. KẾT QUẢ
3.1. .Dịch chiết nang trứng có ảnh hưởng trực tiếp, quan trọng đến sự chín của trứng
heo in vitro
Bảng 1: Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng sự chín hình thái của trứng heo in vitro
Phương pháp
Dịch nang trứng chín

Số trứng nuôi cấy
250

Dịch nang trứng 4-6

273

a,b,

% trứng chín (MII)
144
(87.23 ± 6.96)a
242
(62.00 ± 16.81)b

Sự khác biệt với mức ý nghĩa: p <0.05

Hình 1. Trứng heo sau 42 giờ ni cấy (A. bổ sung dịch chiết nang trứng 4-6mm; B. bổ sung
dịch chiết nang trứng heo chín)
Bảng 2: Ảnh hưởng của các loại dịch chiết nang trứng đến chất lượng trứng heo chín in vitro
Phương pháp

Số trứng nuôi
cấy

Dịch nang
trứng 4-6

40

Dịch nang
trứng chín

30

a,b,c,

(%) trứng chín
% rất tốt
30.22
(± 5.20)a
53.00
(± 7.89)b

% tốt
22.34
(± 6.62)
26.86
(± 6.68)

% trung bình
22.53
(± 0.95)c
10.07
(± 1.01)d

Sự khác biệt với mức ý nghĩa,: p <0.05, c,d: p < 0.001.

Hình 2. Hình thái trứng heo chín in vitro
(A. trứng rất tốt; B. trứng tốt; C. Trứng trung bình; D trứng kém)
250

% kém
24.91
(±8.32)
10.07

(± 1.01)


Kết quả nuôi cấy trứng heo in vitro trong bảng 1 và hình 1 cho thấy có sự khác biệt đáng
kể giữa việc bổ sung hai loại dịch chiết nang trứng có kích thước khác nhau vào môi trường
nuôi cấy trứng (TCM-199). Trong đó, dịch chiết nang trứng chín giúp trứng heo đạt đến độ
trưởng thành về hình thái (bao gồm độ dãn nở của các lớp tế bào hạt- cumulus cell layers) và
sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (1st pB) là cao hơn (87%) so với trứng heo chín hình thái trong
mơi trường TCM-199 bổ sung dịch chiết nang trứng kích thước 4-6mm (62%). Tiếp tục so sánh
sâu hơn về chất lượng trứng heo chín, các kết quả từ bảng 2 và hình 2 chỉ ra sự khác biệt đáng
kể giữa 2 nghiêm thức, đặc biệt, dịch chiết nang trứng chín giúp thu được tỷ lệ trứng heo chín
rất tốt (53%) và trứng tốt (26%) cao hơn đáng kể so với trứng nuôi trong dịch chiết 4-6mm (lần
lượt là 30% và 22 %, p<0.05). Đặc biệt, dịch chiết nang trứng chín giúp giảm đáng kể tỷ lệ
trứng chất lượng trung bình và trứng kém (10% và 10%) so với đối trứng (22% và 24%).
3.2. Dịch chiết nang trứng heo chín giúp gia tăng khả năng tự kích hoạt trứng heo
trinh sản
Bảng 3. Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng heo đến sự kích hoạt trinh sản

a,b

Phương pháp

Số trứng nuôi cấy (n)

Dịch nang trứng 4-6

35

Dịch nang trứng chín

35

% trứng kích hoạt thành công (FPN)
25
(71.96 ± 7.07)a
32
(91.88 ±8.34)b

Sự khác biệt với mức ý nghĩa: p <0.05

Kích hoạt thành cơng là điều kiện tiên quyết cho sự phát
triển phôi và hậu phôi, các trứng rất tốt được đem kích hoạt và
theo dõi sự hình thành tiền nhân cái (female pro-nuclear, FPN).
Các kết quả ở bảng 3 và hình 3 cho thấy sự khác biết ở mức
thống kê, trong đó, dịch chiết nang trứng chín giúp nâng cao
hiệu quả kích hoạt trứng heo trinh sản (91%) so với dịch chiết
nang trứng 4-6 mm (71%), điều này như một bằng chứng rất rõ
ràng là dịch chiết nang trứng heo chín đã góp phần quan trọng Hình 3. Sự hình thành tiền nhân
nâng cao chất lượng trứng heo chín in vitro.
cái (female pro-nuclear-FPN)
3.3. Dịch chiết nang trứng heo chín ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành phơi
nang in vitro
Bảng 4. Ảnh hưởng của dịch chiết nang trứng đên sự phát triển của phôi heo trinh sản in vitro
(%) Phôi phát triển
Phương pháp
Dịch nang
trứng 4-6
Dịch nang
trứng chín
a,b,c,d,e,f

Số
trứng
nuôi
cấy
41
39

(%) phôi 2
TB

(%) phôi 4
TB

(%) Phôi 8 TB

(%) Phôi dâu
(morula)

(%) hôi nang
(blastocyst)

79.37
(± 9.84)
89.62
(± 4.50)

74.96
(±11.73)
87.06

(± 8.86)

50.23
(± 19.06)a
73.99
(±5.49)b

41.33
(±13.02)c
73.99
(± 5.49)d

37.63
(±7.26)e
71.76
(± 2.21)f

Sự khác biệt với mức ý nghĩa:: a,b,c,d,e,f: p <0.05
251


Trứng heo sau khi được kích hoạt được tiếp
tục chuyển qua môi trường nuôi phôi NCSU-23,
sự phân cắt phôi được theo dõi sau 24hrs, 48hrs,
72hrs, 96hrs, 120hrs, và 142hrs nuôi cấy, các số
liệu được ghi nhận trong bảng 4 cho thấy sự khác
biệt đáng kể về tỷ lệ và tốc độ phân cắt phôi giữa
2 nghiệm thức. Trong đó, sự khác biệt lớn nhất bắt
đầu xảy ra ở giai đoạn phôi 8 tế bào (73% đối với
nghiệm thức dịch nang trứng chín, và 50% đối với

dịch chiết nang trứng 4-6 mm), tiếp tục quan sát
sau 120 giờ và 142 giờ nuôi cấy chúng tôi ghi nhận
sự khác biệt rất đáng kể trong sự hình thành phơi Hình 4. Các giai đoạn phát triển của phôi
heo trinh sản in vitro
dâu (73% và 41%) và phôi nang (71% và 37%).
Trứng heo sau khi được kích hoạt được tiếp tục chuyển qua mơi trường nuôi phôi NCSU23, sự phân cắt phôi được theo dõi sau 24hrs, 48hrs, 72hrs, 96hrs, 120hrs, và 142hrs nuôi cấy,
các số liệu được ghi nhận trong bảng 4 cho thấy sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ và tốc độ phân
cắt phôi giữa 2 nghiệm thức. Trong đó, sự khác biệt lớn nhất bắt đầu xảy ra ở giai đoạn phôi 8
tế bào (73% đối với nghiệm thức dịch nang trứng chín, và 50% đối với dịch chiết nang trứng
4-6 mm), tiếp tục quan sát sau 120 giờ và 142 giờ nuôi cấy chúng tôi ghi nhận sự khác biệt rất
đáng kể trong sự hình thành phơi dâu (73% và 41%) và phôi nang (71% và 37%).
4. THẢO LUẬN
Dịch chiết nang trứng heo được bổ sung vào môi trường nuôi trứng heo in vitro hiện nay đã
trở thành quy trình phổ biến tại hầu hết các phịng thí nghiệm cả Việt nam và trên thế giới. Nhiều
cơng trình đã chứng minh dịch chiết nang trứng heo có ảnh hưởng rõ nét đến chất lượng trứng chín
in vitro (Kim và nnk., 1996; Da Broi và nnk., 2018). Điều này đã được giải thích khi phân tích các
yếu tố tự nhiên bên trong dịch chiết nang trứng mà môi trường nhân tạo chưa thể thiết lập được như
quy trình tự nhiên, bao gồm các yếu tố phát triển như hormones; growth factors of the Transforming
Growth Factor-beta (TGF-beta); interleukins; Reactive Oxygen Species (ROS); Glutathion (GSH);
yếu tố chống lại sự chết theo chương trình (anti-apoptotic factors); các proteins, peptides và aminoacids; đường; prostanoids(Revelli và nnk., 2009). Điều này đã giúp giải thích lý do việc bổ sung
dịch chiết nang trứng là đặc biệt cần thiết trong quá trình thiết lập quy trình nuôi trứng heo in vitro.
Tuy nhiên, một đặc điểm rất quan trọng là các giai đoạn phát triển của nang trứng khác
nhau lại có các thành phần hóa học rất khác nhau và nó ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển phôi
và thai đã được chứng minh ở Lạc đà (El-Shahat và nnk., 2018); Heo (Ducolomb và nnk., 2013).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 loại dịch chiết thu từ nang trứng heo có kích thước
khác nhau, bao gồm dịch chiết nang trứng kích thước 4-6 mm và dịch chiết nang trứng chín sinh
lý. Các kết quả từ các bảng 1 và 2 cho thấy dịch chiết nang trứng chín có ảnh hưởng rất rõ nét
đên sự phát triển của trứng (độ dãn nở của lớp tế bào cumulus cell, sự hình thành thể cực thứ nhất,
chất lượng trứng chín). Thực tế hiện nay, rất ít các phịng thí nghiệm chú ý đến kích thước của
nang trứng có ảnh hưởng hay khơng đến chất lượng trứng chín, mà hấu hết đều chỉ thu dịch chiết

nang trứng 4-6 mm và mặc định sẽ bổ sung 10% vào môi trường TCM-199 (Azari-Dolatabad và
252


nnk., 2021). Tuy nhiên, vấn đề ở chỗ, đối với trứng heo ở giai đoạn khi nang trứng có kích thước
4-6 mm thường là ở giai đoạn GV-3,4 và ở giai đoạn này trong dịch chiết nang trứng sẽ có một
lượng chất cAMP đóng vai trò ức chế sự phân chia nhân giúp trứng bên trong nang trứng sẽ có
đủ thời gian phát triển chất lượng cho tế bào chất góp phần quan trọng trong sự chín sinh lý của
trứng (Suzuki và nnk.,1986). Chính vì vậy, một giả thuyết đặt ra là nếu lượng cAMP vẫn tồn tại
bên trong dịch chiết nang trứng thì khi bổ sung vào mơi trường ni cấy liên tục 42 hrs thì sẽ ảnh
hưởng khơng tốt đến sự chuyển tiếp giai đoạn từ giảm phân I sang giảm phân II. Chỉ khi cAMP
bị ức chế thì trứng mới có thể chuyển tiếp từ giai đoạn giảm phân I sang giảm phân II và chín tại
kỳ giữa giảm phân II. Điều này tạo ra mối liên hệ giữa dịch chiết nang trứng chín với hàm lượng
cAMP, chúng tôi muốn chứng minh điều này, và, các kết quả nghiên cứu đã giúp làm sáng tỏ ý
tưởng trên. Rõ ràng, dịch chiết nang trứng chín giúp thúc đẩy bao gồm cả q trình chín trứng
heo in vitro, khả năng tự kích hoạt, sự phát triển phơi heo đến giai đoạn phôi nang. Các kết quả
từ nghiên cứu này đã góp phần quan trọng cho việc thiết lập quy trình ni cấy trứng heo in vitro.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo đề tài
mã số ĐL.CN-49/16, và Đại học Quốc gia TP HCM (VNU-HCM) theo đề tài mã số B2016-28-01.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1

Azari-Dolatabad, N., et al. (2021). Follicular fluid during individual oocyte maturation enhances
cumulus expansion and improves embryo development and quality in a dose-specific manner.
Theriogenology, 166, 38-45. />2 Da Broi, M., et al. (2018). Influence of follicular fluid and cumulus cells on oocyte quality: clinical
implications. Journal of assisted reproduction and genetics 35(5): 735-751.
/>3 Ducolomb, Y., et al. (2013). Effect of porcine follicular fluid proteins and peptides on oocyte
maturation and their subsequent effect on in vitro fertilization. Theriogenology 79(6): 896-904.
/>4 El-Shahat, K., et al. (2018). Follicular fluid composition in relation to follicular size in pregnant and
non-pregnant dromedary camels (Camelus dromedaries). Animal Reproduction (AR) 10(1): 16-23.

/>5 Kim, K., et al. (1996). The effects of follicular fluid on in vitro maturation, oocyte fertilization and
the development of bovine embryos. Theriogenology 45(4): 787-799. />6 Lai, L., et al. (2002). Production of α-1, 3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer
cloning. Science 295(5557): 1089-1092. />7 Park, J.-E., et al. (2021). Porcine follicular fluid derived from> 8 mm sized follicles improves oocyte
maturation and embryo development during in vitro maturation of pigs. Zygote 29(1): 27-32.
/>8 Pawlak, P., et al. (2018). The consequences of porcine IVM medium supplementation with follicular
fluid become reflected in embryo quality, yield and gene expression patterns. Scientific reports 8(1):
1-12. />9 Revelli, A., et al. (2009). Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to
metabolomics. Reproductive biology and endocrinology 7(1): 1-13. />10 Suzuki, S., et al. (1986). Cooperative inhibitory effect of follicular fluid and cAMP on hamster
oocyte maturation. Experientia 42(7): 795-798. />
253